专利名称：一种用于微生物燃料电池的产电基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物燃料电池产电基因工程菌的构建、菌株及其应用。
背景技术：
随着全球人口和经济规模的不断增长，能源与环境问题成为21世纪人类面临的最严重挑战。我们必须开发一个全新的能量平台，在确保产生足够能量的同时降低CO2的释放问题。微生物燃料电池的问世让我们看到了曙光。微生物燃料电池因其降解有机污染物的同时收获电能的突出特点受到广泛关注，可应用于污水处理、能源再生、生物传感、生物修复等方面。微生物燃料电池(Microbial Fuel Cells，MFC)是一种利用微生物分解代谢各种生物质燃料，将储存在燃料中的化学 能直接转化为电能的装置，在生物质转化中具有突出的应用前景。铜绿假单胞菌是已被应用在微生物燃料电池中的电化学效率高的细菌之一。Zfe如^等以铜绿假单胞菌为阳极微生物，以铁氰化钾为阴极电子受体，功率密度达到
3.1 4.2W/m2，研究表明假单胞菌可以通过自身分泌物或代谢产物作为电子传递介体。之后发现铜绿假单胞菌可以产生的电子传递体-绿脓菌素，所以铜绿假单胞菌可以更有效的将电子从细胞传递到电子受体阳极上。因此，铜绿假单胞菌应用于微生物燃料电池上会有更加优良的电化学效率。另外，铜绿假单胞菌PAOlaeruginosa PAOI)是一株模式微生物菌株，由于其遗传操作系统简单清晰，基因操作工具全面，是常用于基因克隆、表达的革兰氏阴性菌株之一。
产电微生物催化消耗碳源，转移释放的电子到微生物燃料电池的阳极是通过细胞外电子传递机制(EET )。2011年，Yang-Chun Yong研究了过表达铜绿假单胞菌的群体效应机制的相关基因可以提高菌体的电子传递效率。T.Zhang构建了大肠杆菌基因工程菌来提高EET,以提高其产电能力。然而，微生物内低的电量输出却是微生物燃料电池产能的一个主要瓶颈。2QYZ年,Yang-Chun 1 1"研究表明增加微生物本身可释放电子量和产电能力是一个关键，而提高NAD (H)的水平可以增加微生物自身的产电子能力。L.，D通过研究提出η—在NAD+的合成中起着关键的作用，其过表达可以提高2倍的NAD (H)水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的用于微生物燃料电池的产电基因工程菌的构建方法和菌株，为微生物燃料电池铜绿假单胞菌的基因工程研究奠定基础。本发明的另一个目的是提供上述基因工程菌的应用。为实现本发明的技术目的，本发明以铜绿假单胞菌PAOl为出发菌，重组表达NAD+从头合成途径与回补途径中共同的关键基因获得产电基因工程菌，重组菌株的NAD+合成途径如图1所示。具体步骤如下:1)以大肠杆菌基因组DNA为模板，纯化扩增出Ζ^ /Ε基因，经T-A克隆插入到T载体PMD19-T Simple相应的位点之间、经测序，比对正确，获得中间重组质粒pMD19-T-/ ai/E ；
2)以中间重组质粒pMD19-T-/ ai/E为模板，纯化扩增出aai/E基因，插入到表达质粒pBBRlMCS-5相应的酶切位点之间、连接获得重组质粒pBBRlMCS-/ ai/E ；
3)将构建重组质粒pBBRlMCS-/ ai/E经电击转化导入出发菌铜绿假单胞菌PAOl的感受态，经50 μ g/mL的庆大霉素筛选得到阳性转化子即为产电基因工程菌。上述的构建方法构建得到的一株产电基因工程菌菌株，其分类命名为铜绿假单胞菌iPsoudomorms aeruginosa) PA-nadE,已于2013年I月20日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号编号为=CCTCC NO:M 2013028。所述产电基因工程菌菌株的应用，其特征在于包括如下步骤:
1)菌种活化:将产电基因工 程菌的菌液划线到含有庆大霉素的LB平板，挑取平板上长出的单菌落到LB培养基的试管，在37°C下培养过夜；其中，所述的LB培养基为:蛋白胨10g.L—1，酵母提取物5 g.L—1，氯化钠10 g.L_S pH=7.0，如果需要固体培养基，则另加入15g.L—1琼脂粉；含有庆大霉素的平板是在LB培养基中加入50 μ g/mL庆大霉素和15 g.Γ1琼脂配置而成；
2)种子培养:将步骤I)活化的菌种按照体积比2%的接种量接入LB培养基中，在37°C有氧培养菌体OD6tltl至0.43时加入终浓度0.69mM的IPTG在30°C情况下诱导至0D6(I(I=6 ；
3)微生物燃料电池中产电:将步骤2)中的种子液按接种量体积比85%转接至微生物燃料电池阳极液中，之后将20ml混合液(混合液是菌液与阳极液的混合液)接入单室微生物燃料电池中，产电；其中，阳极液为:葡萄糖10 g/L, PBS缓冲液50mmol/L。有益效果:采用基因工程手段将大肠杆菌NAD+从头合成途径与回补途径中共同的关键基因在铜绿假单胞中进行重组表达，获得产电量高的基因工程菌株，应用于微生物燃料电池领域的发展，并且为产电铜绿假单胞菌的基因工程研究奠定了良好的基础。
