产石房蛤毒素的鞭毛藻的检测的制作方法
【专利摘要】本披露总体上涉及石房蛤毒素和能够生产它们的微生物的鉴别的领域。具体地说，在许多鞭毛藻物种中鉴别了包含催化域序列石房蛤毒素A1（sxtA1）和石房蛤毒素A4（sxtA4）的石房蛤毒素A（sxtA）基因。本披露涉及通过扩增和检测sxtA基因（尤其通过PCR）来检测产石房蛤毒素的鞭毛藻的方法，并且还披露了用于该方法的试剂盒和引物。通过该方法检测的产石房蛤毒素的鞭毛藻属包括亚历山大藻（Alexandrium）、盾甲藻（Pyrodinium）或裸甲藻（Gymnodinium）。
【专利说明】产石房蛤毒素的鞭毛藻的检测
[0001]通过交叉引用结合
[0002]本申请要求2011年5月16日提交的美国临时专利申请号61/486，633的优先权，该专利申请的全部内容通过交叉引用结合在此。
【技术领域】 [0003]本发明总体上涉及石房蛤毒素和能够生产它们的微生物的鉴别的领域。更确切地说，本发明涉及鞭毛藻中的编码石房蛤毒素的基因的鉴别，和用于特异性检测作为石房蛤毒素的生产者的鞭毛藻的方法。
【背景技术】
[0004]石房蛤毒素(STX)是在全世界水生环境中存在的强力神经毒素并且具有显著经济、环境和人体健康影响。摄取病媒物种可能导致麻痹性贝类中毒，一种可能导致麻痹和死亡的严重人类疾病。在全球范围内每年估计发生2000例人类麻痹性贝类中毒，死亡率为15%。监测和减轻STX的成本已导致经计算为8.95亿美元的来自有害浮游生物的水华的年度经济损失。在淡水环境中，STX主要由原核蓝藻细菌而产生。但是，在海洋环境中，真核鞭毛藻已与STX的存在相关联。尽管多种鞭毛藻物种与STX的生产相关联，这些微生物中的STX生产的遗传基础仍难以理解。
[0005]对于检测海洋样品中(或不存在)产STX的鞭毛藻存在的方法有一种需要。
[0006]发明概述
[0007]多个研究已未成功地尝试通过酶特征化、PCR方法、表达序列标记(EST)库的电脑模拟分析或其他公开可供使用的核苷酸序列的使用来鉴别鞭毛藻中的STX路径基因和/或酶类。此外，若干先前研究已提出STX可能事实上并非由鞭毛藻生产，而是由共培养细菌生产。
[0008]诸位发明人已确定鞭毛藻事实上为STX的生产者并且已鉴别在这些微生物中负责STX生产的基因。负责STX生产的基因的鉴别为检测淡水和海洋环境两者中的产STX鞭毛藻的许多分子测试提供基础。
[0009]在第一方面中，本发明提供一种用于检测样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的方法，该方法包括:
[0010]获得用于该方法的一种样品，并且
[0011]分析该样品中鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸编码的多肽中的一种或多种的存在，
[0012]其中所述聚核苷酸或多肽的存在指示该样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的存在。
[0013]在第二方面中，本发明提供一种用于确定样品中产石房蛤毒素的鞭毛藻不存在的方法，该方法包括:
[0014]获得用于该方法的一种样品，并且
[0015]分析该样品中鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸编码的多肽中的一种或多种的存在，
[0016]其中所述聚核苷酸或多肽的不存在指示该样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在。
[0017]在第一或第二方面的一个实施例中，该聚核苷酸包含石房蛤毒素A核苷酸序列，该石房蛤毒素A核苷酸序列选自以SEQ ID NO: 5-197,224-227,230-242以及247中的任一种所示的那些序列或那些序列中的任一种的片段或变异体。
[0018]在第一或第二方面的一个实施例中，该聚核苷酸包含石房蛤毒素Al催化域序列、石房蛤毒素A4催化域序列或其片段。
[0019]在第一或第二方面的一个实施例中，该石房蛤毒素A4催化域序列或其片段包含以SEQ ID N0:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID N0:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或变异体。
[0020]在第一或第二方面的一个实施例中，该石房蛤毒素A4催化域序列或其片段由以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或变异体组成。
[0021]在第一或第二方面的一个实施例中，该石房蛤毒素Al催化域序列包含以SEQ IDNO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或变异体。
[0022]在第一或第二方面的一个实施例中，该石房蛤毒素Al催化域序列由以SEQ IDNO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或变异体组成。
[0023]在第一或第二方面的一个实施例中，该分析包括通过聚合酶链式反应来扩增来自该样品的聚核苷酸。
[0024]在第一或第二方面的一个实施例中，该聚合酶链式反应利用一种或多种引物，该一种或多种引物包含以SEQ ID NO: 198或SEQ ID NO: 199所示的序列或二者之一的序列的片段或变异体。
[0025]在第一或第二方面的一个实施例中，该聚合酶链式反应利用一种或多种引物，该一种或多种引物由以SEQ ID NO: 198或SEQ ID NO: 199所示的序列或二者之一的序列的片段或变异体组成。
[0026]在第一或第二方面的一个实施例中，该聚合酶链式反应利用一种或多种引物，该一种或多种引物包含或其组成为以SEQ ID N0:198-199、200-211、220-223、228-229以及243-244中的任一种所示的序列或那些序列中的任一种的片段或变异体。
[0027]在第一或第二方面的一个实施例中，该多肽包含以SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4所示的石房蛤毒素A氨基酸序列或二者之一的序列的片段或变异体。
[0028]在第一或第二方面的一个实施例中，该多肽由以SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 4所示的石房蛤毒素A氨基酸序列或二者之一的序列的片段或变异体组成。
[0029]在第一或第二方面的一个实施例中，该产石房蛤毒素的鞭毛藻是来自亚历山大藻(Alexandrium)、盾甲藻(Pyrodinium)或裸甲藻(Gymnodinium)属的。
[0030]在第一或第二方面的一个实施例中，该产石房蛤毒素的鞭毛藻是选自下组，该组由以下各项组成:链状 亚历山大藻(A.catenella)、芬迪湾亚历山大藻(A.fundyense)、无菌亚历山大藻(A lusitanicum)、微小亚历山大藻(A.minutum)、当乌氏亚历山大藻(A.0stenfeldii)、塔玛亚历山大藻(A.tamarense)、链状裸甲藻(G.catenatum)以及巴哈马麦甲藻扁平变种(P.bahamense var compressum)。
[0031 ] 在第一或第二方面的一个实施例中，使用第十一或第十二方面的引物对进行所述分析。
[0032]在第三方面中，本发明提供一种用于检测样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的试剂盒，该试剂盒包含至少一种用于检测鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸编码的多肽的存在的试剂。
[0033]在第四方面中，本发明提供一种用于确定样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在的试剂盒，该试剂盒包含至少一种用于检测鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸编码的多肽的存在的试剂。
[0034]在第三或第四方面的一个实施例中，该试剂特异性地结合到包含石房蛤毒素A核苷酸序列的聚核苷酸上，该石房蛤毒素A核苷酸序列选自以SEQ ID NO:5-197,224-227,230-242以及247中的任一种所示的那些序列或那些序列中的任一种的片段或变异体。
[0035]在第三或第四方面的一个实施例中，该试剂特异性地结合到包含石房蛤毒素Al催化域序列、石房蛤毒素A4催化域序列或其片段的聚核苷酸上。
[0036]在第三或第四方面的一个实施例中，该石房蛤毒素A4催化域序列或其片段包含以SEQ ID N0:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID N0:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或变异体。
[0037]在第三或第四方面的一个实施例中，该石房蛤毒素A4催化域序列或其片段由以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或变异体组成。
[0038]在第三或第四方面的一个实施例中，该石房蛤毒素Al催化域序列包含以SEQ IDNO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或变异体。
[0039]在第三或第四方面的一个实施例中，该石房蛤毒素Al催化域序列由以SEQ IDNO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或变异体组成。
[0040]在第三或第四方面的一个实施例中，该试剂是一种引物、探针或抗体。
[0041]在第三或第四方面的一个实施例中，该试剂是包含以SEQ ID N0:198或SEQ IDNO: 199所示的序列或二者之一的序列的片段或变异体的引物。
[0042]在第三或第四方面的一个实施例中，该试剂是由以SEQ ID N0:198或SEQ IDNO: 199所示的序列或二者之一的序列的片段或变异体组成的引物。
