用于检测scz相关基因多态性的引物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测SCZ相关基因多态性的引物及试剂盒，本发明基于AUTS2基因多态性位点与SCZ的相关性，设计了用于扩增包含AUTS2基因多态性位点的特异引物对，并提供了包含该引物对的检测用试剂盒，可用于SCZ的预防、辅助诊断和治疗，还可用于新药研发。
【专利说明】用于检测SCZ相关基因多态性的引物及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种预测精神分裂症易感性的试剂，更具体地说 是用于测定与精神分裂症的易感性相关的人AUTS2基因单核苷酸多态性的引物以及含有 该引物的试剂盒，可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发。
【背景技术】
[0002] 精神分裂症（SCZ)是一种复发率高、致残率高的慢性迁延性疾病，以基本个性改 变，思维、情感、行为的分裂，精神活动与环境不协调为主要特征，一般没有意识和智能障 碍，为一种功能性疾病。据世界卫生组织统计，全球精神分裂症的终身患病率约为3. 8%。? 8. 4%。，欧洲、美洲和东南亚地区的平均患病率分别为5. 0%。、4. 2%。和3. 7%。。我国的调查数 据显示，城市地区患病率为7%。，农村为4. 26%。。该病多起病于青壮年，患者劳动能力显著 丧失，给社会和家庭造成沉重的负担，并占用大量的医疗卫生资源，所造成的社会经济负担 居各种疾病的前列。
[0003] 目前，导致精神分裂症的确切病因尚不清楚。既往大量研究表明，精神分裂症在家 系研究、双生子研究中呈现高度遗传一致性，寄养子研究发现精神分裂症母亲所生子女从 小寄养在正常家庭中，成年后仍有较高的患病率。可见，遗传因素可能在精神分裂症的发病 中起着重要的作用。
[0004] 随着分子遗传学研究技术的进展，现已发现了许多跟精神分裂症相关的染色体区 域和候选基因。在人类孟德尔遗传数据库的数据中，通过连锁和关联研究定位的精神分 裂症易感位点所在的染色体有 5, Ilq，6p23,22qll，6q，8p22-p21，13q32,18p，lq42,15ql5， 10q22, lp，15ql3_ql4,2q32. I，22ql3. 3,7q36. 3,2ρ16· 3。相关的易感基因有 MTHFR(lp36)， NOSlAP (lq23)，RGS4 (lq23)，CHI3L1 (lq32)，DISCI (lq42)，NRXNl (2ρ16· 3)，ZNF804A (2q31)， ERBB4(2q33), SYN2 (3p25), ALS2CL (3p21), DRD3(3ql3), KPNAl (3q21), PMX2B(4pl3), SPATA5 (4q28), CLINTl (5q33), DRDl(5q35. I), DTNBPl (6p22.3), N0TCH4 (6p21), LAMA2(6q22)，ABCA13(7pl2.3)，TPHl(llpl5.3-pl4)，BDNF(llpl3)，AP0E(19ql3)等。 从目前的研究来看，SCZ的易感基因有很多，但是关于位于7号染色体的AUTS2基因 (NC_000007. 14)多态性与SCZ的关系未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供用于检测SCZ相关基因多态性的引物及试剂盒。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] 通过提取人基因组DNA，测定受试者的AUTS2基因内含子区（rs6943555)碱基多态 性位点的基因型，发现该多态性位点与受试者对精神分裂症的易感性密切相关：AUTS2基 因型为T/T纯合子时，受试者的易感性最低；AUTS2基因型为T/A杂合子时，受试者的易感 性较高；AUTS2基因型为A/A纯合子时，受试者的易感性最高。
[0008] 根据以上发现，本发明提供了一种分离核酸，具有SEQ. ID. NO. 1所示的碱基序列， 在第163位为T，该核酸序列为AUTS2基因内含子4部分序列。本发明提供了一对引物，分 别具有如SEQ. ID. NO. 2和SEQ. ID. NO. 3所示的碱基序列，长度分别为21和33bp，而且可以 特异性地扩增出含有SEQ. ID. NO. 1所示序列中第163位的SNP的扩增产物，所述的引物分 别为：
[0009] 上游引物 Fl :TGGGTGTTGGAAGAGTTTTGA (如 SEQ. ID. NO. 2 所示）；
