专利名称：一种提高柑橘渣饲料蛋白水平的脱水固态组合菌剂及其制作方法
技术领域：
本发明属于生物发酵领域，特别涉及植物废弃物的再利用领域和生物饲料领域。
背景技术：
柑橘属，或写作柑桔属，属于芸香科，包括橘、柑、柚、橙、柠檬等，在世界上主要分布在北纬35°以南的区域。柑橘属植物具单身复叶，结成具有革质果皮的柑子果实。柑橘属果实渣是指柑子果实加工榨汁或者制罐头后的下脚料，占柑子果实的重量大约25-50%。柑橘属果实渣的主要成分是不溶于水的碳水化合物(包括果胶、纤维素、半纤维素)、可溶性糖及苦味物质等有机物。其可提供微生物生长的碳源和能源。我国是柑橘属水果的故乡，每年有大量的柑橘属水果用于生产、加工。特别是近年来，随着农业产业结构调整和农业现代化的发展，其产业发展势头迅猛，产量显著提高，柑橘属水果已成为农业经济的支柱产业之一，为促进农村经济、有效改善生态环境做出了积极贡献。与此同时，伴随着柑橘属水果产业发展，果实被大量加工处理，导致柑橘属果实渣的产量特别大，柑橘属果实渣资源的存量丰富。但是，柑橘属果实渣中的果皮，蛋白质含量不高，适口性差，动物吸收低，大量的柑橘渣并没有获得综合的利用，导致柑橘渣废弃物处理成本日益攀升。目前通常的处理方法是将柑橘渣以填埋方式或排入江河，造成严重的环境污染。因此，柑橘渣的资源化利用成为人们关注的热点。随着养殖业的快速发展，饲料资源相对短缺，加之我国人多地少，人畜争粮的矛盾日益突出。每年需要消耗大量的外汇购买粮食，导致畜牧饲料成本不断增加。充分合理地利用农副产品下脚料不仅能减轻环境污染，而且可以一定程度上缓解饲料资源的短缺问题，降低饲料成本。向柑橘渣中添加合适的营养物质，经微生物发酵可以将部分无机物转化为单细胞蛋白质，同时产生大胆量的B族微生素和多种酶，提高柑橘渣的营养价值。因此，以柑橘渣为原料，利用微生物发酵生产单细胞蛋白饲料，对解决我国饲料资源短缺、提高柑橘渣种植及加工工业效益，减少环境污染均有重要意义及应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于提供黑曲霉的新应用，该应用为补充柑橘属果实和/或柑橘属果实渣中的蛋白提供了思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为:黑曲霉作为菌剂与柑橘属果实和/或柑橘属果实渣共培养在制备生物饲料中的应用。优选的，所述黑曲霉和/或白地霉和/或米酒酵母作为菌剂与柑橘属果实渣共培养在制备生物饲料中的应用。
本发明的目的之二在于提供一种组合菌剂，其在柑橘属果实和/或柑橘属果实渣发酵中能协同补充发酵物中的粗蛋白。为实现上述目的，本发明的技术方案为:组合菌剂，按数量计由白地霉、米酒酵母和黑曲霉按3-5: 0-4: 5-10的比例混合。优选的，所述的组合菌剂，按数量计由白地霉、米酒酵母和黑曲霉按4:1: 5的比例混合。优选的，所述的组合菌剂，将白地霉、米酒酵母和黑曲霉混合，得混合物，将混合物低温脱水干燥，然后粉碎。本发明的目的之三在于提供本所述组合菌剂的制备方法，该方法工艺稳定，成本低。为实现上述目的，本发明的技术方案为:所述的组合菌剂的制备方法，具体包括如下步骤:米酒酵母菌的菌液的制备:将柑橘属果实和/或柑橘属果实渣烘干后粉碎，过40目筛，制成粉末；每升柑橘果实废弃物浸提液，由柑橘果实废弃物300克加水至I升充分搅拌均匀，除渣，得柑橘果实废弃物浸提液；按下述比例和方法制备米酒酵母菌的液体培养基:红糖30g，KH2PO4L 0g, MgSO4.7H200.5g，(NH4) 2S042.0g，加入柑橘果实废弃物浸提液浸提液1L组成，高压蒸汽灭菌，得米酒酵母菌的液体培养基；冷却后按5-10%的接种量接种米酒酵母菌种，28°C下液体深层通气发酵72小时，得米酒酵母菌的菌液，米酒酵母菌的菌液中的米酒酵母菌数量≥1O9Cfu/mL ；或将麦麸和水以重量比为1: 0.8-1的比例混合，充分搅拌均匀，高压蒸汽灭菌，冷却至30°C，得培养基A ;将米酒酵母菌液按0.5-2%的接种量接种，置于发酵床上，料层厚度5-lOcm，28°C _30°C下固体通气发酵72小时，得米酒酵母菌的菌剂，烤干后的米酒酵母菌剂中的酵母菌数量应≥ 109cfu/g ；黑曲霉菌的菌剂的制备:按0.5%的接种量接种黑曲霉菌与所述培养基A中，置于发酵床上，料层厚度5-10cm，28°C下通气发酵72小时，得黑曲霉菌的菌剂，黑曲霉的菌液中的黑曲霉菌数量应≥109cfu/g ；白地霉菌的菌剂的制备:按0.5%的接种量接种黑曲霉菌至所述培养基A，置于发酵床上，料层厚度5-10cm，28°C下通气发酵72小时，得白地霉菌的菌剂，白地霉的菌剂中的孢子数量应≥109cfu/g ；将所述米酒酵母菌的菌剂、黑曲霉菌的菌剂和黑曲霉菌的菌剂单独进行低温脱水干燥，并混合，得组合菌剂。