一种优化信号肽提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法
【专利摘要】本发明公开了一种优化信号肽提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法，属于基因工程【技术领域】。本发明通过与胰蛋白酶融合表达8种毕赤酵母胞外分泌信号肽，甲醇诱导启动子(pAOX)在Pichia pastoris GS115染色体上表达重组胰蛋白酶。本发明的αmf信号肽与原始的α-factor信号肽相比，胰蛋白酶酶活提高了2.75倍，解决了胰蛋白酶胞外分泌量低的问题。应用本发明方法生产胰蛋白酶，产量高、工艺简化、便于工业化应用。
【专利说明】一种优化信号肽提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种优化信号肽提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法，属于基因工程技 术领域。
【背景技术】
[0002] 胰蛋白酶作为丝氨酸蛋白酶中的较早被发现应用的一种重要类型，最早被发现于 哺乳动物的肠道消化液中。商品化的胰蛋白酶多从哺乳动物胰脏提取，由于胰脏中含丰富 的蛋白酶，对胰蛋白酶分离提纯带来困难。另外，哺乳动物来源的胰蛋白酶多为胰酶混合 物，在医药应用上存在对人体的免疫原性危害。
[0003] 近年，动物来源的胰蛋白酶通过基因工程手段在大肠杆菌、毕赤酵母中得到表 达，但是，大肠杆菌表达常出现包涵体，毕赤酵母酶原表达猪、牛胰蛋白酶需要外源的肠激 酶、胰蛋白酶体外激活。灰色链霉菌胰蛋白酶研究，Koo-Bon-Joon等利用链霉菌常用宿主 Streptomyces lividansl326及链霉菌常用的pWHM3质粒（Ermp，红霉素启动子）获得在同 属菌中分泌表达的重组胰蛋白酶，Chi-Won-Jae等将此质粒转入到能够产胰蛋白酶的灰色 链霉菌 Streptomyces griseus IF013350 中表达，Daisuke Nohara 等人（1998)将链霉菌 胰蛋白酶以包涵体形式在E. coli系统中进行了表达。已有研究在毕赤酵母中以胰蛋白酶 形式表达了灰色链霉菌来源的胰蛋白酶。
[0004] 异源表达胰蛋白酶突出的问题是，蛋白表达量低、胰蛋白酶酶活低。因此，构建用 于毕赤酵母胞外分泌信号肽，提高胰蛋白酶胞外酶活，对于满足胰蛋白酶工业化成产需求 和降低生产成本有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种产胰蛋白酶的重组酵母菌，是在核苷酸序列是SEQ ID NO. 9所示 序列的胰蛋白酶基因前融合核苷酸序列是SEQ ID NO. 7所示序列的信号肽形成重组基因， 将重组基因在宿主菌中进行表达得到的重组酵母菌。
[0006] 所述信号肽，其核苷酸序列为以下所示序列的任意一种：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 或者 SEQ ID NO. 8。
[0007] 所述信号肽，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQIDN0. 7所不的序 列。
[0008] 所述重组酵母菌的出发宿主菌是以下任意一种：pichia pastoris GS115、pichia pastoris KM71、pichia pastorisX-33、pichia pastoris SMD1168。
[0009] 所述重组酵母菌，在本发明的一种实施方式中，其出发宿主菌是pichia pastoris GS115。
[0010] 本发明还提供一种所述重组酵母菌的构建方法，是在核苷酸序列是SEQ ID NO. 9 所示的序列的胰蛋白酶基因之前添加核苷酸序列是SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 或者 SEQ ID NO. 8 任一所示 序列的信号肽形成重组基因，将该重组基因连接到表达质粒中形成重组质粒，再转化到酵 母菌中得到重组菌。
[0011] 所述重组菌的构建方法具体如下：依据合成的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示的来源于灰色链霉菌（Streptomyces griseus)的胰蛋白酶基因（mt)、 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 8所示的8种信号肽（分别命名为 a as, Sas, Ipr, Iss, Lss, nsB, a mf, Kps)设计引物，采用两步PCR方法分别将信号肽添加到 膜蛋白酶基因前获得重组基因 （α as-mt, Sas-mt, Ipr-mt, Iss-mt, Lss-mt, nsB-mt, a mf-mt ，Kps-mt);将所述的重组基因连接到毕赤酵母表达载体，得到重组质粒；将所述的重组质粒 电转化毕赤酵母Pichia pastoris GSl 15,获得重组酵母工程菌株。
[0012] 所述重组基因是采用两步PCR方法获得的含有信号肽序列和胰蛋白酶基因序列 的的重组基因。
[0013] 所述表达质粒是以下任意一种：pGAPZA、pA0815、pGAPaA、pPIC9K、pPICZB。
[0014] 所述表达载体，在本发明的一种实施方式中是PPIC9K质粒。
[0015] 所述表达载体和宿主菌购自Invitrogen公司。
[0016] 本发明还提供一种提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法，是使用上述构建的重组酵 母菌进行发酵，表达胰蛋白酶。
