用于检测人ugt1a1基因多态性的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法

用于检测人ugt1a1基因多态性的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法
【专利摘要】本发明提供用于检测UGT1A1基因*6型与*28型两个位点核苷酸多态性的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法，根据“等位基因特异PCR”原理，在实时荧光定量PCR技术平台上检测亚甲基四氢叶酸还原酶UGT1A1基因*6型与*28型两个多态性位点的核苷酸类型。
【专利说明】用于检测人UGT1A1基因多态性的引物、探针、荧光PCR试剂 盒和方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于UGTlAl基因*6型与*28 型两个位点核苷酸多态性检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法。

【背景技术】
[0002] 尿苷二磷酸葡萄糖醛酰转移酶(UGTs)是一大类能催化葡萄糖醛酸与亲核底物结合 的膜结合酶，主要存在于肝脏和肝外组织内质网。UGT分为两个家族，已经发现有17种人类 的基因编码不同序列的UGT。酶的表达具有明显的组织特异性，主要在肝脏中表达，其他组织 包括脑、肾、胃肠道等。UDP-葡萄糖醛基转移酶IAl(简称UGT1A1)，参与多种物质的葡萄糖醛 基化，这一结合反应的目的在于增加底物的水溶性，增加从胆汁和尿液中的排泄量，达到物质 代谢、解毒的目的。UGTlAl基因有30多个等位基因，其中一些SNP可影响酶的功能和分步。
[0003] 伊利替康是（Irenotecan，CPT-Il)是喜树碱半合成衍生物，在体内经羟酸酯酶水 解成7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38)，SN-38是DNA拓扑异构酶I的抑制剂，作用于细胞 周期S期，抑制、干扰DNA修复和转录。伊利替康自用于临床后，一直是治疗直结肠癌最有 效的化疗药物之一。但在临床使用中，也发现伊利替康会导致严重的血液毒性和消化道毒 性，表现为腹泻和中性粒细胞减少，发生率可达30%和50%，严重时会导致死亡。
[0004] 临床研究研究表明UGT1A1*6型和*28型与伊利替康引发的副反应有着强相关性， 且种族差异。在高加索患者中，UGT1A1*28纯和子（TA7/7)和杂合子（TA6/7)显著增加患者 发生严重粒细胞减少和腹泻的风险。而在亚洲患者中，UGT1A1*6型突变显著增加患者发生 3~4级中性粒细胞减少、血小板减少及腹泻的风险。
[0005] UGT1A1*6型的多态性表现为c. 211G>A。亚洲人群中，A/G和A/A携带者在伊利替 康治疗中，发生3~4级中性粒细胞减少和非血液学毒性的风险显著提高，UGT1A1*6型突变 在亚洲人群中的携带比例高达13?23%。UGT1A1*28多态性是指UGTlAl基因启动子区TA碱 基重复序列的多态性，正常野生型为6个TA重复序列（TA6)，而*28型则含7个TA重复序 列（TA7)，根据TA重复序列的多少，可以分为*1/*1、*1/*28和*28/*28。UGT1A1*28纯合突 变型在非洲人和高加索人中频率较高达到12?27%和5?15%，在亚洲人中，仅为1. 2?5%。
[0006] 对UGTlAl多态性基因型进行分析，大多采用PCR-RFLP、DNA直接测序法，荧光PCR 法，HRM法和毛细管电泳法。由于PCR-RFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因， 往往出现结果误判现象，影响其检测准确率，另外其检测周期长、通量较低，亦不适用于大 量人群的快速筛选。另外，作为基因检测金标准的DNA直接测序法，由于其需要昂贵的仪器 设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点，难以实现大规模推广。其他方法也存在特 异性不高，检测周期长等缺点。


【发明内容】

[0007] 本发明针对现有技术检测UGTlAl基因多态性时价格昂贵、周期长、低效率、数据 分析繁琐等不足，提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的UGTlAl基因多态性检测的 引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，用于检测人UGT1A1*6型c. 221位点（G/A)多态性和 *28型启动子（TA6/7)多态性，本发明快速、成本低，具有广泛推广价值。
[0008] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是： 一种用于检测人UGTlAl基因多态性的检测引物及其相应探针，根据UGTlAl基因 c. 221 位点（G/A)多态性设计，序列如下所示： 反向引物： UGTlAl *6G: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC -3'（ SEQ ID No. 1); UGTlAl *6A: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT-3'（ SEQ ID Νο·2); 正向引物： UGTlAl *6F: 5' - ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3'（ SEQ ID Νο·3); 荧光探针： TM-UGT1A1*6: 5' 荧光基团-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT -3' 淬灭基团（SEQ ID No. 4)。
[0009] 本发明还提供了一种用于检测UGTlAl基因多态性的检测引物及其相应探针，根 据UGTlAl基因*28型（TA6/7)多态性设计，序列如下所示： 反向引物： UGTlAl *28TA6: 5' - TCTCCTACTTATATATATATATATGGCA -3'（ SEQ ID Νο·5); UGTlAl *28TA7: 5'-TCTCCTACTTATATATATATATATATGGCA-3' （ SEQ ID Νο·6); 正向引物： UGTlAl *28F: 5' -GCTCCACCTTCTTTATCTCTG -3' （ SEQ ID Νο·7); 荧光探针： TM-UGT1A1*28: 5' 荧光基团-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC -3' 淬灭基团（SEQ ID No. 8)。
