专利名称：尘螨过敏原Derf29和Derf30及其基因和应用的制作方法
技术领域：
:本发明涉及一种尘螨过敏原Der f 29和Der f 30及其基因和应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
:过敏性疾病(如哮喘、过敏性鼻炎等)是临床上的常见病、多发病，世界各国过敏性疾病的总发病率高达10-30%，是当前世界性的重大卫生学问题，目前我国现有哮喘患者2000多万，过敏性鼻炎患者5000多万，并且其发病率和死亡率仍呈上升趋势，近二十年来发病率几乎翻了一倍。在引起过敏性疾病的众多吸入性过敏原中，尘螨是导致呼吸道变态反应性疾病的最重要因素。自从Voorhorst和Spieksma (1964)首次证实尘螨及代谢产物是屋尘中的主要过敏原以来，世界各国(欧美国家、日本、中国等)变态反应学工作者通过大量调查也一致证实尘螨是世界性的主要变应原。尘螨在过敏性疾病患者特异性免疫诊断中阳性率约70-80%。自从Noon和Freeman( 1911)首次应用梯牧草花粉变应原浸液(allergenextract)用于治疗花粉症以来，脱敏治疗至今已有90多年的历史。随着对变态反应疾病发病机制的深入研究以及免疫治疗机制的进一步了解，WHO (1997)建议将变应原浸液改称为变应原疫苗(allergen vaccine)，并且在《WHO有关免疫治疗的指导文件》(1998)指出:
(I)鼓励应用和发展标准化的变应原疫苗；(2)成功的免疫治疗取决于高质量的变应原疫苗。因此，研制出新一代高效变应原疫苗仍是国内外该领域研究热点。由于尘螨系医学节肢动物，结构和成份复杂，尽管目前人们在尘螨数百种蛋白中已初步鉴定出16种过敏原成份，研究显示尘螨含有的过敏原多达30余种。就某一个尘螨过敏病人而言，他可能仅对尘螨 中的一类或数类过敏原蛋白产生过敏反应。而目前在临床上用于尘螨过敏患者诊断和脱敏治疗的仍然为尘螨粗浸液，其中含有大量对患者非特异的过敏原及其它杂质，这严重阻碍了尘螨过敏原试剂标准化的制定及其在临床上的使用。所以进一步探明尘螨过敏原的确切组分，将会为尘螨过敏患者带来个体化的脱敏治疗
发明内容
:本发明的目的在于提供一种尘螨过敏原Der f 29和Der f 30及其基因和应用。本发明的技术方案如下:Der f 29是我们首次从尘螨匀浆中分离纯化得到的一种新的过敏原蛋白，它属于一类 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase 蛋白家族，分子量约 15kDa。Der f 29 由 164个氨基酸组成，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1):MALPRVFFDIAADNQPLGRIVIELRSDVVPKTAENFRALCTGEKGFGFKSSSFHRIIPNF 60MIQGGDFTNHNGTGGKSIYGNKFADENFTLQHTGPGIMSMANAGPNTNGSQFFITTVKTT 120WLDGKHVVFGSVVEGMDIVKKVESYGSQSGKPSKKVTIANCGQL164尘螨过敏原Der f 29基因克隆步骤包括:尘螨总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法扩增编码基因。基因测序结果表明尘螨过敏原Der f 29的编码基因(GenBank accession AY283280.1)由495个核苷酸组成，该基因的5’端至3’端序列为(核苷酸序列为SEQ ID NO:2):atggcacttc ctcgtgtttt tttcgatatt gctgccgata atcaaccatt gggtcgtatt 60gtcattgagc tccgtagtga tgttgtgccc aaaacagcgg aaaatttccg tgcactttgc 120actggtgaaa aaggatttgg ttttaaatca tcctcatttc atcgtatcat acccaatttt 180atgatccaag gcggtgattt cactaaccat aatggtactg gtggtaaatc catctatggt 240aacaaatttg ccgatgaaaa tttcacactt caacacaccg gacctggtat catgtccatg 300gcaaatgccg gtccaaacac caatggttca cagtttttca ttacaaccgt aaagactacc 360tggttggatg gcaaacacgt tgtttttggt tcggttgtcg aaggaatgga cattgtaaaa 420aaggtggaaa gctatggc tc acaatcgggt aaaccatcca agaaagtgac cattgctaat 480tgtggtcagc