[0043]在第三或 第四方面的一个实施例中，该试剂是包含或其组成为以SEQ IDNO: 198-199,200-211,220-223,228-229以及243-244中的任一种所示的序列或那些序列中的任一种的片段或变异体的引物。
[0044]在第三或第四方面的一个实施例中，该试剂特异性地结合到以SEQ ID NO: 2或SEQID NO:4所示的石房蛤毒素A氨基酸序列或二者之一的序列的片段或变异体上。
[0045]在第三或第四方面的一个实施例中，该试剂盒包含两种试剂，其中这两种试剂是第十一或第十二方面的引物对。
[0046]在第一、第二、第三或第四方面的一个实施例中，该样品是环境样品。
[0047]在第一、第二、第三或第四方面的一个实施例中，该样品是盐水样品。
[0048]在第一、第二、第三或第四方面的一个实施例中，该样品是淡水样品。
[0049]在第一、第二、第三或第四方面的一个实施例中，该样品是海洋样品。
[0050]在第五方面中，本发明提供一种分离的聚核苷酸，其包含以SEQ ID N0:1所示的序列或其变异体或片段。
[0051]在第五方面的一个实施例中，该分离的聚核苷酸由以SEQ ID N0:1所示的序列或其变异体或片段组成。
[0052]在第六方面中，本发明提供一种分离的聚核苷酸，其包含以SEQ ID N0:3所示的序列或其变异体或片段。
[0053]在第六方面的一个实施例中，该分离的聚核苷酸由以SEQ ID N0:3所示的序列或其变异体或片段组成。
[0054]在第七方面中，本发明提供一种分离的聚核苷酸，其包含以SEQ ID N0:5_197、224-227,230-242以及247中的任一种所示的序列或那些序列中的任一种的变异体或片段。
[0055]在第七方面的一个实施例中，该分离的聚核苷酸由以SEQ ID NO:5_197、224_227、230-242以及247中的任一种所示的序列或那些序列中的任一种的变异体或片段组成。
[0056]在第八方面中，本发明提供一种分离的多肽，该多肽由根据第五、第六或第七方面的聚核苷酸中的任一种编码。
[0057]在第九方面中，本发明提供一种特异性地结合到根据第五、第六或第七方面的聚核苷酸上的引物或探针。
[0058]在第十方面中，本发明提供一种特异性地结合到根据第八方面的多肽上的抗体。
[0059]在第^^一方面中，本发明提供一种用于检测样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的引物对，其中所述引物对包含第一引物，其包含SEQ ID NO: 198的聚核苷酸序列或其片段或变异体，和第二引物，其包含SEQ ID NO: 199的聚核苷酸序列或其片段或变异体。
[0060]在第^^一方面的一个实施例中，该引物对包含由SEQ ID NO: 198的聚核苷酸序列或其片段或变异体组成的第一引物，和由SEQ ID NO: 199的聚核苷酸序列或其片段或变异体组成的第二引物。
[0061 ] 在第十二方面中，本发明提供一种用于检测样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的引物对，其中所述引物对包含:
[0062]包含SEQ ID NO: 198的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID NO: 199的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或
[0063]包含SEQ ID NO:200的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID NO:201的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或
[0064] 包含SEQ ID NO:202的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID NO:203的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或
[0065]包含SEQ ID NO:204的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID NO:205的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或[0066]包含SEQ ID NO:206的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID NO:207的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或
[0067]包含SEQ ID NO:208的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID NO:209的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或
[0068]包含SEQ ID NO:210的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID N0:211的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或
[0069]包含SEQ ID NO:220的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID N0:221的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或 [0070]包含SEQ ID N0:222的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID N0:223的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或
[0071]包含SEQ ID NO:228的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID NO:229的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或
[0072]包含SEQ ID NO:243的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQ ID NO:244的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物。
[0073]附图简要说明
[0074]现在将参看附图仅通过举例描述本发明的优选实施例，在这些附图中:
[0075]图1是展示鞭毛藻和蓝藻细菌中的sxtA的结构的简图。A.芬迪湾亚历山大藻CCMP1719中的sxtA转录物的转录结构。B.拟柱胞藻(C.raciborskii) T3的基因组sxtA结构。C.STX的结构，其中以粗体标记通过sxtA引入的键和分子。
[0076]图2是展示芬迪湾亚历山大藻sxtA转录物和蓝藻sxtA基因的GC含量的图。在1000bp的窗口大小下每IObp计算GC含量。
[0077]图3展示SxtAl系统发生树。该图为按比例绘制的示意性图示(对于完整树参见图5)。展示最大似然拓扑。节点上的数字对应地表示最大似然和贝叶斯分析(Bayesiananalyses)的自引导值(bootstrap value)。
[0078]图4A展示SxtA4系统发生树。该图为按比例绘制的系统发生树的示意性图示(对于完整树参见图6)。展示最大似然拓扑。节点上的数字对应地表示最大似然和贝叶斯分析的自引导值。
[0079]图4B是展示在生长周期期间的三个不同时间点在链状亚历山大藻ACSH02中的sxtA4的基因组拷贝数的图。
[0080]图5展示SxtAl系统发生树。展示最大似然拓扑。节点上的数字对应地表示最大似然和贝叶斯分析的自引导值。粗体的序列是转录衍生序列；这些序列是使用RACE产生的或是来自454测序数据集合的重叠群的。
[0081]图6展示SxtA4系统发生树。展示最大似然拓扑。节点上的数字对应地表示最大似然和贝叶斯分析的自引导值。粗体的序列是转录衍生序列；这些序列是使用RACE产生的或是来自454测序数据集合的重叠群。
[0082]图7是展示实例2提及的浮游植物和团聚牡蛎(S.glomerata)取样地点的地图。
A.澳大利亚新南威尔士(NewSouth Wales, Australia)和取样其中的水华的三个河口:
B.布里斯班(Brisbane)水域，C.乔治河(GeorgesRiver)以及D.睡贡嘎海湾(WagongaInlet)。D中的比例尺表示插页地图B、C和D中的1km。[0083]图8是展示基于来自3株指数增长的链状亚历山大藻菌株的已知数目的细胞的DNA的稀释液的sxtA4引物对的标准曲线的图。使用表示不同菌株中的30-2600个细胞的DNA浓度测试该检验。
[0084]图9提供展示基于使用2010年11月期间在A.乔治河和B.哇贡嘎海湾取样地点的LSU rDNA引物对的微观细胞鉴别计数和qPCR的sxtA4基因拷贝的丰度(第一 y轴)和链状亚历山大藻细胞的估值(第二 y轴)的两幅图。
[0085]图10提供展示如每周在取样地点在光学显微镜下使用手动计数确定的sxtA4 L-1和链状亚历山大藻的细胞的数目或拷贝的图。
[0086]图11提供展示链状亚历山大藻细胞丰度和sxtA4拷贝之间的回归方程的图。
[0087]图12展示塔玛亚历山大藻ATNWBOI的SEM图像。A)腹面观，细胞膜完整，展示一般细胞大小和形状，比例尺=5 μ m，B)背面观，细胞膜完整，展示细胞形状，比例尺=10 μ m,C)顶面观的上锥，展示I’板上的APC和孔，比例尺=5 μ m，D)底面观的下锥，展示板模型，比例尺=10 μ m, E)顶孔复合物,展示逗点形状，F)后沟板,展示孔，比例尺=2 μ m。
[0088]图13展示塔玛亚历山大藻ATCJ33、ATEB01以及ATBBOl的菌株(用于比较，从哈勒格雷夫(Hallegraeff)等人，1991获取)的SEM图像。A-D, ATCJ33，A)展示2个细胞的链，和一般细胞大小和形状的ATCJ33，比例尺=IOym, B)第一顶板，展示腹孔，C)APC，展示逗点形状，D)第一顶板，展示腹孔，E、F、H ATEBOl0 E)展示细胞的一般大小和形状的ATEB01，t匕例尺=10 μ m, F) ATEBOl，展示腹孔的第一顶板，G)展示腹孔和APC的ATBBOl，H)展示APC的 ATEBOI。