[0010] 本发明还提供了一种用于检测人UGTlAl基因多态性的内控引物对及相应荧光 探针，序列如下所示： 内控引物对： 正向引物：GAPDH F: 5' -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3'（ SEQ ID Νο·9); 反向引物：GAPDH R: 5' -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3'（ SEQ ID No. 10); 内控荧光探针： TM-GAPDH: 5' 荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3' 淬灭基团（SEQ ID No. 11)。
[0011] 上述检测人UGT1A1*6基因 C. 221位点（G/A)多态性的探针、检测人UGT1A1*28基 因多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针5'端的荧光基团为适用于荧光PCR定量分 析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或R0X，3'端的淬灭基团为适用于 荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或 TAMRA，更优选的方案为检测荧光探针的5'端连有的荧光基团为FAM，3'端连有的淬灭基团 为BHQl ;内控荧光探针的5'端连有的荧光基团为Hex，3'端连有的淬灭基团为BHQl。
[0012] 本发明还提供了一种用于检测人UGTlAl基因多态性的荧光PCR试剂盒，包括本发 明所述检测人UGTlAl基因 c. 221位点（G/A)多态性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多态 性的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的说，包括检测人UGTlAl基因 c. 221 位点（G/A)多态性的两种特异性反应液：UGT1A1 *6G PCR反应液与UGTlAl *6A PCR反应 液，和/或检测人UGTlAl基因 *28型TA6/7多态性的两种特异性反应液：UGT1A1 *28TA6 PCR反应液与UGTlAl *28TA7 PCR反应液；其中PCR反应液包含了 PCR反应必须的缓冲液、 镁离子、dNTP等物质外，还对应的包含上述检测引物与探针。上述各特异性检测的PCR反 应液分别包含的引物与探针的序列如下： (1) UGTlAl *6G PCR 反应液 UGTlAl 祁G: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC -3' ； UGTlAl *6F: 5' - ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3' TM-UGT1A1 *6: 5' 荧光基团-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT -3' 淬灭基团 (2) UGTlAl *6A PCR 反应液 UGTlAl 祁A: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT -3' ； UGTlAl *6F: 5' - ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3' TM-UGT1A1 *6: 5' 荧光基团-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT -3' 淬灭基团 (3) UGTlAl *28TA6 PCR 反应液 UGTlAl *28TA6: 5' -TCTCCTACTTATATATATATATATGGCA -3' ； UGTlAl *28F: 5' -GCTCCACCTTCTTTATCTCTG -3' TM-UGT1A1 *28: 5' 荧光基团-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC -3' 淬灭基团 (4) UGTlAl *28TA7 PCR 反应液 UGTlAl *28TA7: 5' -TCTCCTACTTATATATATATATATATGGCA -3' ； UGTlAl *28F: 5' -GCTCCACCTTCTTTATCTCTG -3' TM-UGT1A1 *28: 5' 荧光基团-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC -3' 淬灭基团 上述试剂盒的PCR反应液优选方案中，除了包括检测人UGTlAl基因 c. 221位点（C/T) 多态性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多态性的检测引物和相应的荧光探针外，还包括 一对内控引物及相应荧光探针，内控引物和探针的序列如下： 内控引物： GAPDH F: 5, -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3' GAPDH R: 5' -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3' 内控荧光探针： TM-GAPDH: 5' 荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3' 淬灭基团。
[0013] 上述试剂盒中检测人UGTlAl基因 c. 221位点（G/A)多态性的探针、检测人UGTlAl 基因*28型TA6/7多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针5'端的荧光基团可以为适 用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或R0X，3'端 的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -UBHQ -2、 Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测荧光探针的5'端连有的荧光基团为FAM， 3'端连有的淬灭基团为BHQl ;内控荧光探针的5'端连有的荧光基团为HEX，3'端连有的淬 灭基团为BHQl。
[0014] 上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述，优选的PCR扩增条件为：预变 性的条件为：温度为95°C，时间为3分钟； PCR反应由第一阶段和第二阶段构成： 第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为： 变性：温度为95°C，时间为30秒； 退火：起始温度为58°C，时间为30秒； 延伸：温度为62°C，时间为30秒； 第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为： 变性：温度为95°C，时间为30秒； 退火：温度为58°C，时间为30秒；（设置荧光信号采集） 延伸：温度为62°C，时间为45秒。
