一种用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂，包含人端粒酶逆转录酶启动子、铁蛋白报告基因和慢病毒载体、包装质粒和包装细胞。端粒酶逆转录酶启动子调控铁蛋白报告基因在肿瘤细胞内特异性过表达，供磁共振检测恶性肿瘤。
【专利说明】一种用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂。
[0002]发明背景
[0003]研究表明端粒酶催化亚单位即人端粒酶逆转录酶，简称为“hTERT”，在绝大多大数人肿瘤细胞和永生化细胞内表达阳性，而在正常体细胞内为阴性，与端粒酶活性具有一致性，是肿瘤细胞的特异性标志物。因此，hTERT的启动子可以调控基因靶向性表达于端粒酶阳性的肿瘤细胞内，而且其启动子是目前已知最广谱的肿瘤细胞特异性启动子。
[0004]报告基因显像技术主要是将分子生物学和显像技术结合，实现靶分子的非侵入性显像。铁蛋白基因是磁共振成像(MRI)中最受关注的报告基因之一，不需引入外源性对比剂即可实现显像。磁共振成像技术临床应用广泛，成像分辨率高，可同时获得解剖和功能信息，铁蛋白是机体主要的储铁蛋白，可将摄取的铁离子聚集在蛋白壳内，形成具有超顺磁性的氧化铁颗粒，因此，应用铁蛋白报告基因实现MR显像的方法成为了焦点之一。
[0005]本发明人研究发现，基因的表达受到启动子的调控，所以通过检测基因表达情况能间接反映启动子的转录活性，但是，需通过提取细胞或组织进行免疫染色、蛋白印迹等侵入性手段来检测启动子驱动基因表达后带来的效应。因此，应用非侵入性手段对端粒酶逆转录酶启动子的转录活性进行检测成像具有重要肿瘤学意义。应用hTERT启动子调控铁蛋白报告基因过表达的载体感染细胞，然后进行MR成像，使用MR铁蛋白报告基因成像技术可以非侵入性检测活体肿瘤细胞。
【发明内容】
[0006]本发 明的目的提供了一种用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂，包含人端粒酶逆转录酶启动子、铁蛋白报告基因、慢病毒载体、包装质粒和包装细胞。
[0007]上述本发明的用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂，人端粒酶逆转录酶启动子和铁蛋白报告基因插入慢病毒载体，人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控铁蛋白报告基因在慢病毒载体内表达，并通过载体质粒，传染给肿瘤细胞过表达，所述铁蛋白报告基因为带有flag标签蛋白序列的铁蛋白重链全基因，所述包装质粒为p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G，所述包装细胞为293T。
[0008]在一实施方案中，本发明的用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂，包含人端粒酶逆转录酶启动子、铁蛋白报告基因、慢病毒载体、包装质粒和包装细胞，其中，人端粒酶逆转录酶启动子和铁蛋白报告基因插入慢病毒载体，人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控铁蛋白报告基因在慢病毒载体内表达，并通过载体质粒，传染给肿瘤细胞过表达。
[0009]在上述实施方案中，本发明的用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂，所述铁蛋白报告基因为带有flag标签蛋白序列的铁蛋白重链全基因，所述包装质粒为pCD/NL-BH*DDD和 pLTR-G，所述包装细胞为293T。
[0010]本发明的另一目的提供了一种制备用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂的方法，包括以下步骤:[0011]I)根据Genbank (基因库)代号为NM_010239的铁蛋白重链(Fth)基因序列信息人工合成目的基因并接入flag标签蛋白序列，在其两端引入限制性内切酶NheI和BamHI 识别位点，利用DNA连接酶将所述蛋白序列克隆入慢病毒(p⑶H-CMV-MCS-Puro)载体质粒， 得到 pCDH-CMV-Fth-f Iag-Puro 慢病毒载体；
[0012]2)用Spe I和Xba I对步骤I)的慢病毒载体进行双酶切，酶切产物电泳后回收无 CMV的载体片段；
[0013]3)从含hTERT的质粒中PCR扩增hTERT启动子片段重组入步骤2)的无巨细胞病毒(CMV)的载体片段构建成目的pCDH-hTERT-Fth-f Iag-Puro慢病毒载体；
