一种表达cd133的重组腺病毒及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种表达CD133的重组腺病毒及其用途，所述重组腺病毒携带人CD133基因，能够在哺乳动物细胞中表达人CD133蛋白。本发明的重组腺病毒通过携带人CD133基因的重组穿梭质粒与病毒骨架质粒同源重组得到。本发明的重组腺病毒在哺乳动物细胞中表达人CD133蛋白的效率高、产量大。制备本发明重组腺病毒的方法简单、重复性强。
【专利说明】—种表达CD133的重组腺病毒及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质表达领域，具体涉及一种表达⑶133的重组腺病毒及其用途。 【背景技术】
[0002]近年来随着肿瘤干细胞理论的不断进步完善，肿瘤干细胞标志物CD133在肿瘤干细胞的分离奠定中也越来越被关注。CD133作为多种实体肿瘤干细胞表面的特异性标志物，在肿瘤的发生和发展中起重要作用，未来可将其作为一种新分子靶点，用于筛选并特异性杀伤肿瘤干细胞，直至杀死肿瘤细胞。除此之外，随着CD133+细胞在肿瘤靶向治疗中的研究越来越多，信号传导，免疫逃逸及耐药性和生物治疗的研究也成为近几年的热点(Horst D 等人.(2009)The cancer stem cell marker CD133has high prognostic impact but unknown functional relevance for the metastasis of human colon cancer.J Patho1219:427 - 434 ；Jao SW 等人.(2012)Cytoplasmic CD133expression is a reliable prognostic indicator of tumor regression after neoadjuvant concurrent chemoradiotherapy in patients with rectalcancer.Ann Surg Oncol 19:3432 - 3440 ；Horst D 等人.(2009) CD133and nuclear beta-catenin: the marker combination to detect high risk cases of low stage colorectal cancer.Eur J Cancer45:2034 - 2040.)。
[0003]目前，关于CD133的研究仍处于初级阶段，将来在筛选抗肿瘤干细胞药物、研制新疫苗和寻找新的分子基因治疗靶点等方面可能有所突破，并可为将来肿瘤的靶向治疗提供新的方向，为最终治疗恶性肿瘤提供新的途径。利用某些干细胞标志物与肿瘤细胞标志物相结合的方法确定肿瘤干细胞特异性的标志物，是当前肿瘤干细胞筛选的主要手段(Shmelkov SV 等人.(2008)CD133expression is not restricted to stem cells，and both CD133+and CD133-metastatic colon cancer cells initiate tumors.J Clin Investll8:2111 - 2120 ；Chapman MA 等人.(1998)Preoperative carcinoembryonic antigen is related to tumour stage and long-term survival in colorectal cancer.Br J Cancer78:1346 - 1349 ；Morales-Gutierrez C 等人?(1999) Survival of patients with colorectal carcinoma:possible prognostic value of tissular carbohydrate antigenl9.9determination.Cancerl99986:1675 - 1681.)。
[0004]腺病毒作为蛋白质表达载体具有很长的历史，并且在临床中也得到应用。腺病毒具有感染效率高，感染的宿主细胞和组织范围广，构建、制备、扩增相对简便，且腺病毒滴度较高等优点而受到广泛应用(Ng P等人.A high-efficiency Cre/loxP-based system for constrction of adenoviral. vectors.Hum Gene TherlO:2667-2672 ;Kamen A 等人.Development and optimization of an adenovirus production process.J Gene Med, 2004,6:184-192 ；He TC 等人? Asimplif ied system for generating recombinant adenovirus.