[0089]图14展示塔玛亚历山大藻复合物的18S+ITS1-5.8S-1TS2+28S rDNA级联系统发生(2821个特征)。使用贝叶斯推理(Phylobayes)重构该树。内节点上的数字表示Phylobayes和RAxML (有序的；Phylobayes/RaxML)的后验概率和自引导值(>50%)。黑色圆圈表明1.00的后验概率值和自引导>90%。组1-4进化枝已合并，系统发生的扩展版本参见
[0090]图15是使用HPLC的ATNWB01的毒素特征曲线，针对PSP毒素标准确定如所指示的峰值。
[0091]图16展示塔玛亚历山大藻复合物的18S+ITS1-5.8S-1TS2+28S rDNA级联系统发生(2821个特征)。使用贝叶斯推理(Phylobayes)重构该树。内节点上的数字表示Phylobayes和RAxML (有序的；Phylobayes/RaxML)的后验概率和自引导值(>50%)。黑色圆圈表明1.00的后验概率值并且自引导>90%。
[0092]定义
[0093]除非上下文 另外明确规定，否则如本申请中所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括多个参考物。例如术语“一个鞭毛藻”还包括多个鞭毛藻。
[0094]如在此所用，术语“包含(comprising)”意味着“包括(including)”。“包含(comprising)” 一词的变化形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”具有相应地变化的含义。因此，举例来说，“包含”编码一个蛋白质的序列的聚核苷酸可能仅由那个序列组成或可能包括一个或多个另外序列。
[0095]如在此所用，术语“石房蛤毒素”包涵纯石房蛤毒素和其类似物，这些类似物的非限制性实例包括新石房蛤毒素(neosaxitoxin) (neoSTX)、膝沟藻毒素(gonyautoxin)(GTX )、去氨甲酰基石房蛤毒素(decarbamoy lsaxi toxin) (dcSTX )、非硫酸化类似物、单硫酸化类似物、二硫酸化类似物、去氨甲酰化类似物和疏水性类似物。
[0096]在此的现有技术文档的任何描述，或衍生自或基于那些文档的在此的陈述不是对于这些文档或衍生的陈述是相关技术的公共常识的一部分的承认。
[0097]出于描述的目的，将在此提及的所有文档和基因库序列通过引用全文结合。
[0098]详细说明
[0099]诸位发明人已确定鞭毛藻是石房蛤毒素(STX)的生产者并且已鉴别在这些微生物中负责STX生产的基因。基于此发现，诸位发明人已开发一种能够分清产STX的鞭毛藻物种和不生产STX的鞭毛藻物种之间的差别的检验。
[0100]因此，本发明的某些方面涉及存在于鞭毛藻中的STX聚核苷酸和多肽序列的提供。
[0101]还提供用于给定样品中的产STX的鞭毛藻的检测的方法，这些方法基于检测在样品中一个或多个本发明的序列的存在(或不存在)。
[0102]还提供用于给定样品中的产STX的鞭毛藻的检测的试剂盒，这些试剂盒包含用于检测在样品中一个或多个本发明的序列的存在(或不存在)的试剂。
[0103]聚核苷酸和多肽
[0104]在此披露鞭毛藻石房蛤毒素聚核苷酸和多肽序列(对应地为“本发明的聚核苷酸”和“本发明的多肽”)。本发明的聚核苷酸可能是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或互补脱氧核糖核酸(cDNA)。
[0105]在某些实施例中，这些序列是石房蛤毒素A基因(sxtA)聚核苷酸序列或石房蛤毒素A多肽(STXA)序列。
[0106]sxtA聚核苷酸序列可以包含任何一个或多个sxtA基因催化域(即sxtAl、sxtA2、sxtA3或sxtA4催化域)，或其片段。仅通过非限制性实例，sxtAl序列可能是由以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID NO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821或以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022定义的。sxtA2序列可能是由以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID NO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸1837-2415或以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2038-2604定义的。sxtA3序列可能是由以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID NO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2479-2694或以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2722-2949定义的。sxtA4序列可能是由以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID N0:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121或以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID N0:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721定义的。
[0107]本发明的sxtA基因聚核苷酸序列的其他非限制性实例包括以基因库保藏号JF343238 和 JF343239 (SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:3)提供的那些序列。
[0108]STXA多肽序列可以包含任何一个或多个STX蛋白质催化域(即STXA1、STXA2、STXA3或STXA4催化域)或其片段。仅通过非限制性实例，STXAl序列可能是由以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID NO:2)所示的多肽序列的氨基酸残基1-554或以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的氨基酸残基1-582定义的。STXA2序列可能是由以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID NO:2)所示的多肽序列的氨基酸残基560-752或以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID NO:4)所示的多肽序列的氨基酸残基588-776定义的。STXA3序列可能是由以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID NO:2)所示的多肽序列的氨基酸残基774-845或以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的氨基酸残基816-891定义的。STXA4序列可能是由以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的氨基酸残基947-1281定义的。
[0109]本发明的STX多肽序列的其他非限制性实例包括以基因库保藏号JF343238和JF343239 (SEQ ID N0:2 和 SEQ ID NO:4)提供的那些序列。
[0110]优选地，聚核苷酸和多肽序列来自产石房蛤毒素鞭毛藻。例如，聚核苷酸和多肽序列可能来自膝沟藻目(Gonyaulacales)或裸甲藻目(Gymnodiniales)的鞭毛藻。优选地,鞭毛藻是亚历山大藻(以前为膝沟藻)、盾甲藻或裸甲藻属的。
[0111]优选的亚历山大藻物种的非限制性实例包括链状亚历山大藻(例如菌株ACCCO1、ACSHO2、ACTRAO2以及CCMP1493)、芬迪湾亚历山大藻(例如菌株CCMP1719和CCMP1979)、海洋原甲藻、微小亚历山大藻(例如菌株CCMP1888、CCMPl 13, ALSPOU ALSP02以及AMD16/AMAD16)、当乌氏亚历山大藻(A.0stenfeldii)以及塔玛亚历山大藻(例如菌株CCMP1771、ATBB01、ATEB01、ATCJ33以及ATNWB01)。优选的裸甲藻物种的非限制性实例包括链状裸甲藻(例如菌株GCTRA01和CS-395)。优选的盾甲藻物种的非限制性实例包括巴哈马麦甲藻扁平变种。
[0112]还在此提供本发明的聚核苷酸和本发明的多肽两者的片段。
[0113]在此涵盖的聚核苷酸“片段”是一种聚核苷酸分子，该聚核苷酸分子是本发明的聚核苷酸或其变异体的成分。聚核苷酸的片段不一定需要编码保留生物活性的多肽，尽管不排除这种情况。在某些实施例中，片段可能用作杂交探针或PCR引物。该片段可以通过裂解本发明的聚核苷酸衍生，或作为替代方案，可以通过一些其他方式，例如通过化学合成来合成。在此涵盖的聚核苷酸片段可以是长度为小于约5000个核苷酸，长度为小于约4500个核苷酸或长度为小于约 4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、750、500、400、300、250、200、150、100、75、50、25或15个核苷酸。另外地或可替代地，在此涵盖的聚核苷酸片段可以是长度为超过约15个核苷酸，长度为超过约25个核苷酸或长度为超过约50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000个核苷酸。另外地或可替代地，在此涵盖的聚核苷酸片段可以是长度在约25个与约50个核苷酸之间；长度在约25个与约75个核苷酸之间；或长度在约25个与约100、100和250、100和500、250和500、100和1000、500和2000、1000和2000个核苷酸之间。