[0014]4)对步骤 3)的 pCDH-hTERT-Fth-fIag-Puro 慢病毒包装，采用 pCD/NL_BH*DDD 和 pLTR-G包装质粒，293T包装细胞，构建成Lent1-hTERT-Fth-f Iag-Puro慢病毒表达载体，即得诊断剂。
[0015]术语“肿瘤细胞”在本发明中没有特别指明的情况下是指恶性肿瘤细胞。
[0016]本发明的再一目的提供了一种检测肿瘤细胞的方法，将本发明的用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂与肿瘤细胞接触，将人端粒酶逆转录酶启动子和铁蛋白报告基因传染给肿瘤细胞过表达，用MRI扫描示踪肿瘤细胞。
[0017]本发明的诊断剂的有益效果，现有技术直接用人端粒酶逆转录酶启动子作为特异性标志物在肿瘤细胞中表达，用以检测肿瘤细胞，但需要通过提取细胞或组织进行免疫染色、蛋白印迹等侵入性手段来检测，且只能检测浅表肿瘤细胞。而本发明的诊断剂，由于人端粒酶逆转录酶启动子调控铁蛋白报告基因在肿瘤细胞特异性过表达，而人端粒酶逆转录酶启动子调控铁蛋白报告基因在正常细胞或良性肿瘤细胞中无表达，在肿瘤细胞中过表达的铁蛋白报告基因可以摄取外源性或内源性铁，聚集成超磁性铁，因此，可以用MRI成像技术示踪检测，因此，无需离体免疫染色测定。本发明的诊断剂对深部恶性肿瘤也可通过MR 铁蛋白报告基因成像检测，也可以对恶性和良性肿瘤进行诊断，以区分是良性还是恶性肿瘤。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1免疫荧光染色检测hTERT启动子在A549和HPDLF细胞株内情况
[0019]图2免疫荧光染色检测Fth-flag基因在A549和HPDLF细胞内表达情况
[0020]图3普罗士兰铁染色检测细胞摄铁能力
[0021 ] 图4磁共振对体外A549和HPDLF细胞进行T2*WI和T2*MAP扫描的信号强弱
[0022]图5磁共振对体外A549和HPDLF细胞扫描的T2信号
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明的范围。
[0024]实施例1诊断剂的制备
[0025]根据Genbank (NM_010239)铁蛋白重链(Fth )基因序列信息人工合成目的基因并接入f Iag标签蛋白序列(Fth-f Iag )，在两端引入限制性内切酶Nhe I和 BamHI识别位点，利用DNA连接酶将合成序列克隆入慢病毒载体质粒p⑶H-CMV-MCS-Puro，命名为 pCDH-CMV-Fth-f Iag-Puro。用 Spe I 和 Xba I 对 pCDH-CMV-Fth-f Iag-Puro 表达载体进行双酶切，酶切产物电泳后回收无CMV的载体片段。从含hTERT启动子的质粒中PCR扩增hTERT 启动子片段重组入回收的载体片段构建成目的p⑶H-hTERT-Fth-flag-Puix)载体。测序无误并检测目的基因能表达后，进行慢病毒包装。慢病毒包装采用p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G 包装质粒，293T包装细胞，构建成慢病毒表达载体，命名为Lent1-hTERT-Fth-f lag-Puro， 即为本发明的诊断剂。
[0026]对比实施例1
[0027]无hTERT启动子的铁蛋白重链基因慢病毒表达载体的制备
[0028]采用实施例1获得的p⑶H-CMV-Fth-f Iag-Puro慢病毒载体进行慢病毒包装， 采用p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G包装质粒，293T包装细胞，构成慢病毒表达载体，命名为 Lent1-CMV-Fth-flag-Puroo
[0029]实施例2检测测试
[0030]1、材料:
[0031]细胞株:人肺腺癌(A549)和人原代培养牙周膜成纤维(HPDLF)细胞由第三军医大学附属新桥医院中心实验室保存，也可在商业市场上购买。
[0032]实验主要试剂:细胞培养主要试剂:高糖DMEM培养基(GIBIC0)、胎牛血清 (GIBIC0)、枸橼酸铁(Sigma)。抗体:兔抗人 hTERT —抗(Abeam)、鼠抗 flag —抗(Sigma)、 抗兔Alexa Fluor488和抗鼠Alexa Fluor555突光二抗(碧云天)。
[0033]2、方法
[0034]2.1细胞培养及转染:
[0035]A549细胞和HPDLF细胞用含10%胎牛血清、IOOU / ml青霉素和IOOmg / ml链霉素的高糖DMEM培养基培养，培养条件为37 V，95%空气，5%C02。分别应用 Lent1-hTERT-Fth-f Iag-Puro 和 Lent1-CMV-Fth-f Iag-Puro 两种慢病毒感染 A549 和 HPDLF 细胞(M0I 分别为 40 和 100)，得到 hTERT-A549、hTERT-HPDLF 和 CMV-A549、CMV-HPDLF 细胞株，再用嘌呤霉素(3ug/ml，hTERT-HPDLF细胞除外)筛选出稳定的转染株。
[0036]2.2免疫荧光染色
[0037]分别将hTERT-A549、hTERT-HPDLF 和 CMV-A549、CMV-HPDLF 细胞株接种于共聚焦培养皿内，2天后进行染色。4%多聚甲醛固定lOmin，0.5%Triton X-100孵育5min，10%羊血清封闭20min,兔人hTERT单克隆一抗或鼠抗flag单克隆一抗4°C孵育过夜,抗兔或鼠Alexa Fluor555 二抗室温避光孵育60min，DAPI复染核3min，抗荧光淬灭封片液封片后共聚焦显微镜成像。
[0038]2.2.1检测只有hTERT启动子的慢病毒载体传染A549、HPDLF细胞及其表达。
[0039]采用免疫荧光染色检测方法，检测细胞株hTERT表达，检测结果显示A549细胞内 hTERT表达呈阳性，如图1中的A549，图中亮点即为hTERT表达，HPDLF细胞内hTERT表达为阴性，即图1中的HPDLF正常细胞没有出现荧光亮点。
[0040]结果表明，hTERT启动子在肿瘤细胞中表达，在非肿瘤细胞中无表达。表明hTERT 启动子在肿瘤细胞内表达的特异性。
[0041]2.2.2检测带有细胞hTERT启动子(Fth)和铁蛋白基因(flag)的慢病毒载体传染 A549、HPDLF细胞及其表达，即Fth-flag表达检测。
[0042]采用免疫荧光染色检测法，结果显示hTERT_A549细胞Fth-flag表达呈强阳性，hTERT-HPDLF细胞无Fth-flag表达，分别见图2中的hTERT_A549和hTERT-HPDLF，前者有亮点，表示有，后者没有出现高点，表示没有Fth-flag表达；对照组CMV-A549和CMV-HPDLF 细胞均表达Fth-flag，见图2的CMV-A549和CMV-HPDLF显示有亮点，表明有Fth-flag表达.未转染的A549和HPDLF细胞均无Fth-flag表达，见图2中的A549和HPDLF，没有出现亮点，表示没有Fth-flag表达。这些结果说明hTERT启动子只在hTERT表达阳性即端粒酶阳性的肿瘤细胞内驱动所调控Fth-flag基因表达，在端粒酶阴性的正常细胞内不发挥驱动作用；对照CMV启动子在2种细胞内均驱动Fth-flag基因表达，无特异性。
[0043]2.3普罗士兰铁染色
[0044]分别将hTERT-A549、hTERT-HPDLF 和 CMV-A549、CMV-HPDLF 细胞用含枸橼酸铁铵 (FAC, ImM)培养基培养48h，PBS充分漂洗，4%多聚甲醛固定lOmin，普罗士兰铁染色试剂(2% 亚铁氰化钾和10%HC1等体积混合，现配现用)室温作用30min，中性红染核30秒，蒸馏水冲洗，封片。
[0045]采用普罗士兰染色法检测hTERT启动子和Fth-flag基因在A549、HPDLF细胞内的表达。
[0046]经普罗士兰铁染色后检测，发现hTERT_A549细胞内聚集了大量蓝染颗粒，见图3 中的hTERT-A549图，大小较均匀，分布以胞浆为主，而hTERT-HPDLF细胞内有稀少蓝染颗粒，；见图3中的hTERT-HPDLF图，对照CMV-A549和CMV-HPDLF细胞内均可见明显蓝染颗粒,分别见图3中的CMV-A549图和CMV-HPDLF图，未转染A549和HPDLF细胞内可见稀少蓝染颗粒，分别见图3中的A549和HPDLF图。结合免疫荧光染色检测Fth-f lag表达结果， 可知细胞摄铁能力与Fth表达水平具有一致性，说明细胞高表达铁蛋白后摄铁能力显著增力口。实验结果表明铁蛋白在肿瘤和正常细胞中均有表达，没有表现出对肿瘤细胞的特异性， 而同时联接有hTERT启动子和铁蛋白基因的慢病毒载体即本发明的诊断剂传染给正常细胞后未有铁蛋白基因表达，但传染给肿瘤细胞后有铁蛋白基因表达，表现出对肿瘤细胞有特异性过表达。也证明hTERT启动子调控铁蛋白基因的过表达，可利用这一对肿瘤的特异性表达，检测活体恶性肿瘤细胞。
[0047]2.4MRI示踪检测