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:2509-2514 ;Zeng M 等人? AdEasy system made easier by selecting the viral backbone plasmid preceding homologousrecombinanation.Bio Techniques,2001,13 (2):260-262 ；Ernst M 等人?STAT3and STATlmediate IL-11-dependent and inflammation-associated gastrictumorigenesis in gpl30receptor mutant mice[J].JClin Invest,2008，118 (5):1727-1738.)。
[0005]因此，使用腺病毒作为表达⑶133蛋白的载体具有可能性，并且在干细胞、信号传导、免疫逃逸及耐药性和生物治疗方面具有很大的潜力，具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种表达⑶133的重组腺病毒及其用途，该重组腺病毒能够高效表达、大量产生人⑶133蛋白。
[0007]为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案:
[0008]在第一方面，本发明提供一种表达⑶133的重组腺病毒，其携带人⑶133基因，优选地，所述人CD133基因的序列如SEQ ID NO:1所示(GenBank登录号为BC012089.1，方框表示起始密码子和终止密码子)。
[0009]|ATG|< GCCCTCGTACTCGGCTCCCTGTTGCTGCTGGGGCTGTGCGGGAACTCCTTTTCAGGAGGGCAG
CCTTCATCCACAGATGCTCCTAAGGCTTGGAATTATGAATTGCCTGCAACAAATTATGAGACCCAAGACTCCCATAA
AGCTGGACCCATTGGCATTCTCTTTGAACTAGTGCATATCTTTCTCTATGTGGTACAGCCGCGTGATTTCCCAGAAG
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CTGCTTGTGGAATAGACAGAATGAATTATGACAGCTACTTGGCTCAGACTGGTAAATCCCCCGCAGGAGTGAATCTTTTATCATTTGCATATGATCTAGAAGCAAAAGCAAACAGTTTGCCCCCAGGAAATTTGAGGAACTCCCTGAAAAGAGA
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GTATTCACAATCCTGTTATGACAAGCCCATCACAACAT-G- (SEQ ID NO:1)o
[0010]本发明提供的重组腺病毒，其表达人⑶133蛋白，优选地，所述人⑶133蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011 ] MALVLGSLLLLGLCGNSFSGGQPSSTDAPKAWNYELPATNYETQDSHKAGPIGILFELVHIFLYVVQPR DFPEDTLRKFLQKAYESKIDYDKIVYYEAGIILCCVLGLLFIILMPLVGYFFCMCRCCNKCGGEMHQRQKENGPFLR KCFAISLLVICIIISIGIFYGFVANHQVRTRIKRSRKLADSNFKDLRTLLNETPEQIKYILAQYNTTKDKAFTDLNS INSVLGGGILDRLRPNIIPVLDEIKSMATAIKETKEALENMNSTLKSLHQQSTQLSSSLTSVKTSLRSSLNDPLCLV HPSSETCNSIRLSLSQLNSNPELRQLPPVDAELDNVNNVLRTDLDGLVQQGYQSLNDIPDRVQRQTTTVVAGIKRVL NSIGSDIDNVTQRLPIQDILSAFSVYVNNTESYIHRNLPTLEEYDSYWWLGGLVICSLLTLIVIFYYLGLLCGVCGY DRHATPTTRGCVSNTGGVFLMVGVGLSFLFCWILMIIVVLTFVFGANVEKLICEPYTSKELFRVLDTPYLLNEDWEY YLSGKLFNKSKMKLTFEQVYSDCKKNRGTYGTLHLQNSFNISEHLNINEHTGSISSELESLKVNLNIFLLGAAGRKN LQDFAACGIDRMNYDSYLAQTGKSPAGVNLLSFAYDLEAKANSLPPGNLRNSLKRDAQTIKTIHQQRVLPIEQSLST LYQSVKILQRTGNGLLERVTRILASLDFAQNFITNNTSSVIIEETKKYGRTIIGYFEHYLQWIEFSISEKVASCKPV ATALDTAVDVFLCSYIIDPLNLFWFGIGKATVFLLPALIFAVKLAKYYRRMDSEDVYDDVETIPMKNMENGNNGYHK DHVYGIHNPVMTSPSQH (SEQ ID NO:2)。