接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。本发明的目的之四在于提供一种生物饲料的制备方法，该方法制备的饲料成本低，营养价值高，适用于工业化应用。柑橘属果实渣制备生物饲料的方法，具体包括以下步骤:A固体培养基的制备将柑橘属果实渣灭菌，得固体培养基；B 发酵将所述黑曲霉和/或白地霉和/或米酒酵母作菌剂，按4-6%的接种量接种至所述固体培养基中，得发酵产物；或将所述组合菌剂按4-6%的接种量接种至所述固体培养基中，得发酵产物；所述菌剂或组合菌剂> 109cfu/mL，发酵温度为28-30°C，发酵时间为48-72小时。优选的所述的柑橘属果实渣制备生物饲料的方法，将橘皮渣和麦麸干燥并粉碎后以80: 14-16重量比充分混合后，灭菌，得固体培养基。本发明的目的之五在于提供上述方法制备的产物及其应用，该产物富含蛋白质高，该应用为降低饲料成本提供了新思路。所述的橘皮渣的再利用方法所得的发酵产物。所述的发酵产物在制备饲料原料中的应用。本发明的有益效果在于:1)选择适宜于柑橘属果实渣生长的菌种，按照菌种间相容性特点而筛选到最佳组合的菌剂。2所述组合菌剂制备为风干菌种产品，可长时间保存。菌剂成本低廉、使用方便，使用者只需结合生产实际，配比柑橘渣固态基质原料，添加适量复合发酵剂，然后进行适当温度培养即可以得到合格的发酵产品。3)采用本发酵工艺后，发酵产物粗蛋白含量可达10.12%，较未发酵时的6.47%提高了 56.41%，蛋白含量明显提闻。
图1为白地霉与米酒酵母不同比例混合接种对粗蛋白含量的影响分析图。图2为白地霉、与米酒酵母与黑曲霉不同比例混合接种对粗蛋白含量的影响分析图。
具体实施例方式所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。柑橘果实废弃物:柑橘果实渣是指柑橘果实加工榨汁或者制罐头后的下脚料，占柑子果实的重量大约25-50%。柑橘果实渣的主要成分是不溶于水的碳水化合物(包括果胶、纤维素、半纤维素)、可溶性糖及苦味物质等有机物。实施例中，以制备果汁之后的柑橘果实渣作为柑橘果实废弃物。下述实施例中提及的接种量是指接入的种子液或菌剂的质量和接种后培养基的质量比例。实施例1菌种与柑橘果实渣共培养菌种与柑橘果实渣共培养主要按照平板点种实验方法执行，筛选最适应柑橘渣生长的菌种。平板点种试验参考文献“陈松，丁立孝，张莉，王天龙，朱英莲，2008.发酵苹果渣生产蛋白质饲料的混合菌种的筛选[J].食品与发酵工业，2008，34(2):94-96”执行。柑橘渣平板培养基的制备参考文献“刘树立，2008.D增加柑橘皮渣发酵饲料粗蛋白含量的菌种筛选研究”执行，并作适当改进。柑橘渣限制性平板培养基为:柑橘渣3g，琼脂2g, IOOmL营养液，115°C 灭菌20min，混合均匀倒平板；其中的营养液配制(g/L):NaCl0.50g, MgSO40.50g, (NH4) 28043.0Og, KH2PO4L OOg, CaCl20.30g, FeSO4 7H200.0lg,MnSO4 7H200.015g, ZnSO4 7H200.015g, CoCl20.0lg，蒸馏水 IL0 共培养的菌种分别有 I)益生细菌:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans),地衣芽抱(Bacillus licheniformis),腊样芽抱杆菌(Bacillus cereus),动物乳酸杆菌(Lactici Iactis),植物乳酸杆菌(Lactici plantarum)。2)丝状真菌:米曲霉(Aspergillus oryzae,编号 CICC2013),米根霉(Rhiizopus oryzae,编号 CICC3037),绿色木霉(Trichoderma viride，编号CICC40502，购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；构巢曲霉(Aspergillus nidulans，编号M4)，米根霉保存菌种(编号M1，M2，M3)。3)酵母菌:产月元假丝酵母(Candida utilis,编号 CICC1422),酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,编号CICC31362),市售曲子酵母,安琪酵母(Saccharomyces angel)。培养条件为细菌在37°C、真菌28°C _30°C，经过72小时培养之后观察记录各种菌种的生长，平板点种试验结果如表I所示。表I微生物平板点种试验的生长情况
