嵌合hcv中和表位的hbv s抗原病毒样颗粒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于分子生物学和细胞生物学领域。该病毒样颗粒表面展示不同的HCV中和抗原表位，嵌合病毒样颗粒免疫小鼠后可产生HCV中和表位特异性的中和抗体。该方法将HCV中和抗原表位嵌合于HBV S抗原亲水区，不影响其自我包装，从而形成嵌合的病毒样颗粒，表达HCV中和抗原表位。制备得到的四种病毒样颗粒经化后免疫BLAB/c小鼠可诱导产生表位特异性的中和抗体，产生的中和抗体能抑制HCVpp和HCVcc感染Huh7.5细胞。制备的嵌合病毒样颗粒具有保护作用，能够成为一种较理想的HCV预防性/治疗性候选疫苗建立方法。
【专利说明】嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒及其制备方法 和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和细胞生物学领域，涉及一种嵌合HCV中和表位的HBV S 抗原病毒样颗粒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒（HCV)急性感染后易慢性化和发展成为肝硬化、肝细胞肿瘤或肝功 能衰竭。一直以来丙型肝炎的疫苗研制受到高度变异、缺乏细胞和小动物模型等多种原因 的限制而进展缓慢。HCV病毒中许多蛋白抗原（如核心蛋白、包膜蛋白和非结构蛋白）都 可诱导抗体产生。但在这些抗体中，只有针对包膜糖蛋白E1/E2的中和抗体具有保护作用。 近年来研究发现，HCV包膜糖蛋白E1/E2存在保守的中和性抗原表位，针对这些表位的单克 隆抗体具有广谱的交叉中和活性。以上研究结果使为中和表位疫苗的研究提供了依据。寻 求理想的载体，呈递和表达中和抗原表位，成为HCV中和表位疫苗研究的方法之一。
[0003] 病毒样颗粒（virus like particles, VLPs)是不含病毒颗粒，形态结构与天然病 毒颗粒相似的能自我装配的病毒空壳。许多病毒结构蛋白都具有自主组装成VLPs的能力。 由于VLPs不含病毒遗传物质，所以不具备感染性，而具有很强的免疫原性和生物学活性， 广泛应用于疫苗研究领域。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合体 VLPs并将外源性抗原展示在其表面，保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗 原表位，比亚单位疫苗和重组的蛋白疫苗具有更强的免疫原性，能够激发机体体液免疫、细 胞免疫及粘膜免疫。
[0004] HBV小包膜蛋白抗原（HBsAg-S)基因大小为681bp，在无核心蛋白和基因组参与下 有自我装配能力。其101?159位氨基酸区域为亲水区，形成的双环结构可表达外源性表 位蛋白，在哺乳动物细胞中形成与野生型病毒相似的VLPs，可分泌至细胞外。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒及其制备 方法和应用，该病毒样颗粒表面展示不同的HCV中和抗原表位，嵌合病毒样颗粒免疫小鼠 后可产生HCV中和表位特异性的中和抗体。该方法将HCV中和抗原表位嵌合于HBV S抗原 亲水区，不影响其自我包装，从而形成嵌合的病毒样颗粒，表达HCV中和抗原表位。
[0006] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0007] 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒，该病毒样颗粒是将HCV表位插入HBV S抗原亲水区构建真核表达载体，再经哺乳动物细胞体外装配制得；其中，所述的HCV表位 为氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?4中任意一项所示的表位肽。
[0008] 氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?3所示的表位为高度保守的中和表位；氨基酸序列 如SEQ. ID. NO. 4所示的表位为高变区的模拟表位。
[0009] 氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示的表位为HCV El区线性中和表位；氨基酸序列如 SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2所示的表位为HCV E2区线性中和表位；所述高变区的模拟表 位为HCV E2模拟表位。
[0010] 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒的制备方法，
[0011] 包括以下步骤：
[0012] 1)在HBV S基因亲水区引入Age I克隆位点
[0013] 将引入Age I克隆位点的全长S基因亚克隆至真核表达载体pCI-neo中，得到重 组真核表达载体PCI-HBS ;
[0014] 2)将HCV表位以引物合成的形式克隆入重组真核表达载体pCI-HBS中
[0015] 以 pCI-HBS 为模板，分别用 FElAge I/R2Xba I，FE2Age I/R2Xba I，FE3Age 1/ R2Xba I，FE4Age I/R2Xba I为引物，扩增得到引入不同表位的HBV S下游128-227位氨基 酸的碱基序列，扩增产物回收后连接入T-easy载体，分别得到T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3， T-HBSE4 ；
[0016] 3)构建嵌合HCV中和抗原表位真核载体
[0017] 将 T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3, T-HBSE4 分别用 Age I/Xba I 双酶切，克隆入 Age I/Xba I双酶切的pCI-HBS中，得到重组的嵌合HCV中和抗原表位的真核表达载体，分别为 pCI-HBSEl，pCI-HBSE2, pCI-HBSE3, pCI-HBSE4 ;