[0012]由于密码子的简并性，本发明所述人CD133基因的序列还可以包括任何能编码 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0013]优选地，构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为pShuttle-CMV ；
[0014]优选地，构建所述重组腺病毒所用的病毒骨架质粒为pAdeasy-1 ；
[0015]优选地，构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为哺乳动物细胞，优选人胚肾293 细胞。
[0016]在第二方面，本发明提供一种重组腺病毒质粒，其通过携带人⑶133基因的重组穿梭质粒与病毒骨架质粒同源重组得到；
[0017]优选地,所·述重组穿梭质粒为pShuttle-CMV携带人⑶133基因构成的,本发明中表示为 pShuttIe-CMV-CD133 ；
[0018]优选地，所述病毒骨架质粒为pAdeasy-1 ；
[0019]优选地，所述同源重组发生在大肠杆菌内，优选大肠杆菌BJ5183。
[0020]在第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的重组腺病毒质粒的构建方法，所述构建方法包括将线性化的重组穿梭质粒pShuttIe-CMV-⑶133转化包含病毒骨架质粒 pAdeasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183进行同源重组，筛选阳性克隆，并从所述阳性克隆中提取所述重组腺病毒质粒；
[0021]优选地，所述线性化为PmeI酶切线性化；
[0022]优选地，所述筛选阳性克隆为使用含卡那霉素的LB培养基平板筛选；
[0023]任选地,还包括将所述重组腺病毒质粒转化感受态大肠杆菌DH10B,并大量抽提质粒备用。
[0024]在第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组腺病毒的制备方法，所述制备方法包括将如第二方面所述的重组腺病毒质粒线性化后转染哺乳动物细胞、优选人胚肾 293细胞，至出现明显细胞病变效应后，收集细胞，反复冻融，离心得到包含所述重组腺病毒的上清液；
[0025]优选地,所述线性化采用PacI酶切线性化；
[0026]优选地，-70°C和37°C交替条件下反复冻融2?4次，优选3次；
[0027]任选地，还包括将所述上清液感染哺乳动物细胞、优选人胚肾293细胞以扩增所
述重组腺病毒。
[0028]在第五方面，本发明提供一种表达⑶133蛋白的方法，所述方法包括用如第一方面所述的重组腺病毒感染哺乳动物细胞、优选人胚肾293细胞，使CD133蛋白在所述细胞中表达。
[0029]本发明提供的表达⑶133蛋白的方法，还可以是用如第二方面所述的重组腺病毒质粒线性化后转染哺乳动物细胞、优选人胚肾293细胞，使CD133蛋白在所述细胞中表达。
[0030]在第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组腺病毒在⑶133蛋白表达中的用途。
[0031]本发明还提供一种如第二方面所述的重组腺病毒质粒在⑶133蛋白表达中的用途。
[0032]本发明的有益效果为:
[0033]本发明首次用重组腺病毒作为表达载体，在哺乳动物细胞(特别是人胚肾293细胞)中成功表达了人⑶133蛋白，本发明重组腺病毒能够高效表达、大量产生人⑶133蛋白。 本发明重组腺病毒质粒构建方法简单、重复性强，能够快速转染哺乳动物细胞，经包装得到本发明的重组腺病毒。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1是质粒pCMV6-AC-GFP的图谱。
[0035]图2是质粒pShuttle-CMV的图谱。
[0036]图3是质粒pAdeasy-1的图谱。
[0037]图4是重组pShuttIe-CMV-CD133的酶切鉴定结果，其中M表示Ikb DNAmarker ；1 表示重组pShuttIe-CMV-⑶133的XhoI酶切结果，得到一条大小约2.5kb的全长⑶133片段和一条pShuttle-CMV片段；2表示阴性对照，即pShuttle-CMV的XhoI酶切结果，得到一条 pShuttle-CMV 片段。
[0038]图5是重组腺病毒质粒pAd-⑶133的PCR鉴定结果，其中M表示DNAmarker ；1表示阴性对照，即未重组⑶133基因的病毒质粒pAdeasy-1的PCR扩增结果；2表示重组腺病毒质粒pAd-⑶133的PCR扩增结果，使用⑶133特异性引物扩增得到预期大小的900bp左右的片段，提示⑶133基因成功的重组到pAdeasy-1质粒中。
[0039]图6是重组腺病毒成功包装后的显微镜镜检结果(20倍)，从左至右依次为病毒稀释10_6、10_4和10_2倍，图中黑色斑点为病毒颗粒，提示重组腺病毒在细胞内的增殖。