[0017] 所述提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法，在本发明的一种实施方式中，将核苷酸 序列如SEQ ID NO. 7所示的信号肽添加到核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示的胰蛋白酶基因 前得到重组基因 amf-mt，重组基因转化毕赤酵母表达载体后得到重组质粒，重组质粒转化 到毕赤酵母中，即获得重组菌，进行表达。
[0018] 所述提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法，在本发明的一种实施方式中，具体是： ⑴合成序列是SEQ ID NO. 9所示序列的基因片段；（2)以步骤1的基因片段为模板，使用 序列是SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示的引物进行PCR，PCR产物回收后作为模板，用序 列是SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12所示的引物进行PCR获得重组基因；（3)用Notl、BamH I双酶切步骤2得到的重组基因和pPIC9K质粒，用连接酶连接得到重组质粒；(4)将步骤3 得到的重组质粒转化到pichia pastoris GS115中，即得到重组毕赤酵母菌，进行表达。
[0019] 前期研究工作中，本研究团队已获得以a-factor作为分泌信号肽的胰蛋白酶的 重组毕赤酵母工程菌（CN 102094040A)。
[0020] 本发明通过在构建了含有胞外分泌信号肽的胰蛋白酶，实现了胰蛋白酶毕赤 酵母高效分泌表达，解决了胰蛋白酶产量低的问题。可能是因为α-facotor信号肽的 pre-region序列在异源蛋白胞外分泌过程中起重要作用。a -factor包括pre-region、 pro-region两部分，且a -factor的pre-region序列与a mf信号肽的序列一致， Pre-region序列引导异源蛋白从胞质中定位在内质网内，异源蛋白在此完成翻译后修饰后 以胞吐的形式分泌到胞外。而a-factor信号肽在引导异源蛋白胞外分泌过程中需要两 步分泌过程：l)pre-region序列切割；2)pro_region序列切割。融合表达a mf信号肽与 a-factor信号肽相比，切割效率更高。应用本发明方法得到的重组基因工程菌生产胰蛋白 酶，产量高，便于工业化生产。本发明为毕赤酵母胞外高效分泌胰蛋白酶研究工作奠定了基 础。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1 :克隆表达载体构建图
[0022] 图2 :重组毕赤酵母工程菌的胰蛋白酶酶活
[0023] 图3 : a -factor信号肽序列分析
【具体实施方式】
[0024] 胰蛋白酶酶活测定方法：胰蛋白酶特异性切割ΒΑΡΝΑ (Na-苯甲酰-DL-对-硝基 苯酰胺）羧基端的酰胺键，产物对硝基苯胺（在410nm处有最大吸收值）。在37°C下，测 定100 μ L粗酶液同900 μ L IOmM ΒΑΡΝΑ溶液（溶于50mM pH8. 0 Tris-HCl缓冲液）在光 径0.5cm的反应池中，在410nm下IOmin内的吸光值变化。酶活定义为：在37°C下，每分钟 410nm处光吸收值升高0. 1所需要的酶量为1个胰蛋白酶水解单位。
[0025] 实施例1重组质粒的构建
[0026] 灰色链霉菌膜蛋白酶基因 （Gen Bank Accession No. M64471)全长672bp。根据 8种信号肽的核酸序列设计引物。经过两步PCR将信号肽序列与SEQ ID NO. 9所示的基因 序列进行同和，获得融合基因片段（以SEQ ID NO. 9所示胰蛋白酶基因为模板用F2、R引物 PCR后柱回收，再用FI、R引物PCR柱回收产物获得融合片段，FI、F2、R引物的序列分别如 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示），按照如图1所示的构建方法，用Notl、 BamH I双酶切融合片段和pPIC9K质粒，纯化后T4连接酶16°C过夜连接。连接产物化学法 转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素（50mg/L) LB平板，提取质粒测序验证构建 的重组质粒。测序工作由上海生工完成。
[0027] 实施例2产胰蛋白酶酵母工程菌构建
[0028] 将含有胰蛋白酶基因前添加了信号肽的重组基因的重组质粒用Sal I线性化，电 击转化pichia pastoris GS115感受态细胞，具体方法如下：
[0029] 1)接种 YPD 平板活化的 pichia pastoris GS115 于 25mL/250mL 三角瓶，30°C过夜 培养；1%接种上述培养液于50mL/500mL三角瓶，培养菌体浓度0D600为1. 3?1. 5 ;
[0030] 2) 5000r/min，4°C离心IOmin收集菌体，分别用50mL、25mL无菌水悬浮细胞；
[0031] 3)5mL IM山梨醇重悬上述细胞，5000r/min，4°C离心IOmin收集菌体；
[0032] 4) 500 μ L IM山梨醇重悬上述细胞，分装80 μ L/1.5mL EP管用于电转化感受态细 胞；
[0033] 5) 20 μ L线性化质粒与上述80 μ L感受态细胞混合，冰上静置15min ;
[0034] 6)上述混合物加入预冷的无菌电转化杯（0. 2cm)，1500V、25 μ F、200 Ω电击一次， 加入ImL IM山梨醇；
[0035] 7)取上述混合物150 μ L涂布MD平板，30°C培养3天；
[0036] 8)挑取上述平板中白色菌落，分别点种在l、2、3、4mg/mL(遗传霉素）YPD平板中， 挑选在4mg/mL遗传霉素平板中的单菌落用于摇瓶发酵。
[0037] 实施例3重组菌的构建