tttaa495Der f 30属于铁结合蛋白家族(Ferritin),分子量约15 kDa0 Der f 30由171个氨基酸组成，其氨基酸序列如下(SEQ ID N0:3): MAANPESTTKTSRVRMNIQINLEFYASYVYQQMAYHFNRDDVALPGFEKFFDVSSKEERE 60HAERFMKLQNQRGGRIVLDDIHKPQQQDWSSGLEAMRAALELEKTVNQALLDLHAVATKH 120NDAQFADFIETHYLTEQVEAIKKLADYITNLERCGPGLGEYLFDRHTLHSS171尘螨过敏原Der f 30基因克隆步骤包括:尘螨总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法扩增编码基因。基因测序结果表明尘螨过敏原Der f 30的编码基因(GenBank accession KC305503)由516个核苷酸组成，该基因的5’端至3’端序列为(核苷酸序列为SEQ ID N0:4):atggctgcta atcctgaatc aacaaccaaa acttcacgtg tacgaatgaa tattcaaatt 60aatttggagt tctatgcatc ctatgtatat caacagatgg cctatcattt taatcgtgat 120gatgttgcat tgcctggttt tgaaaaattt ttcgatgtat catccaaaga agaacgtgaa 180cacgctgaac gttttatgaa attacagaat caacgtggtg gacgtattgt attggatgat 240attcataaac cgcaacaaca agattggtca tcaggattgg aagcaatgcg tgctgcattg 300gaattggaaa aaacagtcaa tcaggcattg ttggatttgc atgccgttgc caccaaacac 360aatgatgcac aatttgctga ttttattgaa acacattatc taactgaaca agtggaagcc 420atcaagaaat tggctgatta tattaccaat ttggaacgtt gtggccccgg acttggtgaa 480tatctttttg atcgtcatac attgcattca tcgtaa516Western blot检测发现,来自41份尘螨过敏病人血清，Der f 29与其中的35份呈阳性反应，阳性反应率为85.6% ;Der f 30与其中的26份呈阳性反应，阳性反应率为63.4%。Elisa检测发现，Der f 29和Der f 30阳性组在450nm处的吸收值分别是阴性对照组的4.6和5.1倍。临床皮肤针刺实验显示，对于10位尘螨过敏患者，Der f 29与其中7位的皮肤针刺实验呈阳性反应，阳性反应率为70% ;Der f 30与其中6位的皮肤针刺实验呈阳性反应，阳性反应率为60%。在嗜碱性细胞活化实验中，Der f 29作用于尘螨过敏病人外周血嗜碱性细胞所诱导的CD63和CCR3双阳性细胞的百分率约是阴性对照组的7.1倍；Der f 30作用于尘螨过敏病人外周血嗜碱性细胞所诱导的⑶63和CCR3双阳性细胞的百分率约是阴性对照组的5.9倍。上述过敏原检测发现，Der f 29和Der f 30具有较强的过敏原性，是来自尘螨的主要过敏原，能作为制备治疗尘螨过敏性疾病药物的应用。本发明的有益效果在于:提供了尘螨过敏Der f 29和Der f 30及其基因，尘螨过敏原Der f 29和Der f 30能够作为制备治疗尘螨过敏性疾病药物的应用。
:图1-A是尘螨匀浆过分子筛S印hadex_G75的峰型图。图1-B是尘螨勻衆分子筛Sephadex_G75第III峰再过阴离子交换柱Resource Q的峰型图。图1-C是Der f 29过Resource Q的峰型图及电泳图。图1-D是Der f 30过Resource Q的峰型图及电泳图。图2-A是Der f 29与其中9个尘螨过敏病人血清及I个阴性对照Western blot结果。图2-B是Der f 30与其中9个尘螨过敏病人血清及I个阴性对照Western blot结果。图2-C是Der f 29与尘螨过敏病人血清IgE作用的Elisa结果，其中组I用血清来自健康人，用作阴性对照，组2所用血清来自尘螨过敏病人。图2-D是Der f 29与尘螨过敏病人血清IgE作用的Elisa结果，其中组I所用血清来自健康人，用作阴性对照，组2所用`血清来自尘螨过敏病人。图3-A至图3-D是Der f 29的嗜碱性细胞活化结果。其中:图3-A所用的嗜碱性细胞来自Der f 29过敏病人的外周血，组I未用Der f 29活化来作为阴性对照；图3-B所用的嗜碱性细胞来自健康人的外周血，组I也是未用Derf 29活化来作为阴性对照；图3-C所用的嗜碱性细胞来自Der f 30过敏病人的外周血，组I未用Der f 30活化来作为阴性对照，图3-D所用的嗜碱性细胞来自健康人的外周血，组I也是未用Der f 30活化来作为阴性对照。图4-A 为尘蝴勻衆 Sephadex_G75 III峰的 Western blot 图,其中点 I 为 Der f 29。图4-B 为尘蝴勻衆 Sephadex_G75 III峰的 Western blot 图，其中点 I 为 Der f 30。