[0010] 下游引物 Rl :ATACAGTATACATAAACATTGGAAAAGAGGGAA (如 SEQ. ID. NO. 3 所示）。
[0011] 本发明提供了一种检测SCZ易感性的诊断试剂盒，其中包含有引物Fl和Rl以及 用于PCR扩增检测的试剂盒的其他试剂、缓冲液等。检测扩增产物与SEQ. ID. NO. 1所示序 列第163位相比是否存在变异时，所需的化学试剂还包括限制性内切酶等。本发明试剂盒 中的全部组分、含量、来源如下：
[0012] 本发明试剂盒供10人份检测应用，其组分、含量和来源包括：
[0013] 125μ L 2XPCR MasterMix(RUNDE，主要组成：0· IU Taq Polymerase/μ L ;500μΜ dNTP each；20mM Tris-HCl(pH 8. 3) ；100mM KCL ；3mM MgCl2)；
[0014] 10 μ mol/ μ L Fl (SEQ. ID. NO. 2)和 10 μ mol/ μ L Rl (SEQ. ID. NO. 3)各 10 μ L ;
[0015] 1.5mL 纯水；
[0016] 20 μ L 10X限制性内切酶反应缓冲液（Fermentas);
[0017] 5 μ L(10unit/μ L)限制性内切酶 Hinfl (Fermentas)。
[0018] 试剂盒的保存温度为_20°C。
[0019] 试剂盒的使用方法如下：
[0020] 1)通过PCR扩增AUTS2基因的内含子4部分片段
[0021] 制备混合液：向PCR管中加入1 μ L提取自受测人的基因组DNA溶液（50ng/ μ L)、 12.5yL 2XPCR MasterMix、lyL FUlyL虹$1和1?1分别为有义引物和反义引物）， 接着，加入纯水，使总体积为25 μ L。PCR扩增的反应过程为：95°C 5分钟，进入循环程序 95°C 0. 5分钟，60°C 0. 5分钟，72°C 0. 5分钟，进行35个循环，最后72°C 7分钟。反应完成 后，将5 μ L反应产物在2 %的琼脂糖凝胶上电泳检测，如扩增了 196bp的片段，获得了单一 条带，即为扩增成功。
[0022] 2)通过用限制性内切酶处理PCR反应产物测定AUTS2基因的多态性。向10μ L上 述扩增成功的PCR反应产物中加入2 μ L 10Χ限制性内切酶反应缓冲液、0. 5 μ L限制性内 切酶Hinfl，纯水补足至20 μ L，37°C水浴中消化过夜。之后，在2. 5%的琼脂糖凝胶上电泳。
[0023] 3)多态性定型：用限制性内切酶Hinfl处理后，在第163位碱基是A等位基因时， 出现165bp和31bp(由于条带太小，检测不到）的条带。如为T等位基因时，仅出现196bp 一个条带。
[0024] 本发明可用于测定来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如体液（血液、腹水和 尿液）、组织细胞〔肝组织、皮肤组织，肌肉组织）、毛发等。通过提取和纯化这些样品可制备 基因组DNA。
[0025] 本发明的优点是：本发明利用首次阐明的AUTS2基因多态性位点与SCZ的相关性， 提供了一种基于PCR-RFLP检测SCZ易感性的引物和试剂盒，可用于SCZ的预防、辅助诊断 和治疗，还可以用于新药研发。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为经引物扩增后产物的酶切图谱；
[0027] 图 1 中：1、3、6、7、8、11 为 T/A 杂合型；2、10、12 为 A/A 纯合型；4、5、9 为 T/T 纯合 型；M表不marker。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，但并非对本发明的限制。
[0029] 1、血液样本收集和基因组DNA的提取
[0030] 按DSM-IV Axis I Disorders标准明确诊断入选病例，共计收集来自陕西省的无 亲缘关系SCZ患者410例，平均年龄35. 2岁±11. 4岁，其中男性204例，同地区的健康对 照志愿者435例，平均年龄37. 6岁±10. 8岁，其中男性192例。所有受检者均为汉族，且 签署知情同意书，这一研究也得到了本单位伦理委员会批准。