[0040]图7是表达的⑶133蛋白的Western Blot检测结果，其中M表示蛋白质标准分子量；1表示重组腺病毒vAd-⑶133在人胚肾293细胞中表达⑶133蛋白的情况；2表示阴性对照，即未重组CD133基因的病毒质粒的转染的细胞的蛋白提取物检测结果；3表示阳性对照，即高表达CD133的CACO细胞蛋白提取物检测结果；GAPDH表示甘油醛_3_磷酸脱氢酶作为内参。
【具体实施方式】
[0041]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0042]本发明所用材料如下:
[0043]主要质粒、菌株和细胞:腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdeasy-1、大肠杆菌BJ5183、人胚肾293细胞和CACO细胞购自美国stratagene公司；全长CD133cDNA质粒购自美国OriGene公司JM109感受态细菌由美国南佛罗里达大学医学院馈赠。
[0044]主要酶和试剂:DNA Marker、限制性内切酶Xhol、Pac1、PmeI购自NewEngland Biolabs公司；质粒提取试剂盒购自Promega公司；QIAquick DNA凝胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶购自Takara公司；DNA转染试剂 lipofectamine2000、Opt1-MEM 购自 Invitrogen 公司;TRIzol、DMEM 培养液、RPM1-1640, 胎牛血清购自GIBCO公司；胰蛋白酶、脂多糖购自Sigma公司；快速腺病毒感染性滴度检测试剂盒购自本元正阳基因技术有限公司；免疫印迹试剂盒(Bio-Rad, Richmond, CA，USA)； CD 133 抗体及其二抗(Mi ItenyiBiotec, Auburn, CA, USA)。
[0045]实施例1重组pShuttIe-CMV-CD133的构建和鉴定
[0046]将带有XhoI酶切 位点的⑶133全长质粒pCMV6-AC-GFP (其图谱如图1)的DH5 a 大肠杆菌于含氨苄青霉素的培养基平板划线涂板，37°C培养过夜，挑取单克隆，LB培养基摇菌过夜，用质粒提取试剂盒抽提质粒。
[0047]将质粒和pShutt Ie-CMV(其图谱如图2)经XhoI进行酶切，然后过胶回收CD 133片段和pShuttle-CMV，经T4DNA连接酶，16°C过夜连接，直接取反应终产物10 y L转化JM109 感受态细菌，用含卡那霉素的LB培养基平板筛选阳性克隆，挑出5个克隆在含卡那霉素的 LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒抽提质粒后，用XhoI内切酶进行酶切鉴定(图4)，正确克隆命名为 pShuttIe-CMV-CD133。
[0048]实施例2重组腺病毒质粒的构建和鉴定
[0049]取pShuttle-CMV-O)133 质粒 10 U L,经 PmeI 酶切线性化后，转化包含 pAdeasy-1 (其图谱如图3)的感受态BJ5183菌进行同源重组。
[0050]用含50mg/L卡那霉素的LB培养基平板筛选阳性克隆，用含卡那霉素的LB液体培养基于37°C、200r/min条件下,摇菌过夜,用质粒提取试剂盒抽提质粒。[0051]根据设计的引物(OriGene，美国)进行PCR扩增，正向引物F: 5’ -AGATCCAGTGCTTCCTGC-3’ (SEQ ID NO:3);反向引物 R:5’ -CTGTTCATGTTCTCCAACG-3’ (SEQ ID NO:4)。PCR 扩增的程序:94°C 3min ;然后 94°C lmin、55°C lmin、72°C 3min，33 个循环；72°C延长lOmin。凝胶电泳检测扩增片段(图5)，鉴定证明重组腺病毒质粒构建正确， 重组腺病毒质粒命名为pAd-⑶133。转化感受态DH10B，大量抽提质粒备用。
[0052]实施例3重组腺病毒的包装与扩增
[0053]将人胚肾293细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中常规培养。将pAd_⑶133 经Pac I酶切，凝胶回收线性化的pAd-⑶133。转染前24小时接种人胚肾293细胞，转染时细胞融合至70%?80%，在脂质体介导下转染人胚肾293细胞，第4天在出现明显的细胞病变效应(CPE)后，收集细胞，-70°C与37°C交替条件下，反复冻融3次，2000r/min离心lOmin，取部分病毒上清感染人胚肾293细胞以扩增重组腺病毒，并将重组腺病毒命名为vAd-⑶133。一般地，将病毒上清反复感染人胚肾293细胞扩增重组腺病毒，随传代次数增加，重组腺病毒感染性稳定且增强，致细胞病变作用的时间缩短，通常传至第4.0-5.0代时，在接种病毒后24-48h，此时收获病毒。
[0054]实施例4重组腺病毒滴度的测定