[0018] 4)病毒样颗粒的制备
[0019] 分别将 pCI-HBSEl、pCI-HBSE2、pCI-HBSE3 和 pCI-HBSE4 转染哺乳动物细胞，转染 48h后收集培养上清，定量测定HBsAg含量，得到四种不同的嵌合病毒样颗粒VLPs，分别命 名为 VLPs-SEl、VLPs-SE2、VLPs-SE3 和 VLPs-SE4。
[0020] 步骤2)所述的以引物合成的形式克隆HCV表位所用到的引物F1、R1、F2、R2、FE1、 FE2、FE3和FE4的核苷酸序列分别如SEQ. ID. NO :5?12所示。
[0021] 步骤4)所述的哺乳动物细胞为HEK293T、Hela或Huh7. 5细胞。
[0022] 步骤4)采用磷酸钙法或脂质体法转染哺乳动物细胞。
[0023] 步骤4)是采用罗氏E601电化学发光分析仪对HBsAg含量进行定量测定。
[0024] 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒在制备用于治疗HCV感染病症的疫苗 中的应用。
[0025] 所述的疫苗为抑制HCVpp和HCVcc感染Huh7. 5细胞的疫苗。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0027] 本发明将HCV中和抗原表位嵌合于HBV S抗原亲水区，不影响其自我包装，从而形 成嵌合的病毒样颗粒，表达HCV中和抗原表位。本发明制备得到四种HCV中和抗原表位 嵌合病毒样颗粒，能够在小鼠体内诱导出表位特异性中和抗体，血清中和抗体能抑制HCVpp 和HCVcc感染Huh7. 5细胞，嵌合病毒样颗粒表现出了良好的中和效应，具有保护作用。为 进一步设计中和抗体疫苗提供了新的技术方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为HCV中和抗原表位嵌合入HBV S抗原亲水区设计图；
[0029] 图2为嵌合HCV中和抗原表位真核表达载体构建琼脂糖电泳结果图；
[0030] 图3为嵌合HCV中和抗原表位的HBV S基因的表达分析间接免疫荧光结果图；
[0031] 图4为嵌合HCV中和抗原表位及HBV S基因的表达分析Western blot条带结果 图；
[0032] 图5为蔗糖密度梯度离心不同分离片段HBsAg定量分析图；
[0033] 图6为纯化嵌合病毒样颗粒电镜分析结果图；其中，A:VLPs-SEl ;B:VLPs-SE2 ; C:VLPs-SE3 ；D:VLPs-SE4 ；
[0034] 图7为纯化嵌合病毒样颗粒定量分析图；
[0035] 图8为纯化嵌合病毒样颗粒免疫BALB/c小鼠中和抗体测定图谱；
[0036] 图9为小鼠血清中和抗体抑制HCVpp感染Huh7. 5细胞分析图；
[0037] 其中，A :为VLPs-SEl免疫小鼠血清对三种HCVpp的感染抑制作用结果分析图； B-D分别为VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SEl免疫小鼠血清对三种HCVpp的感染抑制作用结 果分析图；E为四种混合VLPs免疫小鼠血清对HCVpp的感染抑制作用结果分析图；F为佐剂 对照免疫小鼠血清，对三种HCVpp均无感染抑制作用结果分析图。
[0038] 图10为小鼠血清中和抗体抑制HCVcc感染Huh7. 5细胞分析图；
[0039] 图11为HCV阳性患者体内中和抗体的ELISA测定图。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0041] 本发明的技术方案如下：
[0042] 1.丙型肝炎病毒的保守的中和抗原表位选择、表达载体的构建和表达分析。
[0043] 2.嵌合病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定。
[0044] 3.嵌合VLPs免疫BALB/c小鼠，测定小鼠体内诱导出的HCV中和表位特异性中和 抗体水平。
[0045] 4.免疫小鼠血清中和抗体HCVpp和HCVcc感染Huh7. 5细胞分析。
[0046] 本发明选择HCV保守的中和表位和HVR的模拟表位，将表位分别插入HBV S抗原 亲水区（127-128位氨基酸间），嵌合基因克隆如真核表达载体pCI-neo中，转染哺乳动物细 胞包装嵌合病毒样颗粒（VLPs)并进行纯化和鉴定。纯化的VLPs免疫BALB/c小鼠，测定小 鼠血清中和抗体水平。分析产生的中和抗体抑制HCVpp和HCVcc对Huh7. 5的感染情况。
[0047] 1.丙型肝炎病毒的保守的中和抗原表位选择和表达载体构建
[0048] I. 1表位选择包括以下多表位序列，其来源和氨基酸残基序列分别为：HCV El区 线性中和表位：ITGHRMAWDMMMNWS ;HCV E2区线性中和表位：QLINTNGSWHIN ;HCV E2区线性 中和表位：GVPTYSWGENET ;HCV E2 高变区（HVR)模拟表位：ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK。
[0049] I. 2HBV S基因亲水区引入Age I位点。克隆HBV S抗原基因（adw，681bp)，采用重 叠 PCR方法，分别克隆HBV S抗原1-127位氨基酸序列和128-227位氨基酸序列，分别插入 克隆载体口1^11168(31^口1:(-)伍(3〇1?1/^86 1，六86 1/%^1)中，将128位氨基酸4替换为6， 从而引入Age I位点，表位基因可利用该位点插入HBV S基因亲水区，构建嵌合的HCV中和 表位的HBV S基因。将引入Age I位点的全长S基因亚克隆至真核表达载体pCI-neo中， 得到重组真核表达载体pCI-HBS。
[0050] 参见图1，图示为利用点突变方法，将HBV S基因第128位氨基酸由G突变为A，在 HBV S基因 S片段氨基酸127 (T)和128㈧位之间，引入Age I位点，分别将四个表位基因 基因插入该位点，使不同表位嵌合于HBV S抗原亲水区（aalOl-159)。