[0031] 根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA : (1)将ImL抗凝贮冻血液于室温解冻 后移入离心管中，加入ImL磷酸缓冲盐溶液（PBS)，混匀，12000rpm离心10min(4°C )，倾去 含裂解红细胞的上清。重复一次。用500 μ LDNA提取液混悬白细胞沉淀，37°C水浴温育lh。 ⑵将上述DNA提取液混悬白细胞，37°C水浴温育Ih后，加入10mg/mL蛋白酶K IOyUi 下转动混匀，液体变粘稠。56°C水浴过夜，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转 动几次，混匀反应液。（3)第二天，反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地 上下转动离心管lOmin，直至水相与酚相混匀成乳状液。12000rpm离心lOmin，用大口吸管 小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇 (24 :1)，上下转动混勻，12000rpm离心IOmin,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另 一离心管中。重复一次。（4)加0. 1倍体积的3mol/L醋酸钠 （pH 5. 2)和2倍体积的冷无 水乙醇，轻轻倒置混匀，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转 入另一 I. 5mL离心管中，加70%乙醇500 μ L，以12000rpm离心5min。洗漆DNA，弃上清，去 除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加水20yL溶解 DNA，置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12?24h。制成的DNA液-20°C冰箱保 存备用。
[0032] 2、AUTS2 基因 SNP 与 SCZ 的相关
[0033] 统计方法：利用SPSS 18. 0软件中Pearson卡方检验计算AUTS2基因多态性的等 位位点，基因型频率，Hardy-weinberg平衡检测，统计学的显著性水平设定为P〈0. 05。采用 单因素Logistic回归分析计算SCZ的患病风险OR值及其95%置信区间（Cl)。
[0034] 结果
[0035] 1)健康人AUTS2基因多态性分布
[0036] 测定了 435个健康人的基因多态性，发现225人有T的纯合子（51. 7%)，165人有 T和A的杂合子（37. 9%)，45人有AA的纯合子（10. 4%)。
[0037] 2)502病人八^^2基因多态性分布
[0038] 测定410个病人的基因多态性，发现171人有T的纯合子（41. 7%)，207人有T和 A的杂合子（50. 5 % )，32人有A的纯合子（7. 8 % )。
[0039] 3) SCZ病例和健康对照组比较
[0040] SCZ病例和健康对照组AUTS2基因上的rs6943555等位位点对为T/A多态性的频 率分布详见表1。
[0041] 表I AUTS2基因 rs6943555位点的基因型和等位基因频率风险性在SCZ和健康正 常人群中的比较
[0042]
【权利要求】
1. 用于检测SCZ相关基因多态性的引物，其特征在于：所述引物为两个，分别具有如 SEQ. ID. NO. 2和SEQ. ID. NO. 3所示的核苷酸序列。
2. 用于检测SCZ相关基因多态性的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括10 μ L10 μ mol/ 4 1^引物卩1、1(^1^1(^111〇1/^1^引物1?1、125 4 1^2\?〇?&18七6-1叉、2(^1^10\限制性内切酶 反应缓冲液以及5 μ LlOunit/μ L限制性内切酶Hinfl，所述F1具有如SEQ. ID. NO. 2所示的 核苷酸序列，R1具有如SEQ. ID. NO. 3所示的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述用于检测SCZ相关基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述试 剂盒供10人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
【文档编号】C12N15/11GK104293961SQ201410555737
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】马乐, 吴昌睿, 刘蓉, 韩悦, 王俐媛, 张强, 郭芳, 孙靓, 杨薇粒, 金犇 申请人:西安交通大学