图1重组菌株NAD+从头合成途径与回补途径图。图2 NAD合成酶基因PCR扩增产物的电泳图。图3中间重组质粒pMD19-T-/ ai/E构建图谱。图4重组质粒pBBRlMCS-/ ai/E的构建图谱。图5中间重组质粒pMD19-T-/ ai/E的目的基因PCR鉴定图。图6重组质粒pBBRlMCS-/ ai/E的目的基因PCR鉴定图。图7重组质粒pBBRlMCS-/ ai/E的BsiW I和I双酶切鉴定图，其中:1:pBBRlMCS-/ ai/E，2 5:pBBRlMCS-/ ai/E 双酶切，M:DL15000 DNAMarker0图8 NADH标准曲线。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来对本发明作详细说明，这些实施例仅用于说明本发明，其对本发明没有任何方式的限制。以下实施例中所使用的技术，包括PCR、酶切等分子生物学手段，以及菌株培养、转化、保存等，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、菌株等，除非本说明特别说明，均为本领域的研究与技术人员可以通过公共途径获得的。本发明的生物材料的来源的说明:
1、质粒来源:
(1)PMD19-T Simple:购自 TaKaRa 公司；
(2)pBBRlMCS-5:购自 Biovector 公司；
2、基因组模板来源:自行通过TIANGEN公司购买的基因组提取试剂盒提取。3、引物的设计及合成:自行设计并外包金斯瑞生物技术公司合成。实施例1
本实施例说明构建包含目的基因仙现的中间质粒pMD19-T-/ ai/E。其过程包括:
1、设计合成上游、下游引物，
Primerl 上游引物:5’ -CGCTGTCTGGAGGGTTCAATGAC -3’
Primer2 下游引物:5’ - CGCACAATCCAATATGTGC -3’。2、以大肠杆菌疋colimb α基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为:94 ° C 预变性 3min;94 ° C 30s, 52 ° C 30s, 72 ° C 70s, 72 ° C 5 min，30 个循环。PCR产物经0.8%的琼脂糖电泳检测(图2)，回收828bp的片段，通过Genray公司的试剂盒纯化扩增出的aai/E基因(Gene ID: 946946)后，根据购买的PMD19-T Simple质粒操作说明书进行T-A克隆，将目的基flai/E连接到测序载体PMD19-T Simple质粒，之后按常规的化学转化方法导入大肠杆菌中，涂布于含10 μ g/mL氨节霉素的LB平板上37°C培养，挑取平板上单菌落转化子进行PCR验证见图3，选择正确的转化子测序，比对正确。实施例2
本实施例说明构建包含表达基因aai/E重组质粒pBBRlMCS-/ ai/E。其过程为基因仙呢的重组质粒pBBRlMCS-/ ai/E的构建:
1、合成带有历.ζ /ΙΙΙ酶切位点的上游引物和带有汉3Μ1Ι酶切位点的下游引物:
Primer3 上游引物:5’_ CCCAAGCTTATGACATTGCAACAAC -3’(下划线部分为历fli/III 酶
切位点)；
Primer4 下游引物:5’ - CGCGGATCCTTACTTTTTCCAGAAATC -3 (下划线部分为汉.ΗΙ 酶切位点)；
2、以pMD19-T-/ ai/E为模板，PCR扩增目的基因(GeneID: 946946)，反应条件为:95°C, 10 min ； (95°C 30 s,52°C 30 s,72°C 70s，30 个循环)；72°C，10 min。通过 Genray公司的纯化试剂盒纯化扩增出的带酶切位点的基因后，与经同样酶切位点酶切的pBBRlMCS-5表达质粒连接，经电击转化导入出发菌铜绿假单胞菌PAOl的感受态，感受态及电转条件参照Biorad公司电转仪说明书，之后涂布于50 μ g/mL庆大霉素的LB平板上37°C培养，提取平板上单菌落阳性转化子，经PCR验证和酶切验证结果见图6、7表明，重组质粒pBBRlMCS-/ ai/E构建成功，获得的产电基因工程菌。实施例3
本实施例说明构建的产电基因工程菌的全细胞蛋白液的NAD+合成酶的酶活。1、蛋白浓度的测定蛋白浓度采用Bradford (1976)的方法测定。2、NADH标准曲线的制作。用50mmol/L Tris-HCl缓冲液中将NADH稀释成8个不同浓度梯度(0.3,0.4,0.5、