具体实施方式
:实施例一:尘螨过敏原的鉴定及其氨基酸序列测定一、尘螨的饲养和收集及尘螨匀浆的制备将纯品系的粉尘螨至于25 1:相对湿度75%的条件下采用磨成粉末状的鼠粮进行批量饲养。由于尘螨具有避光的生活特性，可用白炽灯光照法将尘螨从饲料中分离出来。对于分离的尘螨可加入适量的20mM pH 7.8 Tris-HCL进行充分研磨，然后在转速12000 Xg离心30 min获取上清。二、尘螨过敏原的分离纯化以上述收集的上清液为原料，上样于预先用20mM pH7.8 Tris-HCL缓冲液平衡好的分子筛凝胶层析SephadeX-G75，用相同的缓冲液进行洗脱。流速为0.3ml/min，用自动收集器每IOmin收集一管,检测每管在280nm和215nm处的吸收值,制作吸收值变化的峰型图如图1A所示。然后将每峰收集冻干浓缩用于下一步的分离纯化或双向电泳及其Westernblot检测。将来自分子筛凝胶层析Sephadex_G75 III峰继续过阴离子交换柱Resource Q,峰型图如图1-B所示，图1B中的2峰再继续过Resource Q的峰型图如图1-C和图1_D所示，所插入的为Der f 29和Der f 30电泳图。三、双向电泳及其Western blot检测双向电泳及其Western blot具体步骤如下:A.样品处理:采用GE公司的2D clean-up对来自分子筛各峰的样品进行脱盐浓缩等处理，主要过程如下:1:将含有约60 μ g 100 μ I的样品至于1.5 ml的微型离心管中，加入300 μ I沉淀剂振荡搅勻，冰浴15 mirio2:以最大转速(12000Xg)离心5 min，尽量取净上清。加入40 μ I共沉淀剂，冰浴5 min。再次相同转速离心5 min，用移液枪将上清移去，加入25 μ I加入I ml洗涤缓冲液(在-20 1:至少预冷I小时)和5 μ I洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。将管在-20°C下孵育至少30 min,每10 min振荡20至30 S。3:以转速 12000 X g 离心 5 min。4:小心将上清移去，此时可见白色沉淀，将沉淀简单风干。5:加入150 μ I水 化液再溶解沉淀，以备第一向等电聚焦电泳(IEF)使用。B.等电聚焦(IEF):将含有约60 μ g样品100 μ I水化液上样于7 cm长Immobiline DryStrip非线性胶条,在Ettan IPGphor III等电聚焦系统上聚焦,等电聚焦条件为20 °C，每条胶的电流为50 μ A，总聚焦伏小时约为6 kVh。将等电聚焦好的胶条分别用含有二硫苏糖醇(DTT)和碘乙酰胺的平衡液各洗15 min，将平衡好的胶条横放在以配好的浓度为12%的SDS-PAGE胶面上，并用琼脂糖封好，准备第二向电泳。C.第二向电泳:对于胶宽度只有7 cm的胶块可用SE260进行跑胶。在20 mA/胶的条件下一个半小时即可。D.双向电泳的Western blot:对于同一个样品需要跑两块双向电泳，其中一块用于直接染色，一块接着用于Western blot,具体过程如下:1:转膜:将2-D-SDS-PAGE胶上的蛋白用转膜槽在200 mA 2 h的条件下转至PVDF膜上。2:封闭:将转有蛋白的PVDF膜用5%的脱脂奶粉在常温封闭此。3:一抗孵育:将封闭好的PVDF膜用PBS洗涤，把一抗(尘螨过敏病人血清)用5%的脱脂奶粉按1:20稀释，在4 °C孵育过夜。4:二抗孵育:将一抗孵育的PVDF膜再用PBS洗涤，把二抗(羊抗人IgE)用5%的脱脂奶粉按1:2000稀释，在常温孵育I小时。5:显影:将二抗孵育好的PVDF膜用PBS洗涤3次，每次5 min,在膜表面加上适量的二抗特异发光底物，用胶片进行显影。E.将与胶片上显影点匹配较好的2-D-PAGE蛋白点进行ES1-Q-TOF质谱测序。实施例二:尘螨过敏原的基因克隆一、尘螨总RNA提取A.称取约80 mg的活尘螨,加入已预冷的I mL Trizol提取液(美国Invitrogen公司)，并加入液氮充分匀浆。B.加入Trizol 1/5体积的氯仿，剧烈混匀约15秒，室温放置5分钟，4°C，12000rpm离心10分钟,取上清。