专利名称：一种筛选益生菌的方法
技术领域：
本发明属于畜牧兽医技术领域，尤其涉及筛选益生菌的方法。
背景技术：
益生菌是指通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主(人和动物)健康水平和健康状态的活菌制剂，具有能帮助维持肠道的正常功能，有促进营养吸收、刺激机体免疫系统、提高免疫力的作用。益生菌在保障人畜健康或防治某些疾病方面发挥着越来越重要的作用，筛选不同来源和具有特殊功能的益生菌菌种成为国内外研究的热点。目前我国尚缺乏原始创新的益生菌关键技术和产品，在产业和市场上形成了国外产品与技术的双重垄断，限制了我国益生菌产业的健康发展。益生菌开发的首要关键技术是菌种的筛选。作为现有技术采用的筛选方法所依据的是菌种所具有的生物学和功能特征，尤其是黏附特性、存活特性、功能性、可加工性等。可是，这些特性都取决于菌种本身的特性，因此，从什么途径、用什么方法筛选出这种菌株是关键。当前，应用传统表型鉴定方法及16S rDNA序列同源性分析鉴定方法是筛选菌株的通用方法，这类方法都能较好 地筛选出具有强黏附特性、存活特性高、可加工性强的菌株，但是不能有效筛选出有益于动物健康的菌株，如可预防动物大肠杆菌病的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选益生菌的方法。本发明所要解决的技术问题是从乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、肠球菌属、酵母菌、地衣芽孢菌和枯草芽孢菌等益生菌中筛选出可抵抗大肠杆菌负作用的高效菌株。本发明所述的一种筛选益生菌的方法是通过以下方法实现的:第一步，分离猪或家禽脾脏，进行组织原代培养；第二步，取一部分原代培养的脾脏组织，用大肠杆菌K88对其进行攻毒，测定白细胞介素8和白细胞介素4水平的变化；第三步，取一部分原代培养的脾脏组织，用候选的多个益生菌菌株分别对其进行处理，测定白细胞介素8和白细胞介素4水平的变化；第四步，通过比较候选的多个益生菌菌株和大肠杆菌K88处理后白细胞介素8和白细胞介素4水平的变化，挑选出与大肠杆菌K88处理引起的2种白细胞介素变化程度相似、但效果相反的益生菌菌株，初步确定出可能有效的益生菌菌株；第五步，通过大肠杆菌K88动物攻毒实验，观测初步筛选的益生菌菌株的保护效果，最终确定出高效的益生菌菌株。本发明适用于可用于家畜、家禽、小鼠和大鼠等的乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、肠球菌属、酵母菌、地衣芽孢菌和枯草芽孢菌等益生菌的筛选。本发明的突出优点是:采用体外免疫学实验与体内攻毒实验相结合的方法准确性高、针对性强和节省时间，所筛选的益生菌可有效替代抗生素，减少大肠杆菌引起的疾病，促进动物健康。
具体实施例方式实施例1将新鲜猪粪用生 理盐水稀释，在选择性培养基上划线培养，然后各类细菌纯化培养，通过细菌微量生化反应管选出候选的益生菌菌株(乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属)备用。无菌取21日龄仔猪脾脏，剪碎，研磨匀浆，然后150目铜网过滤，离心收集细胞。通过红细胞裂解液和GKN缓冲溶液处理，离心可以得到脾脏细胞。用RPMI1640营养液重悬细胞，调整细胞浓度为IX IO6个/ml。接种2X IO6个/孔细胞于6孔板中培养48小时后，力口Λ IXlO8个大肠杆菌Κ88或候选益生菌菌株(乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属)共培养2小时，收集细胞，检测脾脏细胞白细胞介素-4和白细胞介素-8表达水平。挑选出与大肠杆菌Κ88处理组白细胞介素-4和白细胞介素-8变化相反的益生菌菌株(乳酸杆菌、链球菌，见表
1.1)作为体外试验筛选的对象。表1.1各种候选益生菌对仔猪脾脏细胞白细胞介素水平的影响
权利要求
1.一种筛选益生菌的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)分离猪或家禽脾脏，进行组织原代培养； (2)取一部分原代培养的脾脏组织，用大肠杆菌K88对其进行攻毒，测定白细胞介素8和白细胞介素4水平的变化； (3)取一部分原代培养的脾脏组织，用候选的多个益生菌菌株分别对其进行处理，测定白细胞介素8和白细胞介素4水平的变化； (4)通过比较候选的多个益生菌菌株和大肠杆菌K88处理后白细胞介素8和白细胞介素4水平的变化，挑选出与大肠杆菌K88处理引起的2种白细胞介素变化程度相似、但效果相反的益生菌菌株，初 步确定出可能有效的益生菌菌株； (5)通过大肠杆菌K88动物攻毒实验，观测初步筛选的益生菌菌株的保护效果，最终确定出高效的益生菌菌株。
2.根据权利要求1所述的一种筛选益生菌的方法，其特征在于:所述的益生菌包括乳杆菌属或乳球菌属或链球菌属或肠球菌属或酵母菌或地衣芽孢菌和枯草芽孢菌。
3.根据权利要求1所述的一种筛选益生菌的方法，其特征在于:所述的动物攻毒实验中的动物包括家畜或家禽或小鼠或大鼠。
全文摘要
本发明公开了一种筛选益生菌的方法，包括以下步骤(1)原代培养猪或家禽脾脏组织；(2)用大肠杆菌K88对其进行攻毒，测定白细胞介素8和白细胞介素4水平的变化；(3)用候选的益生菌菌株分别对其进行处理，测定上述2种白细胞介素水平的变化；(4)通过比较挑选出与大肠杆菌K88处理引起的2种白细胞介素变化程度相似、但效果相反的益生菌菌株；(5)通过大肠杆菌K88动物攻毒实验，观测初选出的益生菌菌株的保护效果，最终确定高效的益生菌菌株。本发明的突出优点是采用体外免疫学实验与体内攻毒实验相结合的方法准确性高、针对性强和节省时间，所筛选的益生菌可有效替代抗生素，减少大肠杆菌引起的疾病，促进动物健康。
文档编号C12R1/01GK103087963SQ201310037320
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月31日 优先权日2013年1月31日
发明者侯永清, 丁斌鹰, 易丹 申请人:武汉工业学院