[0048]分别将hTERT -A549、hTERT-HPDLF 和 CMV-A549、CMV-HPDLF 细胞用含 FAC( 500 u M) 的培养基培养48h后，用PBS充分清洗细胞以除去游离铁离子。胰酶消化后离心收集细胞 (约2xl07个)，4%多聚甲醛固定lOmin。在2ml离心管内预铺垫500 yll%琼脂糖，待其冷却后，将细胞用Iml PBS重悬后加入离心管内，待细胞自然下沉至琼脂糖面上。进行3.0T磁共振扫描(GE)，扫描参数:梯度自旋回波(GRE) T2*WI:TR=400ms, TE=12.0ms,成像视野(FOV) 为 24mmX24mm，层厚 1mm，层间距 0.1mm;T2*MAP:TR=IOOOms,TE= (2.6,6.1,9.5，13.0，16.5， 20.0，23.5，26.9)所得图像由软件自动生成T2*值伪彩图。每种细胞选取5个感兴趣区 (ROI，面积 30mm2)测量 T2* 值，测值所选参数:TR=IOOOms, TE=12.0ms。
[0049]2.4.1统计学方法
[0050]应用SPSS17.0软件对收集的数据进行统计学处理，结果用均值土标准差示，同种细胞不同处理组之间T2*值差异应用单因素ANOVA检验分析，当P〈0.05时认为有统计学意义。
[0051]2.4.2MRI 检测结果[0052]采用磁共振对体外细胞进行T2*WI和T2*MAP扫描，结果示:hTERT_A549细胞 T2*WI信号强度较A549细胞显著降低，T2*值差异显著(hTERT-A549:12.10±0.92ms, A549:21.44±1.51ms, p<0.05)，hTERT-HPDLF 细胞 T2*WI 和 T2* 值较HPDLF 细胞无明显差异 (hTERT-HPDLF:24.01±1.13ms,HPDLF: 23.38±1.72ms,p>0.05);CMV组细胞T2*WI 和 T2*值均较未转染细胞明显降低(CMV-A549:9.21±0.85ms, CMV-HPDLF:11.66±0.69ms, p<0.05) (图4、图5)。综合以上结果，证实hTERT启动子能控制铁蛋白报告基因在端粒酶阳性肿瘤细胞内过表达，使细胞摄铁能力显著增加，并引起细胞T2*WI信号降低，T2*值降低，说明通过MRI报告基因成像技术可检测hTERT启动子转录活性。同时也证明本发 明的诊断剂在恶性肿瘤细胞内特异过表达的特性，借此特性通过MRI铁蛋白报告基因成像技术可检测恶性肿瘤细胞。
【权利要求】
1.一种用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂，其特征在于，包含人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子、铁蛋白报告基因、慢病毒载体、包装质粒和包装细胞。
2.如权利要求1所述的诊断剂，其特征在于，人端粒酶逆转录酶启动子调控铁蛋白报告基因在慢病毒载体内表达。
3.如权利要求2所述的诊断剂，其特征在于，人端粒酶逆转录酶启动子和铁蛋白报告基因插入慢病毒载体传染给肿瘤细胞过表达。
4.如权利要求1或3任一所述的诊断剂，其特征在于，所述铁蛋白报告基因为带有 flag标签蛋白序列的铁蛋白重链全基因。
5.如权利要求1或3所述的诊断剂，所述肿瘤细胞为恶性肿瘤细胞。
6.如权利要求1所述的诊断剂，所述包装质粒为p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G，所述包装细胞为293T。
7.一种制备用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂的方法，包括以下步骤:1)根据Genbank代号为NM_010239的铁蛋白重链基因序列信息人工合成目的基因并接 A flag标签蛋白序列，在其两端引入限制性内切酶NheI和BamHI识别位点，利用DNA连接酶将所述蛋白序列克隆入慢病毒载体；2)用SpeI和Xba I对步骤I)的慢病毒载体进行双酶切，酶切产物电泳后回收无CMV 的载体片段；3)从含hTERT的质粒中PCR扩增hTERT启动子片段重组入步骤2)的无CMV的载体片段构建成目的慢病毒载体；4)对步骤3)的慢病毒包装，采用pCD/NL-BH*DDD和pLTR-G包装质粒，293T包装细胞， 得到Lent1-hTERT-Fth-fIag-Puro慢病毒表达载体，即得诊断剂。
8.—种检测恶性肿瘤细胞的方法，权利要求1的诊断剂与恶性肿瘤细胞接触，将人端粒酶逆转录酶启动子和铁蛋白报告基因传染给肿瘤细胞过表达 ，用MRI扫描示踪肿瘤细胞。
【文档编号】C12N15/65GK103436558SQ201310353945
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】张冬, 杨燕, 文利 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院