权利要求
1.黑曲霉作为菌剂与柑橘属果实和/或柑橘属果实渣共培养在制备生物饲料中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述黑曲霉和/或白地霉和/或米酒酵母作为菌剂与柑橘属果实渣共培养在制备生物饲料中的应用。
3.组合菌剂，其特征在于，按数量计由白地霉、米酒酵母和黑曲霉按3-5: 0-4: 5-10的比例混合。
4.根据权利要求3所述的组合菌剂，其特征在于，按数量计由白地霉、米酒酵母和黑曲霉按4: 1: 5的比例混合。
5.根据权利要求3所述的组合菌剂，其特征在于，将白地霉、米酒酵母和黑曲霉混合，得混合物，将混合物低温脱水干燥，然后粉碎。
6.权利要求3所述的组合菌剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤: 米酒酵母菌的菌液的制备:将柑橘属果实和/或柑橘属果实渣烘干后粉碎，过40目筛，制成粉末；每升柑橘果实废弃物浸提液，由柑橘果实废弃物300克加水至I升充分搅拌均匀，除渣，得柑橘果实废弃物浸提液；按下述比例和方法制备米酒酵母菌的液体培养基:红糖30g，KH2PO4L 0g, MgSO4.7H200.5g，(NH4) 2S042.0g，加入柑橘果实废弃物浸提液浸提液IL组成，高压蒸汽灭菌，得米酒酵母菌的液体培养基；冷却后按5-10%的接种量接种米酒酵母菌种，28°C下液体深层通气发酵72小时，得米酒酵母菌的菌液，米酒酵母菌的菌液中的米酒酵母菌数量≥109Cfu/mL ； 或将麦麸和水以重量比为1: 0.8-1的比例混合，充分搅拌均匀，高压蒸汽灭菌，冷却至30°C，得培养基A ;将米酒酵母菌液按0.5% -2%的接种量接种，28°C _30°C下固体通气发酵72小时，得米酒酵母菌的菌剂，烤干后的米酒酵母菌剂中的酵母菌数量应≥109Cfu/g ; 黑曲霉菌的菌剂的制备:按0.5%的接种量接种黑曲霉菌与所述培养基A中，28°C下固体通气发酵72小时，得黑曲霉菌的菌剂，黑曲霉的菌剂中的黑曲霉菌孢子数量应≥109Cfu/g ; 白地霉菌的菌剂的制备:按0.5%的接种量接种黑曲霉菌至所述培养基A，28°C下固体通气发酵72小时，得白地霉菌的菌剂，白地霉的菌剂中的霉菌孢子数量应≥109cfu/g ； 将所述米酒酵母菌的菌剂、黑曲霉菌的菌剂和黑曲霉菌的菌剂单独进行低温脱水干燥，并混合，得组合菌剂。
7.柑橘属果实渣制备生物饲料的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: A固体培养基的制备 将柑橘属果实渣灭菌，得固体培养基； B发酵 将所述黑曲霉和/或白地霉和/或米酒酵母作菌剂，按4-6 %的接种量接种至所述固体培养基中，得发酵产物；或将所述组合菌剂按4-6%的接种量接种至所述固体培养基中，得发酵产物；所述菌剂或组合菌剂≥109cfu/g，发酵温度为28-30°C，发酵时间为48-72小时。
8.根据权利要求7所述的柑橘属果实渣制备生物饲料的方法，其特征在于，将橘皮渣和麦麸干燥并粉碎后以80: 14-16的重量比充分混合后，灭菌，得固体培养基。
9.基于权利要求8所述的橘皮渣的再利用方法所得的发酵产物。
10.权利要求9所 述的发酵产物在制备饲料原料中的应用。
全文摘要
本发明属于生物发酵技术领域，主要涉及柑橘渣废弃物的再利用领域和生物饲料领域；本发酵剂的技术要点筛选适用于柑橘渣上生长的黑曲霉、白地霉和米酒酵母；复苏并分别扩大生产种子菌的固态培养物，经低温脱水干燥；根据固态种子菌产品中微生物的含量，按照一定比例混合均匀，形成含有足够量的活性米酒酵母菌、黑曲霉孢子、白地霉孢子的复合固态生物发酵剂。用该复合发酵剂发酵柑橘渣的产品是一种很好的饲料原料；菌剂成本低廉、使用方便，企业只需结合生产实际，配比柑橘渣固态基质原料，添加适量复合发酵剂，然后进行适当温度培养即可以得到合格的发酵产品；将发酵产品用作饲料原料，可以节约粮食，提高养殖业经济效益。
文档编号C12N1/00GK103098981SQ20131003408
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者杨柳, 郑华, 张邑帆, 姚焰础, 付利之, 周晓容, 杨飞云 申请人:重庆市畜牧科学院