C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4 V，12000 rpm离心10分钟，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为地鳖虫消化道中肠总RNA。二、尘螨mRNA的纯化尘螨mRNA 分离纯化米用美国 PR0MEGA 公司的 PolyATtract mRNA IsolationSystems试剂盒。A.取尘螨总 RNA 500 μ g 溶于 500 μ L DEPC 水中，65 °C水浴 10 min，加人 3UL的Oligo(dT)探针和13 uL 20XSSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。B.磁珠(SA-PMP)的洗涤:将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5X SSC 300 μ L，至磁力架吸附30秒，最后加100 μ L 0.5X SSC悬浮，称为B液。C.将A液加入B液中，室温 放置10 min，至磁力架吸附30秒，弃上清，用Ο- X SSC洗涤4次，最后弃上清，加100 μ L DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30 S，将上清移至新的试管，再加入150 UL DEPC水重悬，至磁力架吸附30 S，移上清至上述试管，即为纯化的地鳖虫消化道中肠mRNA。D.加入1/10体积的pH5.2,3 M的乙酸钠溶液，等体积异丙醇，于_70°C放置30分钟，4°C，12000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀溶解于10 μ L DEPC水中。三、尘螨cDNA文库构建米用CL0NTECH公司 Creator SMART cDNA Library Construction Kit 构建尘螨cDNA文库。A.cDNA 第一链合成于无菌PCR管加入2μI 尘螨mRNA、l μ I SMART IV引物、I μ I CDS 111/3’ PCR引物、I μ I RNA-free水，使总体积达到5 μ I ,混匀并短暂离心。1.72°C 保温 2 min，冰上孵育 2 min。2.在上述 PCR 管中加入 2 μ I 5 X 第一链 buffer、I μ I 20 mmol/L DTTU μ I10 mmol/L dNTP混合物、I μ I PowerScript逆转录酶，混匀并短暂离心。3.置于PCR仪中42°C保温I hr后，冰浴终止第一链的合成。B.采用长末端聚合酶链式反应(LD- PCR)方法扩增cDNA第二链1.将 I μ I cDNA 第一链、40 μ I 去离子水、5 μ I IOXAdvantage 2 PCR 缓冲液、I μ I 50XdNTP 混合物、I μ I 5’PCR 引物、I μ I CDS 111/3’PCR 引物以及 I μ I 聚合酶于PCR管中混匀。2.在 PCR 仪中按以下程序扩增:95°C，20 sec ;22 个循环:95°C，5 sec ；68°C,6min。3.扩增结束后，将合成的双链cDNA置于_70°C保存。C.酶切、连接以及连接产物的转化:1.在微量离心管中加入I μ L pMD19_T载体(日本Takara公司)、4 μ L尘螨cDNA双链溶液，全量为5 UL02.加入5 μ L (等量)的连接酶缓冲混合物。
3.16°C反应 2 小时。4.全量(10 μ L)加入至100 μ L DH5 α感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)中，冰浴30分钟。5.42°C加热90秒钟后，再在冰中放置I分钟。6.加入37°C温浴过的LB培养基900 μ L，37°C缓慢振荡培养60分钟。7.取200 μ L涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37°C培养16小时，形成单菌落。8.每个LB平皿用5 mL LB液体培养基洗涤菌落，加30%甘油冻存。构建的cDNA大约含2 X IO6个单独克隆。四、尘螨过敏原基因序列扩增和测定:根据实施例一中分离纯化所得尘螨过敏原Der f 29的氨基酸序列，我们设计了一条简并引物Der f 29-F和Der f 30-F，与构建地鳖虫消化道中肠cDNA文库时所使用的接头引物⑶S 111/3’ PCR配对，正反向引物序列为:CDS 111/3’ PCR: 5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCATG-3’。Der f 29-F: 5， -ATGGC(A/T/C/G)CT(A/T/C/G)CC(A/T/C/G)AG(A/G)GT(A/T/C/G)TT (T/C) TT (T/C) -3，。