[0015] 本发明还提供了一种利用上述检测引物和荧光探针或者上述含有的检测UGTlAl 基因多态性的荧光PCR试剂盒进行UGTlAl基因多态性检测的方法，步骤包括： (1)待测样品处理和模板提取 a. 从待检测者抽取血液样本； b. 从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA ; c. 测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于lOng/μΙ ;0D260nm/0D280nm=l. 7?2. 0。
[0016] (2)荧光 PCR 扩增： 将待检测模板DNA与一定量的Taq DNA聚合酶加入含有本发明所述检测人UGTlAl基 因 c. 221位点（G/A)多态性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多态性的检测引物和相应 的荧光探针PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器按照特 定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，优选将待检测模板DNA与一定量的Taq DNA 聚合酶加入含有内控引物及相应荧光探针的上述试剂盒优选方案的PCR反应液内，在荧光 PCR管内混合均匀离心后放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行 PCR反应，用以监测反应有效性。
[0017] 上述荧光PCR扩增方案优选采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应： 预变性的条件为：温度为95°C，时间为3分钟； PCR反应由第一阶段和第二阶段构成： 第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为： 变性：温度为95°C，时间为30秒； 退火：起始温度为58°C，时间为30秒； 延伸：温度为62°C，时间为30秒； 第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为： 变性：温度为95°C，时间为30秒； 退火：温度为58°C，时间为30秒；（设置荧光信号采集） 延伸：温度为62°C，时间为30秒。
[0018] (3)分析结果 在上述UGT1A1*6型c. 221 G和c. 221A PCR反应体系与温度循环程序条件下，观察特 异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增"S"型曲线，则该待检DNA样本 为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。
[0019] 在上述UGT1A1*28型TA6和TA7 PCR反应体系与温度循环程序条件下，观察特异 性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增"S"型曲线，并且目的检测荧光信 号的Ct值与内参荧光信号的Ct值得差值小于预设值4,则该待检DNA样本为该特异性反 应体系所代表的多态性类型的阳性。
[0020] 本发明还提供了一种检测人UGTlAl基因 C. 221位点（G/A)多态性和/或人UGTlAl 基因*28型TA6/7多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针在检测人 UGTlAl基因多态性中的应用。
[0021] 本发明还提供了一种含有检测人UGTlAl基因 c. 221位点（G/A)多态性和/或人 UGTlAl基因*28型TA6/7多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针的 试剂盒在检测人UGTlAl基因多态性中的应用。
[0022] 本发明所述技术方案中的有关内容解释如下。
[0023] 1.本发明工作原理是：等位基因特异PCR (Allele Specific PCR，ASPCR)，又称 为等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification, ASA)或者扩增受阻突变系统 (Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，其基本原理是由于 Taq DNA 聚 合酶缺少3' 一 5'外切酶活性，在进行PCR反应时，若引物3'端形成错配，链延伸反应就会 因为3'，5'-磷酸二酯键形成的障碍而受阻，导致PCR产物量急剧减少，在一定扩增循环内， 不会检测出特异的扩增产物；反之，3'端配对则能够检测出扩增产物。于是，针对已知的多 态性位点，将其多态性碱基设计于检测引物的3'端，扩增反应后，通过凝胶电泳观察产物的 有无即可判断多态性位点的碱基类型。
[0024] 突光定量 PCR 是（Real-time PCR)是 1996 年由美国 Applied Biosystems 公 司推出的一种新定量实验技术，在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光 探针，该探针被称"TaqMan探"，为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭 荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合 在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5' 一 3'外切酶活性将探针酶切降解，使报 告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
[0025] 通过基于荧光探针的实时荧光PCR技术检测"等位基因特异PCR"反应体系的产 物，根据形成扩增曲线的荧光信号在特定阈值时循环数（Ct值)的大小可判断相应检测体系 内模板相应目的位点的碱基类型。