[0114]本发明的聚核苷酸片段包含sxtA基因的片段。例如，本发明的聚核苷酸片段可以包含sxtAl、sxtA2、sxtA3或sxtA4催化域中的任何一种或多种,或其片段。本发明的多肽片段包含STX蛋白质的片段。例如，本发明的聚核苷酸片段可以包含STXA1、STXA2、STXA3或STXA4催化域中的任何一种或多种，或其片段。
[0115]本发明的sxtA基因聚核苷酸序列片段的具体和非限制性实例包括以基因库保藏号 JF343240-JF343432 (SEQ ID N0:5_SEQ ID NO: 197)提供的那些序列片段，和以 SEQ IDNO:224-227,230-242和247所示的那些序列片段。
[0116]本发明的sxtA基因聚核苷酸序列片段的另外的具体和非限制性实例包括由以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121和核苷酸3597-3721定义的那些序列片段，和其片段和变异体。
[0117]sxtAl催化域序列的具体和非限制性实例包括以SEQ ID NO:224-227和247陈述的那些序列。
[0118]sxtA4催化域序列的具体和非限制性实例包括以SEQ ID NO:230-242陈述的那些序列。
[0119]在此涵盖的多肽“片段”是一种多肽分子，该多肽分子是本发明的多肽或其变异体的成分。典型地，片段与该片段为其中的一种成分的多肽具有相同定性生物活性，或尽管这不一定为所需的。在此涵盖的多肽片段可以是长度为小于约1500个氨基酸残基，长度为小于约1400个氨基酸残基，或长度为小于约1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、75、50、25或15个氨基酸残基。另外地或可替代地，在此涵盖的多肽片段可以是长度为超过约15个氨基酸残基，长度为超过约25个氨基酸残基或长度为超过约 50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200 或 1300个氨基酸残基。另外地或可替代地，在此涵盖的多肽片段可以是长度在约15个与约25个氨基酸残基之间；长度在约15个与约50个氨基酸残基之间；或长度在约15个与约75、15和100、15 和 150、25 和 50、25 和 100,50 和 100、50 和 150、100 和 200、100 和 250、100 和 300、100和500,500和750,500和1000或1000和1300个氨基酸残基之间。
[0120]本发明的STXA多肽序列片段的具体和非限制性实例包括由以基因库保藏号JF343248 (SEQ ID NO: 3)所示的多肽序列的氨基酸残基X-Y定义的那些片段、由以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的氨基酸残基947-1281定义的那些片段和其片段和变异体。
[0121] 还在此提供本发明的聚核苷酸和本发明的多肽的变异体，和其片段。
[0122]在此涵盖的“变异体”是指实质上类似序列。一般来说，如果两个序列在规定区域上，或当未规定时在整个序列上具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(“序列一致性”百分比)，那么这两个序列“实质上类似”。因此，在此披露的聚核苷酸和多肽序列的“变异体”可以与参考序列共享至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、83%、85%、88%、90%、93%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列一致性。
[0123]一般来说，多肽序列变异体具有共同定性生物活性。聚核苷酸序列变异体通常编码通常具有共同定性生物活性的多肽。在术语“变异体”的含义内还包括本发明的聚核苷酸和本发明的多肽的同系物。聚核苷酸同系物典型地来自不同鞭毛藻物种但与在此披露的对应聚核苷酸共享实质上相同生物功能或活性。多肽同系物典型地来自不同鞭毛藻物种但与在此披露的对应多肽共享实质上相同生物功能或活性。术语“变异体”还包含本发明的多肽的类似物。多肽“类似物”是一种多肽，该多肽是本发明的多肽的衍生物，该衍生物包含一个或多个氨基酸的添加、缺失、取代，使得多肽保持实质上相同功能。术语“保守的氨基酸取代”是指在多肽链(蛋白质的主要序列)内的一种氨基酸对于具有类似特性的另一种氨基酸的取代或替代。例如，带电荷氨基酸谷氨酸(Glu)对于类似带电荷氨基酸天冬氨酸(Asp)的取代将是保守的氨基酸取代。
[0124]典型地，本发明的聚核苷酸和本发明的多肽是“分离的”。应理解术语“分离的”在此情形中意味着聚核苷酸或多肽已从一些或所有其他组分移除或与这些组分不相关，在该情况下该聚核苷酸或多肽将以其天然状态被发现。例如，“分离的”聚核苷酸可以是从较大聚核苷酸序列的其他聚核苷酸移除的，或可以是从如不相关聚核苷酸的天然组分移除的。同样地，“分离的”多肽可以是从较大多肽序列的其他多肽移除的，或可以是从如不相关多肽的天然组分移除的。为清楚起见，“分离的”聚核苷酸或多肽还包含尚未从自然获取而是已从头制备(如以化学方式合成和/或通过重组方法制备)的聚核苷酸或多肽。如在此所述，分离的本发明的多肽可以是以更长多肽或融合蛋白质的组成部分的形式包括的。
[0125]在某些实施例中，本发明的聚核苷酸可以被克隆到载体中。该载体可以包含例如DNA、RNA或互补DNA (cDNA)序列。该载体可以是质粒载体、病毒载体或适用于外来序列的插入、将这些序列引入到细胞中以及引入的序列的表达的任何其他合适的媒介。典型地，该载体是表达载体并且可能包括表达控制和处理序列，如启动子、增强子、核糖体结合位点、聚腺苷酸化信号以及转录终止序列。本发明还涵盖由这些载体转化的宿主细胞。例如，本发明的聚 核苷酸可以被克隆到一种载体中，该载体转化成细菌宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)。用于载体的构建和将这些载体转化成宿主细胞的方法通常在本领域中已知，并且描述在如例如萨布鲁克(Sambrook)等人(1989)分子克隆:实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual),第 2 版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),纽约普莱恩维尤(Plainview, New York);和奥斯贝(Ausubel)等人(编)现代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology) (2007),约翰.威利父子出版公司(John Wiley and Sons, Inc.)的标准文本中。
[0126]探针、引物以及抗体
[0127]本发明的聚核苷酸包括适用作引物和探针的衍生物和其片段。
[0128]这些衍生物和片段可以是呈寡核苷酸形式的。寡核苷酸是适合用于如PCR的核酸扩增反应中的短链核苷酸残基，这些寡核苷酸典型地长度为至少约5个核苷酸至约80个核苷酸，更典型地长度为约10个核苷酸至长度为约50个核苷酸，并且甚至更典型地长度为约15个核苷酸至长度为约30个核苷酸。
[0129]在一个实施例中，该探针包含如以SEQ ID NO:245或SEQ ID NO:246所示的序列或由该序列组成。
[0130]探针是典型地通过杂交用于同源序列的检测的具有例如在约10个核苷酸与几千个核苷酸之间的可变长度的核苷酸序列。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸。
[0131]用于核苷酸探针和/或引物的设计和/或生产的方法在本领域中已知，并且描述在如萨布鲁克等人(1989)分子克隆:实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤的标准文本；和如板仓(Itakura)等人(1984)生物化学综合年刊(Annu.Rev.Biochem.) 53:323 ;英尼斯(Innis)等人(编)(1990) PCR方案:指导方法和应用(PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications),学术出版社(Academic Press),纽约；英尼斯和盖尔范德(Gelfand)，(编)(1995) PCR策略(PCR Strategies)，学术出版社，纽约；以及英尼斯和盖尔范德，(编)(1999)PCR方法手册(PCR Methods Manual)，学术出版社,纽约的出版物中。
[0132]可以例如通过如磷酸二酯和磷酸三酯方法(参见例如纳朗(Narang)等人(1979)酶学方法(Meth.Enzymol.) 68:90 ;布朗(Brown)等人(1979)酶学方法68:109 ;以及美国专利号4356270)和二乙基亚磷酰胺方法(参见贝科奇(Beaucage)等人(1981)四面体快报(Tetrahedron Letters), 22:1859-1862)的化学合成技术制备聚核苷酸引物和探针。
[0133]本发明的聚核苷酸，包括前述探针和引物，可以通过标记物的结合标记以便于其检测。用于标记和检测核酸的技术例如描述在如奥斯贝等人(编)现代分子生物学实验指南(2007)，约翰.威利父子出版公司的标准文本中。合适的标记物的非限制性实例包括荧光分子(例如乙酰氨基芴、5-溴脱氧尿苷、地高辛(digoxigenin)以及荧光素)和放射性同位素(例如32P、35S、3H、33P)。可以例如通过化学、光化学、免疫化学、生物化学或光谱技术实现标记物的检测。
[0134]可以例如使用探针和引物来检测或分离相关样品中的鞭毛藻。在某些实施例中，探针和引物可用于检测相关样品中的产STX鞭毛藻。另外地或可替代地，探针或引物可用于分离包括例如其他鞭毛藻物种的其他生物体中的对应序列。如聚合酶链式反应(PCR)、杂交等的方法可用于基于与在此所示的序列的序列同源性鉴别这些序列。实施例涵盖基于与在此所示的全部序列或其片段的序列一致性选择的序列。这些序列包括为所披露的序列的直系同源物的序列。术语“直系同源物”是指来源于共同祖先基因并且由于物种形成发现于不同物种中的基因。当发现于不同物种中的基因的核苷酸序列和/或其编码蛋白质序列共享如在此其他地方定义的实质性一致性时，将这些基因视为直系同源物。直系同源物的功能在物种中通常是高度地保守的。