Der f 30-F: 5，-ATGGC(A/T/C/G)GC(A/T/C/G)AA(T/C)CC(A/T/C/G)GA(A/G)AG (T/C)AC (A/T/C/G) _3，。其中，括号内的碱基表示简并引物。简并引物和接头引物⑶S 111/3’ PCR配对使用，以尘螨cDNA为模板，进行PCR。其反应条件为:95°C预变性4 min，接着在如下条件进行30轮循环，94°C 30 sec, 55°C 30sec, 72°C 40 sec，然后72°C 10 min。然后将PCR产物连接到T载体上，导入大肠杆菌DH5a，筛选单克隆进行测序。结果表明编码过敏原Der f 29的cDNA序列由495个核苷酸组成，过敏原Der f 30的cDNA序列由516个核苷酸组成。实施例三:尘螨过敏原Der f 29的过敏原性检测将分离纯化获得的尘螨过敏原Der f 29进行如下过敏原性检测。一、Western blot 实验配制胶浓度为12%的SDS-PAGE胶，在还原条件电泳。电泳后利用转膜槽将PAGE胶上的Der f 29转至PVDF上，用5%的脱脂奶粉封闭2 hr,洗涤液洗涤3次后加一抗4°C孵育过夜(一抗为姚虻过敏病人血清，按1:80稀释)。用洗涤液洗涤3次后加二抗常温孵育Ihr (二抗为羊抗人IgE)，再次洗涤3次后，即可用二抗所连接的辣根过氧化物酶底物显影。二、Elisa 实验用包被液把过敏原稀释成10 μ g/ml，用50 μ I 4°C包被过夜，病人血清按1:50稀释，二抗是按1:2000稀释，最终测0D450 nm的光吸收值。三、竞争性Elisa抑 制实验具体过程:用50 μ I浓度为50 μ g/ml的尘螨粗提液包被96孔板,一抗用3%的BSA按1:30稀释，然后分别与终浓度为30至3 X 10_4 μ g/ml的粗提液和过敏原室温作用I小时，二抗按1:2000稀释，检测0D450的吸收值。四、诱导嗜碱性细胞活化实验
利用ficoll-hypaque法分离对Der f 29过敏病人全血中的外周血单核细胞(PBMC)，PBMC含有淋巴细胞、单核细胞和嗜碱性细胞。以终浓度为I μ g/ml的过敏原与PBMC在 37°C孵育 30 min,洗涤 3 次后再与抗体 FITC-anti_CD63 和 PE-anti_CD193 (CCR3) 37°C孵育20分钟，洗涤3次后用流式细胞仪检测。其中阳性对照用的是ant1-1gE，阴性对照用的是wash buffer (细胞用PBS)。PE标记的anti_CD193 (CCR3)在嗜碱性细胞膜上稳定表达，它可以作为嗜碱性细胞的marker。在PBMC的流式图上嗜碱性细胞位于淋巴细胞和单核细胞的交界处，利用阴性对照和PE-ant1-⑶193 (CCR3)将这部分细胞圈出来(gating)。嗜碱性细胞活化结果可用CD63和CCR3双阳嗜碱性细胞的百分率表示。五、皮肤针刺实验用生理盐水溶解的过敏原滴在患者前臂掌侧皮肤，用特制的点刺针刺破皮肤，使少量的过敏原进入皮肤内，擦干遗留的过敏原，15 min后读结果，分别用生理盐水和组胺作阴性和阳性对照。Der f 29结果如表1，Der f 29如表2。表1:Der f 29对10名尘螨过敏病人的皮肤针刺实验结果
权利要求
1.尘螨过敏原Derf 29和Der f 30、其特征在于分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成。
2.编码尘螨过敏原Derf 29和Der f 30的基因，其特征在于分别由SEQ ID NO:2和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列组成。
3.权利要求1所 述的尘螨过敏原Derf 29和Der f 30在制备治疗尘螨过敏性疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种尘螨过敏原Der f 29和Der f 30及其基因和应用，属于生物医学技术领域。尘螨过敏原Der f 29和Der f 30、分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成。编码尘螨过敏原Der f 29和Der f 30的基因，分别由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成。所述的尘螨过敏原Der f 29和Der f 30在制备治疗尘螨过敏性疾病药物中的应用。本发明的有益效果在于提供尘螨过敏Der f 29和Der f 30及其基因，尘螨过敏原Der f 29和Der f 30能够作为制备治疗尘螨过敏性疾病药物的应用。
文档编号C12N15/12GK103073636SQ201310034209
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者赖仞, 安输, 容明强, 李东升 申请人:中国科学院昆明动物研究所