0.6、0.7、0.8、1.0、1.1mM)，分别测定340nm的吸光度值，然后以OD34tl值为纵坐标，NADH浓度为横坐标，绘制标准曲线(见图8)。3、NAD+合成酶的酶活测定
O菌种活化:划线保藏的产电基因工程菌PA-nadE的菌液到含有50 μ g/mL庆大霉素的LB平板，挑取平板上长出的单菌落到5mL LB培养基(pH=7.0)的试管，在37°C下培养过夜；
其中，所述的LB培养基为:蛋白胨10 g.L—1,酵母提取物5 g.L_\氯化钠10 g.L_SpH=7.0。含有庆大霉素的LB平板的配方为:蛋白胨10 g.!/1，酵母提取物5 g.!/1，氯化钠 10 g.ΙΛ 庆大霉素 50 μ g/mL, 15 g.I71 琼脂。2)种子培养:按照体积比2%的接种量接入LB培养基中，在37°C有氧培养菌体OD600至0.43时加入终浓度0.69mM的IPTG在30°C情况下诱导诱导5.7h和10.2h时，取菌样制备粗酶液；
3)酶活测定:总体积 100ul，50mmol/L Tris-HCl (pH8.5)缓冲液中含有 2 mM ATPU mMnicotinic acid dinucleotide (NaAD)、20 mM KCl > 10 mM MgCl2、10 mM NH4Cl >0.2 mg/mlBSAJp 40ul酶溶液在37° C反应5min，加入等体积的0.1 M焦磷酸钠缓冲液(包含0.5%(w/v)盐酸氨基脲)终止反应,再加入1%乙醇,加2ul的乙醇脱氢酶，取上清在340nm测吸光率。结果见表I。由表I中数据可以看出，重组A aeruginosa PA-nadE中NAD合成酶的酶活较出发菌株A aeruginosa PAOl的酶活高出约3倍。表I
权利要求
1.一种产电基因工程菌菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤: 1)以大肠杆菌基因组DNA为模板，纯化扩增出基因，经T-A克隆插入到T载体PMD19-T Simple相应的位点之间、经测序，比对正确，获得中间重组质粒pMD19-T-/ ai/E ； 2)以中间重组质粒pMD19-T-/ ai/E为模板，纯化扩增出aai/E基因，插入到表达质粒pBBRlMCS-5相应的酶切位点之间、连接获得重组质粒pBBRlMCS-/ ai/E ； 3)将构建重组质粒pBBRlMCS-/ ai/E经电击转化导入出发菌铜绿假单胞菌PAOl的感受态，经50 μ g/mL的庆大霉素筛选得到的阳性转化子即为产电基因工程菌。
2.权利要求1所述的构建方法构建得到的一株产电基因工程菌菌株，其分类命名为铜绿假单胞菌iPsGudomorms aeruginosa ) PA-nadE,已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号编号为:CCTCC NO:M 2013028。
3.权利要求2所述产电基因工程菌菌株在微生物燃料电池中的应用。
4.根据权利要求3所述的产电基因工程菌菌株在微生物燃料电池中的应用，其特征在于包括如下步骤: 1)菌种活化:将产电基因工程菌的菌液划线到含有庆大霉素的LB平板，挑取平板上长出的单菌落到LB培养基的试管，在37°C下培养过夜；其中，所述的LB培养基为:蛋白胨10g.ΙΛ酵母提取物5 g.ΙΛ氯化钠10 g.ΙΛ ρΗ=7.0 ;含有庆大霉素的LB平板是在LB培养基中加入50 μ g/mL庆大霉素和15 g.L-1琼脂配置而成； 2)种子培养:将步骤I)活化的菌种按照体积比2%的接种量接入LB培养基中，在37°C有氧培养菌体OD6tltl至0.43时加入终浓度0.69mM的IPTG在30°C情况下诱导至0D6(I(I=6 ； 3)微生物燃料电池中产电:将步骤2)中的种子液按接种量体积比85%转接至微生物燃料电池阳极液中，然后将20ml混合液接入单室微生物燃料电池中，产电；其中，阳极液为:葡萄糖10 g/L, PBS缓冲液50mmol/L。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物燃料电池产电基因工程菌的构建、菌株及其应用。通过分子生物学手段在铜绿假单胞菌PAO1中异源表达大肠杆菌中NAD+从头合成途径与回补途径中共同的关键基因nadE，获得产电量高的基因工程菌株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA-nadE，应用于微生物燃料电池领域的发展，并且为产电铜绿假单胞菌的基因工程研究奠定了良好的基础。
文档编号C12R1/385GK103215301SQ201310034108
公开日2013年7月24日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者陈怡露, 郑涛, 冯娇, 雍晓雨, 许琳, 曹琳, 沈海波, 费文斌 申请人:南京工业大学