[0026] 2.本发明所述技术方案中的引物和探针的设计：根据美国国立生物技术信息中 心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的UGTlAl基因的参考序列（NG_009254)以及 dbSNP数据库公开的c. 221位点（G/A)多态性（SNP ID :rs4148323)与*28型TA6/7多态 性（SNP ID :rs34983651)的信息，采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计 检测UGTlAl基因 c. 221位点（G/A)多态性与*28型TA6/7多态性的引物与探针。为了监 测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控弓丨物与探针，本发明选取人类保守基因 GAPDH 的一段序列（其GeneBank参考序列编号为：NG_007073. 2)，米用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测引物及探针。
[0027] 本发明所述技术方案中，所述引物（primer)是指由一定数量的dNTP构成的寡核 苷酸序列，通常由DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯 化。在聚合酶链式反应中，引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合，其功能是作 为核苷酸聚合作用的起始点，在引物的3' -OH上，核苷酸以二酯键形式进行合成，因此引物 的3' -OH必须是游离的。DNA聚合酶可由其3'端开始进行延伸，合成新的核酸链。
[0028] 本发明所述技术方案中，所述荧光探针是一种寡聚核苷酸探针，荧光基团连接在 探针的5'末端，而淬灭基团则在3'末端，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰 胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。目前常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX，ROX等。淬 灭基团有 BHQ -UBHQ -2、Dabcyl、Eclipse、TAMRA 等。
[0029] 3.本发明所述技术方案中，所述的内控引物及其相应的探针可以用来监测反应有 效性的指标，用以判断是否存在模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果的情 况。正常情况下，PCR正常扩增会形成的指数级扩增曲线，形象的描述为"S"型扩增曲线， 表明体系正常扩增。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号形成对数扩增"S"型曲 线时，为多态性类型的阳性结果，也说明PCR体系扩增正常，无需采用内控引物及其相应的 探针进行结果的验证。然而，当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增 "S"型曲线，检测结果为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阴性结果，但也有可能是 模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果，这种情况下，可以采用内控引物及 其相应的探针进行排除。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增"S" 型曲线，而内控信号形成正常对数扩增"S"型曲线时，可以验证多态性类型的阴性结果的准 确性。而当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增"S"型曲线，且内控 信号也未形成正常对数扩增"S"型曲线时，则说明实验条件或仪器上出现问题影响试验结 果，而非多态性类型的阴性结果。 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果： 1.本发明技术方案中的检测人UGTlAl基因 c. 221位点（G/A)多态性和/或人UGTlAl 基因*28型TA6/7多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针，其PCR 检测特异性非常高，并且采用实时荧光PCR技术，检测结果判读容易。
[0030] 2、本发明技术方案中的检测引物与探针价格低廉，而且在实验过程中不需测序， 在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率。
[0031] 3、本发明技术方案中的检测引物与探针，采用实时荧光PCR技术平台，可实现高 通量检测。

【专利附图】

【附图说明】
[0032] 附图1为某样本UGTlAl基因 c. 221位点（*6)试剂盒检测图 附图2为某样本UGTlAl基因 c. 221位点测序图 附图3为某样本UGTlAl基因 *28型位点试剂盒检测图 附图4为某样本UGTlAl基因 *28型位点测序图

【具体实施方式】 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的 含义。
[0033] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只 是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0034] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，通 常米用常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的 荧光定量PCR仪型号为ABI 7500或BioRad CFX96。
[0035] 实施例1.引物和探针的设计： 根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的UGTlAl 基因的参考序列（NG_009254)以及dbSNP数据库公开的c. 221位点（G/A)多态性 (rs4148323)与UGTlAl基因*28型TA6/7多态性（rs34983651)的信息，采用ABI公司 的Primer Express 3. 0软件分别设计检测UGTlAl基因 c. 221位点（G/A)多态性与28型 TA6/7多态性的引物与探针，具体如下： 检测UGTlAl基因*6型c. 221位点（G/A)多态性引物及探针的序列如下所示： 反向引物： UGTlAl 祁G: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC -3' ； UGTlAl 祁A: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT -3' ； 正向引物： UGTlAl *6F: 5' - ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3' 荧光探针： TM-UGT1A1*6: 5' FAM - CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT -3' BHQ1。