[0038] 采用与实施例1类似的两步PCR的方法将核苷酸序列如SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 8 的信号肽（分别命名为 a as, Sas, Ipr, Iss, Lss, nsB, a mf, Kps)融合到 SEQ ID NO. 9 所示的胰蛋白酶基因前，获得8个重组基因 a as-mt、Sas-mt、Ipr-mt、Iss-mt、Lss-mt、 nsB-mt、amf-mt、Kps-mt ;将所述的重组基因分别连接到毕赤酵母表达载体，得到重组质 粒；将所述的重组质粒分别电转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115,获得重组酵母工程菌 株。
[0039] 实施例4重组毕赤酵母摇瓶培养
[0040] 将本发明构建的工程菌作为生产菌株，以CN 102094040A中构建的含a -factor 信号肽胰蛋白酶重组菌为对照，在ΥΗ)平板活化。种子液培养，接种50mL/250mL种子培养 基，30°C，220r/min培养24h。离心种子液，按发酵培养基中种子终浓度为0D600 = 1接种发 酵培养基，30°C，220r/min培养5d。每隔24h取样测胰蛋白酶胰蛋白酶酶活。结果如图2所 示，本发明构建的含有不同信号肽的8种重组菌中有六种都不同程度地提高了胰蛋白酶酶 活，其中含有amf信号肽的重组菌的酶活最高。融合amf信号肽的胰蛋白酶与a-factor 信号肽（CK)相比，胰蛋白酶酶活提高了 2. 75倍。图3为α-factor信号肽的序列，可以看 至丨J, a -factor 包括 pre-region、pro-region 两部分，且 a -factor 的 pre-region 序列与 amf信号肽的序列一致。这表明，α-facotor信号肽的pre-region序列在异源蛋白胞外 分泌过程中起重要作用。Pre-region序列引导异源蛋白从胞质中定位在内质网内，异源蛋 白在此完成翻译后修饰后以胞吐的形式分泌到胞外。而a-factor信号肽在引导异源蛋白 胞外分泌过程中需要两步分泌过程：l)pre-region序列切割；2)pro_region序列切割。融 合表达a mf信号肽与a -factor信号肽相比，切割效率更高。
[0041] 种子培养基（g/L):蛋白胨20,酵母提取物10,葡萄糖20。
[0042] 发酵培养基（g/L) =K2HPO4 ·3Η201. 51 ;KH2P045. 91 ;生物素 0. 2 ;YNB (酵母无氨基酸 氮源）13. 4 ;胰蛋白胨10 ;酵母粉5 ;生物素4X KT4 ;甲醇1 %。
[0043] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种产胰蛋白酶的重组酵母菌，其特征在于，是在核苷酸序列是SEQ ID NO. 9所示序 列的胰蛋白酶基因前融合核苷酸序列是SEQ ID NO. 7所示序列的信号肽形成重组基因，将 重组基因在宿主菌中进行表达得到的重组酵母菌。
2. 根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述重组酵母菌的出发宿主菌是 以下任意一种：pichia pastoris GS115、pichia pastoris KM71、pichia pastoris X_33、 pichia pastoris SMD1168。
3. 根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述重组酵母菌的出发宿主菌是 pichia pastoris GS115。
4. 根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述信号肽被核苷酸序列为以下 任意一种的信号肽所替代：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 或者 SEQ ID NO. 8。
5. -种权利要求I所述重组酵母菌的构建方法，是在核苷酸序列是SEQ ID NO. 9所示 的序列的胰蛋白酶基因之前添加核苷酸序列是SEQ ID NO. 7所示序列的信号肽形成重组基 因，将该重组基因连接到表达质粒中形成重组质粒，再转化到宿主酵母菌中得到重组菌。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达质粒是以下任意一种：pGAP ZA、 pA0815、pGAPaA、pPIC9K、pPIC ZB。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达质粒pPIC9K。
8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述构建方法为：（1)合成序列是SEQ ID NO. 9所示序列的基因片段；（2)以步骤1的基因片段为模板，使用序列是SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12所示的引物进行PCR，PCR产物回收后作为模板，用序列是SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12所示的引物进行PCR获得重组基因；（3)用NotI、BamHI双酶切步骤2得到的重组基因 和pPIC9K质粒，用连接酶连接得到重组质粒；(4)将步骤3得到的重组质粒转化到pichia pastoris GS115中，即得到重组毕赤酵母菌。
9. 权利要求1所述重组酵母菌在胰蛋白酶生产方面的应用。
【文档编号】C12R1/84GK104312933SQ201410555749
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】康振, 陈坚, 张云丰, 堵国成 申请人:江南大学