[0135]在杂交技术中，已知核苷酸序列的全部或一部分用于产生探针，该探针选择性地杂交到存在于给定样品中的其他对应核酸序列。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测标记物来标记。因此，举例来说，可通过标记基于本发明的序列的合成寡核苷酸制得用于杂交的探针。探针与靶向序列之间的同源性(序列一致性)的水平将很大程度上由杂交条件的严密性决定。具体地说，可以在低严密性、中等严密性或高严密性条件下将用作探针的核苷酸序列杂交到在此披露的聚核苷酸的同系物或其他变异体上。存在许多本领域的普通技术人员众所周知的条件和因素，可以采用这些条件和因素更改杂交的严密性，如例如将要杂交到规定核酸上的核酸的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)；盐和其他组分的浓度，如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇等的存在或不存在；以及更改杂交和/或洗涤步骤的温度。
[0136]在PCR方法下，可设计寡核苷酸引物以用于PCR反应中以扩增来自提取自任何相关生物体的cDNA或基因组DNA的对应DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法通常在本领域中已知。PCR的已知方法包括(但不限于)使用成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分地不匹配引物等的方法。
[0137]有技能的读者将辨识用于PCR或RT-PCR的在此所描述的引物还可以用作用于鞭毛藻sxt基因序列的检测的探针。
[0138]本发明还涵盖能够特异性地结合到本发明的多肽的抗体。这些抗体可用于定性地或定量地检测和分析给定样品中的一种或多种STX多肽。通过“特异性地结合”，应理解抗体能够以比其结合到不相关蛋白质上更高的亲和力结合到目标多肽或其片段上。例如，抗体可以通过在至少约10_4M到约ΙΟ,Μ范围内的结合常数结合到多肽或其片段上。优选地，结合常数是至少约10_5Μ，或至少约10_6Μ。更优选地，结合常数是至少约10_7Μ、至少约10_8Μ或至少约IO-9M或以上。在本发明的情形下，对于对本发明的STX多肽具有特异性的抗体的提及包括对该多肽的片段具有特异性的抗体。[0139]本发明的抗体可能以多种形式存在，包括例如作为全抗体，或作为抗体片段或其其他免疫学活性片段，如互补性决定区。类似地，抗体可能以具有功能性抗原结合域，也就是说，重和轻链可变域的抗体片段形式存在。此外，抗体片段可能以选自下组的形式存在，该组由(但不限于)以下各项组成:Fv、Fab、F(ab)2、scFv (单链Fv)、dAb (单域抗体)、嵌合抗体、双特异性抗体、双链抗体和三链抗体。
[0140]可以通过对全抗体的修饰或通过所需抗体片段的合成产生抗体“片段”。产生抗体，包括抗体片段的方法在本领域中已知并且包括例如通过重组DNA技术的合成。有技能的读者将知道合成抗体的方法，如描述于例如美国专利号5296348和如奥斯贝等人(编)现代分子生物学实验指南(2007)，约翰.威利父子出版公司的标准文本中的那些方法。
[0141]优选地，从相关STX多肽的离散域或片段制备抗体。相关多肽的抗原部分可以是任何适当的长度的，如约5到约15个氨基酸。优选地，抗原部分含有至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基。
[0142]可例如使用本发明的纯化STX多肽或编码本发明的STX多肽的本发明的纯化SXt聚核苷酸序列使用本领域中已知的任何合适的方法制备特异性地结合到本发明的多肽的抗体。例如，可以使用描述于哈洛(Harlow)和兰尼(Lane)(编)抗体-实验室手册(Antibodies-A Laboratory Manual),(1988),冷泉港实验室，纽约；科林根(Coligan),免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology) (1991);戈定(Goding)，单克隆抗体:原理与实践(Monoclonal Antibodies !Principles and Practice) (1986)第 2 版；以及科勒(Kohler)和米尔斯坦(Mi I stein), (1975)自然(Nature) 256:495-497中的杂交瘤技术制备典型地含有Fab部分的单克隆抗体。这些技术包括(但不限于)通过从噬菌体或类似载体中的重组抗体库选择抗体进行的抗体制备，以及通过使兔或小鼠免疫进行的多克隆和单克隆抗体的制备(参见例如休斯(Huse)等人(1989)科学(Science)246:1275-1281 ;沃德(Ward)等人(1989)自然 341:544-546)。
[0143]还将理解本发明的抗体包括人源化抗体、嵌合抗体和完全人类抗体。本发明的抗体可以是对于超过一种抗原或表位具有结合特异性的双特异性抗体。例如，抗体可以对于一种或多种STX多肽或其片段具有特异性，并且另外对于另一抗原具有结合特异性。用于人源化抗体、嵌合抗体、完全人类抗体以及双特异性抗体的制备的方法在本领域中已知并且包括例如描述于美国专利号6995243中的那些方法。
[0144]通常，潜在地包含本发明的STX多肽的样品可以与特异性地结合STX多肽或其片段的抗体接触。任选地，可在抗体与样品接触之前将抗体固定到固体支撑物上以便于复合物的洗涤和后续分离。固体支撑物的实例包括例如微量滴定盘、珠粒、十字叉或微珠。抗体还可以附着于如上所述的蛋白质芯片阵列或探针衬底。
[0145]用于结合到本发明的多肽的抗体的鉴别的可检测标签包括(但不限于)荧色物、荧光染料、放射性同位素标记、如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等通常用于本领域的酶类以及比色标签，包括胶态金或有色玻璃或塑料珠。可替代地，可使用间接检验检测抗体，其中例如第二标记抗体用于检测结合多肽特异性抗体。
[0146]用于检测抗体-标记物复合物的存在或测量该复合物的量的方法包括例如荧光、化学发光、发光 、吸光率、双折射率、透射率、反射率或折射率的检测，如表面等离子共振、椭圆偏振测量法、共振镜像法、光栅耦合器波导法或干涉测量。射频法包括多级共振光谱法。电化学法包括安培法和伏安法。光学法包括成像法和非成像法以及显微法。
[0147]用于检测抗体-标记物复合物的存在或测量该复合物的量的有用检验包括例如酶联免疫吸附检验(ELISA)、放射免疫检验(RIA)或免疫印迹检验(Western blot assay)。这些方法描述在例如斯蒂茨(Stites)和特尔(Terr)，(编)(1991)临床免疫学(ClinicalImmunology)，第7版；和浅井(Asai)，(编)(1993)细胞生物学方法:在细胞生物学中的抗体(Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology),第 37 卷中。
[0148]用于检测鞭毛藻的方法
[0149]本发明提供用于本发明的聚核苷酸和/或本发明的多肽的检测和/或分离的方法(“本发明的方法”)。
[0150]在一个实施例中，本发明提供一种用于检测样品中的鞭毛藻的方法。该方法包含获得用于该方法的样品，和检测样品中的本发明的聚核苷酸和/或本发明的多肽，或其片段或变异体的存在。样品中的聚核苷酸、多肽或其变异体或片段的存在指示样品中的鞭毛藻。
[0151]诸位发明人已确定sxtA基因存在于产石房蛤毒素的鞭毛藻中但不存在于不生产石房蛤毒素的鞭毛藻中。具体地说，已鉴别sxtA基因的sxtAl和/或sxtA4催化域的检测指示产石房蛤毒素的鞭毛藻。
[0152]因此，在另一个实施例中，本发明提供一种用于检测样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的方法。该方法包含获得用于该方法的样品，和检测样品中的本发明的聚核苷酸和/或本发明的多肽，或其片段或变异体的存在。样品中的聚核苷酸、多肽或其变异体或片段的存在指示样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻。
[0153]在另一个实施例中，本发明提供一种用于确定样品中产石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在的方法。该方法包含获得用于该方法的样品，和确定样品中的本发明的聚核苷酸和/或本发明的多肽，或其片段或变异体的不存在。样品中聚核苷酸、多肽或其变异体或片段的不存在指示产石房蛤毒素的鞭毛藻不存在于样品中。
[0154]在本发明的方法(包括紧靠的以上段落提及的那些方法)的情形中，聚核苷酸序列可以是石房蛤毒素A基因(sxtA)序列。sxtA聚核苷酸序列可以包含任何一个或多个sxtA基因催化域(即sxtAl、sxtA2、sxtA3或sxtA4催化域),或其片段。优选地，sxtA聚核苷酸序列包含sxtAl和/或sxtA4域,或其片段。更优选地,sxtA聚核苷酸序列包含sxtA4域，或其片段。多肽序列可以是石房蛤毒素A多肽(STXA)序列。
[0155]在一些实施例中，聚核苷酸序列对应于以基因库保藏号JF343238和JF343239(SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:3)中的任一种或二者之一的序列的片段或变异体提供的序列。
[0156]在其他实施例中，聚核苷酸序列对应于以基因库保藏号JF343240-JF343432 (SEQID N0:5-SEQ ID NO: 197)中的任一种或这些序列中的任一种的片段或变异体提供的序列。
[0157]在其他实施例中，聚核苷酸序列包含以SEQ ID NO:224-227和247中的任一种或这些序列中的任一种的片段或变异体提供的sxtAl催化域序列。
[0158]在其他实施 例中，聚核苷酸序列包含以SEQ ID NO:230-242中的任一种或这些序列中的任一种的片段或变异体提供的sxtA4催化域序列。