[0055]将人胚肾293细胞接种于96孔板中，每孔IX IO4个细胞，浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中，培养68h后，冰预冷甲醇固定细胞，先后加入抗腺病毒单抗、 酶标二抗和显色底物(本元正阳基因技术有限公司)，20-40倍显微镜下计数出现褐色或黑色的细胞斑点孔数(图6)，按试剂盒说明计算病毒滴度为9.0X10npfu/mL。
[0056]实施例5Western Blot检测表达的⑶133蛋白
[0057]在5X IO5人胚肾293细胞/孔的24孔板中每孔加入500 ii L DMEM5%培养液，然后再每孔加入200 u L初次病毒扩增保存液感染48小时。确证所有细胞均出现CPE，如果CPE 不完全则再延长感染24小时，取出400 ii L转入1.5mL试管中，其余-80°C冻存。800rpm离心5分钟，弃上清后用20 ii L PBS缓冲液重悬细胞，用P20移液枪充分混匀重悬细胞。加入 20 u L2 X Laemmli缓冲液，煮沸5分钟，SDS-PAGE上样，电泳；然后电转移至PVDF膜上，经 5%脱脂奶粉25°C封闭6h;加入鼠抗⑶133单克隆抗体(I: 1000稀释)，4°C孵育过夜；力口入HRP标记的山羊抗鼠IgG (I: 3000稀释) ，室温孵育Ih;用增强型ECL化学发光试剂显色，结果如图7所示，显示⑶133蛋白较高的表达效率。
[0058] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种表达⑶133的重组腺病毒，其特征在于，其携带人⑶133基因，优选地，所述人 CD 133基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，其表达人⑶133蛋白，优选地，所述人CD 133蛋白的序列如SEQ ID NO: 2所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组腺病毒，其特征在于，构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为 pShuttIe-CMV ；优选地，构建所述重组腺病毒所用的病毒骨架质粒为pAdeasy-1 ；优选地，构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为哺乳动物细胞，优选人胚肾293细胞。
4.一种重组腺病毒质粒，其特征在于，其通过携带人CD133基因的重组穿梭质粒与病毒骨架质粒同源重组得到；优选地，所述重组穿梭质粒为pShuttle-CMV携带人⑶133基因构成的；优选地，所述病毒骨架质粒为pAdeasy-1 ；优选地，所述同源重组发生在大肠杆菌内，优选大肠杆菌BJ5183。
5.如权利要求4所述的重组腺病毒质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将线性化的重组穿梭质粒pShuttIe-CMV-⑶133转化包含病毒骨架质粒pAdeasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183进行同源重组，筛选阳性克隆，并从所述阳性克隆中提取所述重组腺病毒质粒；优选地，所述线性化为PmeI酶切线性化；优选地，所述筛选阳性克隆为使用含卡那霉素的LB培养基平板筛选；任选地,还包括将所述重组腺病毒质粒转化感受态大肠杆菌DH10B,并大量抽提质粒备 用。
6.如权利要求1至3中任一项所述的重组腺病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将如权利要求4所述的重组腺病毒质粒线性化后转染哺乳动物细胞、优选人胚肾 293细胞，至出现明显细胞病变效应后，收集细胞，反复冻融，离心得到包含所述重组腺病毒的上清液；优选地，所述线性化采用PacI酶切线性化；优选地，-70°C和37°C交替条件下反复冻融2?4次，优选3次；任选地，还包括将所述上清液感染哺乳动物细胞、优选人胚肾293细胞以扩增所述重组腺病毒。
7.—种表达⑶133蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括用如权利要求1至3中任一项所述的重组腺病毒感染哺乳动物细胞、优选人胚肾293细胞，使CD133蛋白在所述细胞中表达。
8.—种表达CD133蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括用如权利要求4所述的重组腺病毒质粒线性化后转染哺乳动物细胞、优选人胚肾293细胞，使CD133蛋白在所述细胞中表达。
9.如权利要求1至3中任一项所述的重组腺病毒在⑶133蛋白表达中的用途。
10.如权利要求4所述的重组腺病毒质粒在⑶133蛋白表达中的用途。
【文档编号】C12N15/861GK103436556SQ201310353962
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】沈政 申请人:沈政