[0051] 图2,为不同HCV中和抗原表位基因嵌合的HBS基因克隆入pCI-neo中，EcoR I/ Xba I双酶切鉴定，得到预期大小片段，证实嵌合基因克隆入真核表达载体。
[0052] 1. 3插入HCV中和表位的重组HBV S基因构建。
[0053] 国外插入表位基因方法是合成表位基因序列，两端带有Age I位点，随机插入改 造的pCI-HBS载体，选择测序正确的载体。由于表位基因较短，这样插入方法较为困难。 我们采用将表位以引物方式合成，作为上游引物扩展HBV S基因下游序列，克隆入组载体 pCI-HBS，这样较易实现将表位插入目的基因位点中。
[0054] 具体做法是以 pCI-HBS 为模板，分别用 FElAge I/R2Xba I，FE2Age I/R2Xba I， FE3Age I/R2Xba I，FE4Age I/R2Xba I为引物（表位序列见表1)，扩增得到引入不同表位 的HBV S下游128-227位氨基酸的碱基序列，扩增产物回收后连接入T-easy载体，测序正 确后分别命名为 T-HBSEl，T-HBSE2, T-HBSE3, T-HBSE4。
[0055] 表1表位及引物序列设计（粗体为表位序列）
[0056]
【权利要求】
1. 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒，其特征在于，该病毒样颗粒是将HCV表 位插入HBV S抗原亲水区构建真核表达载体，再经哺乳动物细胞体外装配制得； 其中，所述的HCV表位为氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?4中任意一项所示的表位。
2. 根据权利要求1所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒，其特征在于， 氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?3所示的表位为高度保守的中和表位；氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示的表位为高变区的模拟表位。
3. 根据权利要求2所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒，其特征在于， 氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示的表位为HCV El区线性中和表位；氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2所示的表位为HCV E2区线性中和表位；所述高变区的模拟表位为 HCV E2模拟表位。
4. 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 在HBV S基因亲水区引入Age I克隆位点 将引入Age I克隆位点的全长S基因亚克隆至真核表达载体pCI-neo中，得到重组真 核表达载体PCI-HBS ; 2) 将HCV表位以引物合成的形式克隆入重组真核表达载体pCI-HBS中 以 pCI-HBS 为模板，分别用 FElAge I/R2Xba I，FE2Age I/R2Xba I，FE3Age I/R2Xba I，FE4Age I/R2Xba I为引物，扩增得到引入不同表位的HBV S下游128-227位氨基酸的 碱基序列，扩增产物回收后连接入T-easy载体，分别得到T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3和 T-HBSE4 ； 3) 构建嵌合HCV中和抗原表位真核载体 将 T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3 和 T-HBSE4 分别用 Age I/Xba I 双酶切，克隆入 Age 1/ Xba I双酶切的pCI-HBS中，得到重组的嵌合HCV中和抗原表位的真核表达载体，分别为 pCI-HBSEl，pCI-HBSE2, pCI-HBSE3 和 pCI-HBSE4 ; 4) 病毒样颗粒的制备 分别将pCI-HBSEl、pCI-HBSE2、pCI-HBSE3和pCI-HBSE4转染哺乳动物细胞，转染48h 后收集培养上清，定量测定HBsAg含量，得到四种不同的嵌合病毒样颗粒VLPs，分别命名为 VLPs-SEl、VLPs-SE2、VLPs-SE3 和 VLPs-SE4。
5. 根据权利要求4所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒的制备方法，其 特征在于，步骤2)所述的以引物合成的形式克隆HCV表位所用到的引物FI、Rl、F2、R2、FE 1、 FE2、FE3和FE4的核苷酸序列分别如SEQ. ID. NO :5?12所示。
6. 根据权利要求4所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒的制备方法，其 特征在于，步骤4)所述的哺乳动物细胞为HEK293T、Hela或Huh7. 5细胞。
7. 根据权利要求4所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒的制备方法，其 特征在于，步骤4)采用磷酸钙法或脂质体法转染哺乳动物细胞。
8. 根据权利要求4所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒的制备方法，其 特征在于，步骤4)是采用罗氏E601电化学发光分析仪对HBsAg含量进行定量测定。
9. 权利要求1所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒在制备用于治疗HCV 感染病症的疫苗中的应用。
【文档编号】C12N15/85GK104312986SQ201410555736
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】韦三华, 张海, 雷迎峰, 舒放, 林芳, 王希, 李斌, 张利军, 张惠中 申请人:中国人民解放军第四军医大学