[0159]在其他实施例中，聚核苷酸序列可以包含以基因库保藏号JF343238 (SEQ IDNO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821 ;以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID N0:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022 ;以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID NO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸1837-2415 ;以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2038-2604;以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID NO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2479-2694;以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID NO: 3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2722-2949 ;以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID NO: 3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121 ;以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID NO: 3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721 ;或这些序列中的任一种的片段或变异体。
[0160]在本发明的方法(包括以上段落提及的那些方法)的情形中，多肽序列可以是石房蛤毒素A蛋白质(STXA)序列。STXA多肽序列可以包含任何一个或多个STXA蛋白质催化域(即STXA1、STXA2、STXA3或STXA4催化域)或其片段。优选地，STXA多肽序列包含STXAl或STXA4域，或其片段。更优选地，STXA多肽序列包含STXA4域，或其片段。
[0161]在一些实施例中，多肽序列对应于以基因库保藏号JF343238或JF343239(SEQ IDN0:2和SEQ ID N0:4)提供的序列，或二者之一的序列的片段或变异体。
[0162]在其他实施例中，多肽序列可以包含以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID N0:2)所示的多肽序列的氨基酸残基1-554 ;以基因库保藏号JF343239(SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的氨基酸残基1-582 ;以基因库保藏号JF343238 (SEQ ID NO: 2)所示的多肽序列的氨基酸残基560-752 ;以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的氨基酸残基588-776 ;以基因库保藏号JF343238(SEQ ID NO:2)所示的多肽序列的氨基酸残基774-845 ；以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的氨基酸残基816-891 ;以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的氨基酸残基947-1281 ;或这些序列中的任一种的片段或变异体。
[0163] 使用本发明的方法在样品中检测到的或确定在样品中不存在的鞭毛藻可以是产石房蛤毒素的鞭毛藻。没有施加任何具体的限制，鞭毛藻可以是来自膝沟藻目或裸甲藻目的。鞭毛藻可以是来自亚历山大藻(以前为膝沟藻)、盾甲藻或裸甲藻属的。亚历山大藻物种的合适的实例包括链状亚历山大藻(例如菌株ACCC01、ACSH02、ACTRA02以及CCMP1493)、芬迪湾亚历山大藻(例如菌株CCMP1719和CCMP1979)、海洋原甲藻、微小亚历山大藻(例如菌株 CCMP1888、CCMPl 13, ALSPOU ALSP02 以及 AMD16/AMAD16)、当乌氏亚历山大藻(A.0stenfeldii)以及塔玛亚历山大藻(例如菌株CCMP1771、ATBBO1、ATEBO1、ATCJ33以及ATNWBodo裸甲藻物种的合适的实例包括链状裸甲藻(例如菌株GCTRA01和CS-395)。盾甲藻物种的合适的实例包括巴哈马麦甲藻扁平变种。
[0164]可以通过任何手段“获得”用于本发明的方法的样品。例如，可以通过从天然存在状态(例如来自湖泊、海洋或河流的样品)移除样品，或通过从“非天然”状态(例如在实验室装置、障壁、储集器、贮槽等中的培养物)移除样品获得样品。
[0165]用于本发明的方法的样品可以被怀疑包含一种或多种鞭毛藻，或一种或多种产石房蛤毒素的鞭毛藻。样品可以是比较或对照样品，例如包含已知浓度或密度的鞭毛藻或产石房蛤毒素的鞭毛藻的样品或包含鞭毛藻或产石房蛤毒素的鞭毛藻的一种或多种已知物种或菌株的样品。样品可以是来源于任何来源的。例如，样品可以是环境样品。环境样品可以来源于例如盐水、淡水、河流、湖泊、海洋或沿岸水。环境样品可以来源于鞭毛藻水华。作为替代方案，样品可以来源于实验室来源，如培养物，或商业来源。作为替代方案，样品可以来源于生物来源，如例如组织或生物流体。可以例如通过纯化、稀释或任何其他一种或多种组分的添加将样品从其初始状态改性。
[0166]在某些实施例中，使用本发明的方法测试的样品可以提供关于在填充该样品的来源的动物中石房蛤毒素存在或不存在的信息。例如，可以测试样品以确定在如例如鱼(例如河豚)和尤其是贝类(例如贻贝、蛤蜊、牡蛎、扇贝等)的动物海鲜中石房蛤毒素的存在或不存在。
[0167]用于本发明的方法的聚核苷酸和多肽可以是从呈混合培养物形式或呈个别物种或属分离株形式的微生物分离(即提取)的。因此，可以在提取之前培养样品的微生物或可以直接在给定样品上进行提取。用于分离(即提取)和纯化用于使用本发明的方法的分析的聚核苷酸和多肽的合适的方法通常在本领域中已知并且例如描述在如奥斯贝(编)现代分子生物学实验指南(2007)，约翰.威利父子出版公司；科林根等人(编)现代蛋白科学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology) (2007),约翰.威利父子出版公司；沃克(Walker)(编)(1988),新蛋白质技术:分子生物学方法(New ProteinTechniques:Methods in Molecular Biology),胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西州克利夫顿(Clifton, N.J);以及斯科普斯(Scopes)，R.Κ.(1987)蛋白质纯化:原理与实践(Protein Purification:Principles and Practice),第三版，斯普林格出版社(Springer-Verlag),纽约州纽约市(New York, N.Y.)的标准文本中。另外方法描述在尼兰(Neilan) (1995)应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.>61:2286-2291 中。适合用于本发明的方法中的合适的多肽纯化技术包括(但不限于)逆相色谱、疏水性相互作用色谱、离心、凝胶过滤、硫酸铵沉淀以及离子交换。
[0168]在替代实施例中，可以不从样品分离核酸和/或多肽进行本发明的方法。
[0169]可以使用任何合适的技术进行检测在给定样品中本发明的聚核苷酸和/或本发明的多肽的存在(或确定其不存在)。合适的技术可以典型地涉及对于任何一种或多种本发明的聚核苷酸或任何一种或多种本发明的多肽具有特异性的引物、探针或抗体的使用。合适的技术包括例如聚合酶链式反应(PCR)和此技术的相关变化形式(例如定量PCR)、基于抗体的检验(如ELISA)、免疫印迹法(western blotting)、流动式细胞测量术、荧光显微法等。这些和其他合适的技术通常在本领域中已知并且例如描述在如科林根等人(编)现代蛋白科学实验指南(2007)，约翰?威利父子出版公司；沃克(编)(1988)，新蛋白质技术:分子生物学方法，胡马纳出版社，新泽西州克利夫顿；以及斯科普斯(1987)蛋白质纯化:原理与实践，第三版，斯普林格出版社，纽约州纽约市的标准文本中。
[0170]在优选实施例中，检测给定样品中的本发明的聚核苷酸的存在(或确定其不存在)是通过使用特异性地杂交到聚核苷酸序列的引物利用聚合酶链式反应来扩增提取自相关样品的核酸，和检测扩增的序列实现的。在PCR方法下，可以设计寡核苷酸引物以用于PCR反应中以扩增本发明的聚核苷酸，如例如RNA(例如mRNA)、DNA和/或cDNA聚核苷酸。PCR的合适的方法包括(但不限于)使用成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分地不匹配引物等的那些方法。用于设计PCR和RT-PCR引物的方法通常在本领域中已知并且例如披露在如奥斯贝等人(编)现代分子生物学实验指南(2007)，约翰?威利父子出版公司；马尼亚迪斯等人分子克隆(1982)，280-281 ;英尼斯等人(编)(1990) PCR方案:指导方法和应用，(学术出版社，纽约);英尼斯和盖尔范德，(编)(1995) PCR策略，(学术出版社，纽约)；英尼斯和盖尔范德，(编)(1999) PCR方法手册，(学术出版社，纽约)；以及萨布鲁克等人(1989)分子克隆:实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤的标准文本中。