[0036] 检测UGTlAl基因*28型TA6/7多态性引物及探针的序列如下所示： 反向引物： UGTlAl *28TA6: 5' - TCTCCTACTTATATATATATATATGGCA -3' ； UGTlAl *28TA7: 5' - TCTCCTACTTATATATATATATATATGGCA -3' ； 正向引物： UGTlAl *28F: 5' - GCTCCACCTTCTTTATCTCTG -3' ； 荧光探针： TM-UGT1A1 *28: 5' FAM -CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC -3'BHQ1。
[0037] 为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人 类保守基因 GAPDH的一段序列(其参考序列编号为：NG_007073. 2)，采用ABI公司的Primer Express 3. 0软件设计检测引物及探针，具体序列如下所示： 内控引物对： 正向引物：GAPDH F: 5' -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3' ； 反向引物：GAPDH R: 5' -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3' ； 内控荧光探针： TM-GAPDH: 5' Hex-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3' BHQ2。
[0038] 实施例2.引物的制备 将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供 合成检验合格报告。
[0039] 实施例3 :突光PCR检测人UGTlAl基因多态性的试剂盒的准备 制备检测人UGTlAl基因 c. 221位点（G/A)多态性的两种特异性反应液：UGT1A1 *6G PCR反应液与UGTlAl *6A PCR反应液；检测人UGTlAl基因 *28型TA6/7多态性的两种特异 性反应液；UGTlAl *28TA6 PCR反应液与UGTlAl *28TA7 PCR反应液；其中PCR反应液包 含了 PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还包含了检测引物与探针和内控引物 与探针。上述各特异性检测的PCR反应液组分浓度及包含的引物与探针的序列信息如下： 表I. PCR反应液组分

【权利要求】
1. 一种用于检测人UGT1A1基因多态性的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检 测引物及探针根据UGT1A1基因c. 221位点（G/A)多态性设计，序列如下所示： 反向引物： UGT1A1 *6G: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC -3' ； UGT1A1 *6A: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT -3' ； 正向引物： UGT1A1 *6F: 5' - ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3' 荧光探针： TM-UGT1A1 *6: 5' 荧光基团-CTAGCACCTGACGCCTCGITGT -3' 淬灭基团。
2. -种用于检测UGT1A1基因多态性的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检测 引物及探针根据UGT1A1基因*28型位点TA6/7多态性设计，序列如下所示： 反向引物： UGT1A1 *TA6: 5' - TCTCCTACTTATATATATATATATGGCA -3' ； UGT1A1 *TA7: 5' - TCTCCTACTTATATATATATATATATGGCA- 3' ； 正向引物： UGT1A1 *28F: 5' - GCTCCACCTTCTTTATCTCTG -3' ； 荧光探针： TM-UGT1A1*28: 5' 荧光基团-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC -3' 淬灭基团。
3. -种用于检测人UGT1A1基因多态性的内控引物对及相应荧光探针，其特征在于所 述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示： 内控引物对： 正向引物：GAPDH F: 5' -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3' ； 反向引物：GAPDH R: 5' -CITTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3' ； 内控荧光探针： TM-GAPDH: 5' 荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3' 淬灭基团。
4. 如权利要求1-3所述的引物对及相应荧光探针，其特征在于所述荧光探针5'端的荧 光基团为？41^￡1\￥1(：、冊乂或1?(?，3'端的淬灭基团为冊〇-1、8即-2、〇31^71、￡(311口86、 或 TAMRA。
5. -种用于检测人UGT1A1基因多态性的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要 求1所述的检测引物及其相应探针和/或括权利要求2所述的检测引物及其相应探针。
6. 如权利要求5所述的检测人UGT1A1基因多态性的试剂盒，其特征在于所述试剂盒 还包括如权利要求3所述内控引物对及相应荧光探针。
7. -种人UGT1A1基因多态性的检测方法，所述方法包括使用权利要求1和/或权利要 求2所述的引物及探针。
8. 如权利要求7所述的人UGT1A1基因多态性的检测方法，其特征在于所述方法还包括 使用权利要求3所述的引物及探针。
9. 一种人UGT1A1基因多态性的检测方法，所述方法包括使用权利要求5-6所述的试剂 盒。
10. 权利要求1-3所述的引物及探针在检测人UGT1A1基因多态性中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104388572SQ201410744876
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】王进, 吴梦华, 吴子侠, 何晓辉, 赵小龙, 彭飞 申请人:苏州旷远生物分子技术有限公司