一种利用scar技术鉴别金龙胆草及其混淆品的scar引物及其方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物及其方法，提取混淆品植物的基因组DNA，将样品的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，其SCAR-PCR扩增体系为：25μL体系中含有Mg2+2.5mmol/L，dNTPs4.5mmol/L，引物SC1、引物SC2各1.5μmol/L，DNA模板60ng，Taq酶1.5U；扩增程序为：94℃预变性4min，然后进行40个循环：94℃变性1min、36℃复性1min、72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存；扩增结果有目的条带的即为金龙胆草真品。方法更为客观易行，时间短、准确性高，重复性好。
【专利说明】—种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物及其方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的方法。
【背景技术】
[0002]金龙胆草为菊科白酒草属植物苦蒿ConyzabliniiL6vl.的干燥地上部分,分布于云南中、南部，四川攀西地区及贵州部分地区。系70年代四川省发掘的民间草药，具有清热化痰，止咳平喘，解毒利湿，凉血止血的功效，近年来的研究更报道其具有一定的抗肿瘤活性，应用前景广阔。
[0003]金龙胆草的民间俗称为“苦蒿”，但名为“苦蒿”的植物却不止一种，且部分植物在形态与化学成分上与金龙胆草相近，使得收购药材时很难识别混淆品，影响金龙胆草的品质。中草药传统的鉴定方法主要是性状或组织显微鉴别，以及有效成分含量的指纹图谱区分道地产品，这些方法各有优缺点或局限性，且需时较长。随着分子遗传标记技术的发展，利用分子手段进行药用植物的遗传分析，可以使鉴别过程不受样品形态、外部条件变化、发育时期、次生代谢物含量等因素的影响，更客观、可靠得提供准确鉴别。
[0004]RAPD技术是建立在PCR基础之上的一种DNA分子标记之一，可通过多个不同的随机引物给出覆盖整个基因组的多态性信息。因其具有快速、简便、高效、周期短等特点，近年来，在遗传育种及遗传多样性等方面都得到了广泛的运用，尤其在寻找不同样品间DNA的差异上被广泛应用。SCAR分子标记，即序列特异扩增区域标记，是以RAH)技术为基础的一种新型分子标记，在对RAH)特异扩增条带测序的基础上，设计一对特异引物，并利用此引物对基因组DNA进行PCR扩增，以检测样品是否为混淆品。此方法简单，稳定，重复性好，且带型简单，可直观利用“有或无”条带观测实验结果，因此，SCAR标记已逐渐成为分子遗传育种、植物品系鉴定的首选技术。
[0005]传统鉴定技术主要以性状或显微、化学鉴别为主，存在一定的局限性，无法准确区分化学成分相近，外观形态相似的金龙胆草及其混淆品。金龙胆草在外形上与白酒草属植物白酒草，蒿属植物艾草相似，同时由于民间俗名均为“苦蒿”，也易与青蒿混淆。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的方法。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物，所述SCAR引物包括引物SCl和引物SC2，引物SCl和引物SC2序列如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
[0009]所述SCAR引物鉴别金龙胆草及其混淆品的方法，包括以下步骤:提取混淆品植物的基因组DNA，将样品的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，其SCAR-PCR扩增体系为:25 μ L体系中含有 Mg2+2.5mmol/L, dNTPs4.5mmol/L,引物 SC1、引物 SC2 各 1.5 μ mol/L, DNA 模板60ng，Taq酶1.5U ;扩增程序为:94°C预变性4min，然后进行40个循环:94°C变性lmin、36°C复性lmin、72°C延伸2min,循环结束后72°C延伸IOmin, 4°C保存；扩增结果有目的条带的即
为金龙胆草真品。
[0010]本发明针对金龙胆草DNA序列的特异性，建立了金龙胆草基因组DNA的RAPD指纹图谱，成功获得一个特异SCAR标记，应用这个标记，可以根据凝结电泳判定样品是否为混淆品，方法更为客观易行，时间短、准确性高，重复性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1:18个金龙胆草样品的基因组DNA凝胶电泳图；
[0012]图2:H37的RAPD特异扩增图谱；
[0013]图3 =SCAR转化后的金龙胆草特异扩增图谱；
[0014]图4:左起为marker，1-3分别为白酒草、青蒿和艾草的RAPD扩增谱图
[0015]图5:左起为marker，1-4分别为白酒草、青蒿、艾草和金龙胆草的SCAR扩增谱图
【具体实施方式】
[0016]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0017]本发明涉及到的SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的方法，具体包括以下步骤:
[0018]1、采用改良的SDS 法提取18个不同地区采集的金龙胆草基因组DNA (图1)，方法为取约0.15g新鲜叶片(干样取三分之一重)置于研钵中以液氮快速研磨为粉末，将粉末快速转移至 1.5mLEppendorf 管中，加入 800 μ L 提取缓冲液(1.4%SDS, IOOmmoI/LTris-HcI,50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，临用前加入 0.1%14.4mol/LP -巯基乙醇及 2%PVP)，65°C水浴40min至溶液变为土黄色,加入150 μ IKAc,充分混匀,冰浴30min以沉淀蛋白质；室温下12000r/min离心15min，上清液加入200 μ I氯仿/异戊醇(24:1)混匀，12000r/min离心lOmin，反复操作2-3次；上清液加入0.6倍体积异丙醇(_20°C预冷)，-20°C冷却30min ;离心5min收集沉淀。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量，以λ DNA/HindIII为Maker，核酸蛋白仪(Bio-Rad公司)测定DNA浓度和蛋白质残留。
[0019]表1供试实验材料
[0020]
【权利要求】
1.一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物，所述SCAR引物包括引物SCl和引物SC2，引物SCl和引物SC2序列如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
2.根据权利要求1所述SCAR引物鉴别金龙胆草及其混淆品的方法，其特征在于，包括以下步骤:提取混淆品植物的基因组DNA，将样品的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，其SCAR-PCR 扩增体系为:25 μ L 体系中含有 Mg2+2.5mmol/L, dNTPs4.5mmol/L,引物 SC1、引物SC2各1.5 μ mol/L, DNA模板60ng, Taq酶1.5U ;扩增程序为:94°C预变性4min,然后进行40个循环:94°C变性lmin、36°C复性lmin、72°C延伸2min，循环结束后72°C延伸10min，4°C保存；扩增结果有目的 条带的即为金龙胆草真品。
【文档编号】C12N15/11GK103589783SQ201310373522
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】陈惠 , 刘姗, 孙荣, 唐自钟, 高静雷, 李成磊, 韩学易, 吴琦, 黄晓燕 申请人:四川农业大学