[0171]有技能的读者将容易地了解到在不影响获得所需产物的能力的情况下，PCR和RT-PCR程序的不同参数可以变化。例如，盐浓度可以变化或变性、退火以及延伸步骤中的一种或多种的时间和/或温度可以变化。类似地，DNA、cDNA或RNA模板的量还可以取决于可供使用的核酸的量或对于有效扩增所需的模板的最佳量变化。用于本发明的方法和试剂盒的引物典型地是寡核苷酸，这些寡核苷酸典型地长度为至少约5个核苷酸至约80个核苷酸，更典型地长度为约10个核苷酸至长度为约50个核苷酸，并且甚至更典型地长度为约15个核苷酸至长度为约30个核苷酸。 [0172]有技能的读者将辨识本发明的引物可以适用于多个不同应用，包含但不限于PCR、RT-PCR以及作为用于本发明的聚核苷酸的检测的探针。可以通过任何合适的方法，包括例如直接化学合成或适当序列的克隆和限制来制备这些引物。并非引物中的所有碱基需要将模板分子的序列反映到其将杂交的引物。引物仅需要含有充足互补碱基以使得引物能够杂交到模板。引物还可以在一个或多个位置包括错配碱基，这些碱基是不与模板中的碱基互补，而是经设计以在碱基延伸或扩增时将变化合并到DNA中的碱基。引物可以包括另外碱基，例如呈在5’末端的限制酶识别序列形式以促进扩增的DNA的克隆。
[0173]本发明的方法涉及检测在给定样品中的本发明的聚核苷酸和/或本发明的多肽的存在(或确定其不存在)。如上文所指出，序列可以包含石房蛤毒素A序列，这些石房蛤毒素A序列包括石房蛤毒素Al、A2、A3或A4催化域序列(或其片段)中的任何一种或多种。优选地，序列包含石房蛤毒素Al和/或石房蛤毒素A4域(或其片段)。更优选地，序列包含石房蛤毒素A4域(或其片段)。
[0174]有技能的读者将辨识可以在进行本发明的方法时使用任何能够扩增本发明的聚核苷酸的引物、任何能够检测本发明的聚核苷酸的探针或任何能够检测本发明的多肽的抗体。在优选实施例中，引物、探针和抗体特异性地结合到前述段落(即正上方的段落)中提及的任何一种或多种石房蛤毒素A序列。
[0175]通过“特异性地结合”，将理解引物、探针或抗体能够以比其结合到不相关序列上更高的亲和力结合到靶向序列上。因此，当暴露于呈潜在结合搭配物形式的多个不同但同样可接入的序列时，对于靶向序列具有特异性的引物、探针或抗体将选择性地结合到靶向序列并且其他替代性潜在结合搭配物将与引物、探针或抗体保持实质上非结合。一般来说，对于靶向序列具有特异性的引物、探针或抗体将比结合到非靶向序列的其他潜在序列上至少10倍，优选地是50倍，更优选地是100倍且最优选地是大于100倍地更频繁地优先结合到靶向序列上。对于靶向序列具有特异性的引物、探针或抗体可以是能够以较弱但可检测的水平结合到非靶向序列上的。这通常被称为背景结合并且例如通过适当对照物的使用容易地分清与特异性结合的差别。
[0176]在优选实施例中，引物、探针或抗体特异性地结合到石房蛤毒素Al或A4催化域聚核苷酸或多肽序列，或其片段。更优选地，引物、探针或抗体特异性地结合到石房蛤毒素A4催化域聚核苷酸或多肽序列，或其片段。
[0177]合适的引物和探针可以特异性地结合到石房蛤毒素Al催化域聚核苷酸序列的任何片段。合适的抗体可以特异性地结合到通过这些聚核苷酸序列编码的石房蛤毒素Al催化域多肽序列的片段。
[0178]合适的引物和探针可以特异性地结合到石房蛤毒素A4催化域聚核苷酸序列的任何片段。仅通过非限制性实例，合适的引物和探针可以特异性地结合到通过以基因库保藏号JF343239 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121定义的石房蛤毒素A4催化域聚核苷酸序列的片段。合适的抗体可以特异性地结合到通过这些聚核苷酸序列编码的石房蛤毒素A4催化域多肽序列的片段。
[0179]在一些实施例中，本发明的方法可以涉及检测在使用PCR扩增的样品中的本发明的聚核苷酸的存在(或确定其不存在)。对于石房蛤毒素A聚核苷酸序列的PCR扩增合适的寡核苷酸引物对可以是能够扩增sxt基因的任何一个或多个催化域或其片段。优选地，弓丨物扩增包含石房蛤毒素A4催化域聚核苷酸序列或其片段的序列。仅通过非限制性实例，对于此目的合适的引物对可以包含第一引物，其包含SEQ ID NO: 198的聚核苷酸序列或其片段或变异体，和/或第二引物，其包含SEQ ID NO: 199的聚核苷酸序列或其片段或变异体。合适的引物对的其他非限制性实例包括以SEQ ID NO:200-211,220-223,228-229以及243-244所示的那些引物对(包括这些引物对序列的片段和变异体)。
[0180]有技能的读者将辨识例示的引物一般来说并不打算限制石房蛤毒素A基因扩增的区域或本发明的方法。有技能的读者还将辨识本发明不限于例示的特异性引物的使用，并且还可以使用替代性引物序列，条件是恰当地设计引物以实现石房蛤毒素聚核苷酸序列，优选地石房蛤毒素A聚核苷酸序列，并且更优选地石房蛤毒素Al和/或A4域聚核苷酸序列的扩增。
[0181] 在其他实施例中，本发明的方法可以涉及通过合适的探针的使用检测在样品中的本发明的聚核苷酸的存在(或确定其不存在)。本发明的探针基于本发明的sxt聚核苷酸序列。探针是典型地通过杂交用于同源序列的检测的具有例如在约10个核苷酸与几千个核苷酸之间的可变长度的核苷酸序列。本发明的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸。可以通过标记物的结合标记本发明的探针以便于这些探针的检测。合适的标记物的实例包括荧光分子(例如乙酰氨基芴、5-溴脱氧尿苷、地高辛、荧光素)和放射性同位素(例如32P、35S、3H、33P)。可以例如通过化学、光化学、免疫化学、生物化学或光谱技术实现标记物的检测。用于核苷酸探针的设计和/或生产的方法通常在本领域中已知，并且例如描述在如罗宾逊(Robinson)等人.(编)流式细胞仪实验指南(CurrentProtocols in Cytometry)约翰.威利父子出版公司；奥斯贝等人(编)现代分子生物学实验指南(2007)，约翰.威利父子出版公司；萨布鲁克等人(1989)分子克隆:实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤；以及马尼亚迪斯(Maniatis)等人(1982)分子克隆(Molecular Cloning), 280-281 的标准文本中。
[0182]在其他实施例中，本发明的方法可以涉及检测在使用抗体的样品中的本发明的多肽的存在(或确定其不存在)。抗体可用于定性地或定量地检测和分析给定样品中的一种或多种本发明的STX多肽。抗体可以结合到允许例如通过流动式细胞测量术、免疫组织化学法或本领域中已知的其他方法进行检测的荧色物。可替代地,抗体可以结合到允许比色或化学发光检测的底物。本发明还涵盖能够结合到能够特异性地结合到本发明的多肽的一种或多种抗体的二级抗体的使用。[0183]用于检测鞭毛藻的试剂盒
[0184]本发明还提供用于本发明的聚核苷酸和/或本发明的多肽的检测和/或分离的试剂盒(“本发明的试剂盒”)。
[0185]在某些实施例中，试剂盒用于检测样品中的鞭毛藻。
[0186]在其他实施例中，试剂盒用于检测样品中的产石房蛤毒素鞭毛藻。
[0187]在其他实施例中，试剂盒用于确定样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在。
[0188]一般来说，本发明的试剂盒包含至少一种用于检测一种或多种本发明的聚核苷酸和/或一种或多种本发明的多肽，和/或其变异体或片段的存在的试剂(参见名称为“聚核苷酸和多肽”的以上部分中的描述)。可以在试剂盒中包括任何适合于此目的的试剂。合适的试剂的非限制性实例包括如在名称为“探针、引物以及抗体”和“用于检测鞭毛藻的方法”的部分中的上文所描述的那些引物、探针和抗体。
[0189]在优选实施例中，试剂盒用于本发明的方法(参见名称为“用于检测鞭毛藻的方法”的以上部分中的描述)。
[0190]在一些实施例中，本发明提供一种用于样品中的鞭毛藻的检测的试剂盒，该试剂盒包含至少一种用于检测样 品中的一种或多种本发明的聚核苷酸和/或一种或多种本发明的多肽和/或任一者的变异体或片段的存在的试剂。优选地，鞭毛藻是产石房蛤毒素的鞭毛藻。
[0191]在其他实施例中，本发明提供一种用于确定样品中的鞭毛藻的不存在的试剂盒，该试剂盒包含至少一种用于确定样品中的一种或多种本发明的聚核苷酸和/或一种或多种本发明的多肽和/或任一者的变异体或片段的不存在的试剂。优选地，鞭毛藻是产石房蛤毒素的鞭毛藻。
[0192]一般来说，本发明的试剂盒可以包含任何数目的另外组分。通过非限制性实例，另外组分可能包括用于收集和/或存储样品的组分、用于细胞培养的试剂、参考样品、缓冲剂、标签和/或用于进行本发明的方法的书面说明书。
[0193]使用本发明的试剂盒在样品中检测到的或确定在样品中不存在的鞭毛藻可以是产石房蛤毒素的鞭毛藻。没有施加任何具体的限制，鞭毛藻可以是来自膝沟藻目或裸甲藻目的。鞭毛藻可以是来自亚历山大藻(以前为膝沟藻)、盾甲藻或裸甲藻属的。亚历山大藻物种的合适的实例包括链状亚历山大藻(例如菌株ACCC01、ACSH02、ACTRA02以及CCMP1493)、芬迪湾亚历山大藻(例如菌株CCMP1719和CCMP1979)、海洋原甲藻、微小亚历山大藻(例如菌株CCMP1888、CCMPl 13、ALSP01、ALSP02以及AMD16/AMAD16)、当乌氏亚历山大藻(A.0stenfeldii)以及塔玛亚历山大藻(例如菌株CCMP1771、ATBBOl、ATEBOl、ATCJ33以及ATNWB01)。裸甲藻物种的合适的实例包括链状裸甲藻(例如菌株GCTRA01和CS-395)。盾甲藻物种的合适的实例包括巴哈马麦甲藻扁平变种。
[0194]本领域的普通技术人员将了解在不脱离概括地描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如具体实施例中所述的本发明做出许多变化和/或修改。因此将本发明实施例在各方面视为例示性并且非限制性的。
[0195]实例
[0196]现在将参考具体实例描述本发明，这些实例不应被理解为以任何方式限制性的
[0197]实例1:鞭毛藻中的神经毒素石房蛤毒素的核编码基因的鉴别[0198]材料和方法
[0199]-培养和毒素测量
[0200]从不同培养物保藏(表1)获得产石房蛤毒素和非产石房蛤毒素的鞭毛藻培养物。
[0201]表1.用于此研究的鞭毛藻菌株、这些菌株的STX生产以及sxtAl和sxtA4片段是否从其基因组DNA扩增的清单。
[0202]
【权利要求】
1.一种用于检测样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的方法，该方法包括: 获得用于该方法的一种样品，并且 分析该样品中鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸编码的多肽中的一种或多种的存在， 其中所述聚核苷酸或多肽的存在指示该样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的存在。
2.—种用于确定样品中产石房蛤毒素的鞭毛藻不存在的方法，该方法包括: 获得用于该方法的一种样品，并且 分析该样品中鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸编码的多肽中的一种或多种的存在， 其中所述聚核苷酸或多肽的不存在指示该样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该聚核苷酸包含石房蛤毒素A核苷酸序列，该石房蛤毒素A核苷酸序列选自以SEQ ID N0:5-197、224-227、230-242以及247中的任一种所示的那些序列或那些序列中的任一种的片段或变异体。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该聚核苷酸包含石房蛤毒素Al催化域序列、石房蛤毒素A4催化域序列或其片段。
5.根据权利要求4所述的方法，其中该石房蛤毒素A4催化域序列或其片段包含以SEQID N0:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID NO:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或变异体。
6.根据权利要求4所述的方法，其中该石房蛤毒素Al催化域序列包含以SEQID NO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或变异体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述分析包括通过聚合酶链式反应来扩增来自该样品的聚核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚合酶链式反应利用一种或多种引物，该一种或多种引物包含以 SEQ ID NO: 198-199,200-211,220-223,228-229 以及 243-244 中的任一种所示的序列或那些序列中的任一种的片段或变异体。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该多肽包含以SEQIDNO:2或SEQ IDNO:4所示的石房蛤毒素A氨基酸序列或二者之一的序列的片段或变异体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中该产石房蛤毒素的鞭毛藻是来自亚历山大藻(Alexandrium)、盾甲藻(Pyrodinium)或裸甲藻(Gymnodinium)属。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该产石房蛤毒素的鞭毛藻是选自下组，该组由以下各项组成:链状亚历山大藻(A.catenella)、芬迪湾亚历山大藻(A.fundyense)、无菌亚历山大藻(A lusitanicum)、微小亚历山大藻(A.minutum)、当乌氏亚历山大藻(A.0stenfeldii)、塔玛亚历山大藻(A.tamarense)、链状裸甲藻(G.catenatum)以及巴哈马麦甲藻扁平变种(P.bahamense var compressum)。
12.一种用于检测样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的试剂盒，该试剂盒包含至少一种用于检测鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸编码的多肽的存在的试剂。
13.一种用于确定样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在的试剂盒，该试剂盒包含至少一种用于检测鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸编码的多肽的存在的试剂。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的试剂盒，其中该试剂特异性地结合到包含石房蛤毒素A核苷酸序列的聚核苷酸上，该石房蛤毒素A核苷酸序列选自以SEQ IDNO:5-197,224-227,230-242以及247中的任一种所示的那些序列或那些序列中的任一种的片段或变异体。
15.根据权利要求12或权利要求13所述的试剂盒，其中该试剂特异性地结合到包含石房蛤毒素Al催化域序列、石房蛤毒素A4催化域序列或其片段的聚核苷酸上。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中该石房蛤毒素A4催化域序列或其片段包含以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或变异体。
17.根据权利要求15所述的试剂盒，其中该石房蛤毒素Al催化域序列包含以SEQIDNO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或变异体。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的试剂盒，其中该试剂是一种引物、探针或抗体。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的试剂盒，其中该试剂是包含以SEQIDNO: 198-199,200-211,220-223,228-229以及243-244中的任一种所示的序列或那些序列中的任一种的片段或变异体的引物。
20.根据权利要求12或权利要求13所述的试剂盒，其中该试剂特异性地结合到以SEQID NO:2或SEQ ID N0:4所示的石房蛤毒素A氨基酸序列或二者之一的序列的片段或变异体上。
21.一种分离的聚核苷酸，包含以SEQ ID NO:1所示的序列或其变异体或片段。
22.—种分离的聚核苷酸，包含以SEQ ID NO:3所示的序列或其变异体或片段。
23.一种分离的聚核苷酸，包含以SEQ ID N0:5-197、224-227、230-242以及247中的任一种所示的序列或那些序列中的任一种的变异体或片段。
24.一种分离的多肽，由根据权利要求21至23中任一项所述的聚核苷酸编码。
25.一种用于检测样品中的产石房蛤毒素的鞭毛藻的引物对，其中所述引物对包含: 包含SEQ ID NO: 198的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO: 199的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或 包含SEQ ID NO: 200的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO:201的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:202的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO:203的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:204的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO:205的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:206的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO:207的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:208的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO:209的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或包含SEQ ID N0:210的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO:211的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:220的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO:221的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:222的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO:223的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:228的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO:229的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:243的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第一引物，和包含SEQID NO:244的聚核苷酸序列或由该聚核苷酸序列组成的第二引物。
【文档编号】C12Q1/68GK103748235SQ201280023720
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年5月16日 优先权日:2011年5月16日
【发明者】布雷特·A·尼兰, 肖纳·安·默里, 安可·斯图克恩, 谢蒂尔·S·雅各布森, 拉塞尔·J·S·奥尔, 拉尔夫·凯尔曼 申请人:新南创新有限公司, 奥斯陆大学