与猪脂肪沉积性状相关的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种动物分子标记，具体涉及猪ECI1基因片段的克隆及作为分子标记的应用。所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示，在第157位有一个C157-T157碱基突变，导致Bsm?Ⅰ-RFLP多态性。
【专利说明】与猪脂肪沉积性状相关的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物分子标记领域，具体地说，涉及一种与猪脂肪沉积性状相关的ECIl基因作为分子标记的应用。
【背景技术】
[0002]养猪业是我国畜牧业生产的主体，其产值长期以来始终都是畜牧业总产值的第一位。随着人们生活水平的提高，对肉食品的数量和质量需求不断提高，如何培育出高瘦肉率、高肌内脂肪的猪种是当前猪育种工作的热点。
[0003]我国猪种资源丰富，为猪育种提供良好的素材，也为研究重要经济性状的基因和分子标记提供良好的材料。藏猪是我国特有的高原型猪种，体小皮薄、肉嫩味美，风味浓郁，肉质细腻、风味独特，素有“高原之珍”的美誉(刘轩，强巴央宗，王强等.藏猪繁殖性状多基因效应分析.遗传，2010,32(5):480-485)。滇南小耳猪是云南省西双版纳州小型地方品种，具有适应热带雨林的区高温潮湿的生态环境，早熟易肥、抗逆性强、皮薄骨细、肉质鲜嫩、营养丰富等优点(马俊松，马启文，段勇，连林生.原生态养殖版纳小耳猪肥育性能、胴体及肉质测定.养猪，2009，(2):37-38)。淮猪是原产淮北平原的古老地方品种，具有繁殖力高、肉质细嫩、在地方猪种瘦肉率较高等特点(张东红，王立克，陶立，王重龙，李庆岗，陈良云.淮猪及杂交后代肌纤维直径变化及其与肉质关系的研究.畜牧与兽医，2005，37(9):9-11)。藏猪、滇南小耳猪和淮猪是我国特色的地方猪种，具有生长速度慢、沉脂能力强、抗逆、抗病、耐粗饲，尤其肉质细腻、肉嫩味美，风味独特。大白猪(大约克夏)是世界上著名的、分布最广的主导瘦肉型猪种，生长速度快，但肉质较差。淮猪新品系利用淮猪为基本素材培育的瘦肉型猪新品系，具有肉质优、瘦肉率高、饲料报酬高、产仔数多、搞病力强、抗应激、适应环境能力强等优点(李庆岗，许金根，陶立.淮猪新品系I系胴体及肉质性能世代选育进展.养猪，2009，(4):33-34)。以上不同脂肪性状的猪是研究猪脂肪沉积性状基因的良好材料。`
[0004]随着分子数量遗传学、分子生物学技术的飞速发展，有关分子遗传标记和标
[0005]记辅助选择的研究被广泛开展，并在畜禽育种中应用，产生了巨大的影响。月旨肪沉积性状是猪育种中选择的主要目标之一，不同品种或类型的猪脂肪沉积有明显的差另IJ。从分子水平上鉴定影响脂肪沉积的基因或标记是目前猪功能基因研究的热点之一(Aslan 0，Hamill Rj Davey Gj McBryan J，Mullen A，Gispert Mj Sweeney T:Variationin theIGF2gene promoter region is associated with intramuscular fat contentinporcine skeletal muscle.Mol Biol Rep,2012, 9 (4):4101 - 4110)0 研究者曾通过对基因的多态性与表型性状的关联分析及定量表达测定，认为脂肪酸结合蛋白基因(FABP) (Chang W，Richers-Haunerland J，Haunerlang NH.1nduction of cardiac fabpgene expression by long chain fatty acids in cultured rat muscle cells.MolCell Biochem2001，221:127-132)、脂肪酸合成酶(FAS) (Clarke Rj Lbutlton RF.LarkM.The successful translocation of an endangered species with a complex socialorganisation:The black-eared miner.Abstract Volume of the23rd InternationalOrnithological Congress.2002, 191-192)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)(李芳琼，刘海峰，朱砺.罗格列酮和血清对猪前脂肪细胞诱导分化过程中PPARa和PPAR Y基因表达的影响(英文)[J].Agricultural Science&Technology，2011，5 (06):893_896)、长链脂 CoA 合成酶(ACSL) (Zhan Tj Poppelreuther M，Ehehalt Rj FiillekrugJ.0verexpressed FATPlj ACSVL4/FATP4and ACSLlincreasethe cellular fatty aciduptake of3T3_Lladipocytes but are localized on intracellular membranes.PLoS0NE2012，7(9):e45087)等与猪的脂肪沉积有关。但目前，在猪分子育种实践中仍然缺少功能明确、效应显著主效基因和分子标记。
[0006]Δ 3-Λ 2-双烯酯酰-辅酶A异构酶(ECIl)是生物体内核编码的酶，是线粒体中参与β氧化过程中奇数位置双键新陈代谢所必须的辅酶，它通过将不同位置和长度的反式或顺式-3烯酯酰辅酶A转化为反式-2烯酯酰辅酶A来催化β-氧化反应，是该途径的关键辅酶。研究表明，该基因编码的酶对鼠和人的不饱和脂肪酸β_氧化有调控作用(Palosaari PM，Kilponen JMj Sormunen RTj et al.Δ 3- Δ 2-enoyl-CoAisomerases.Characterization of the mitochondrial isoenzyme in the rat.JBIOL CHEM1990, 265(6 ):3347-3353;Hiltunen JKjQin Y.Beta-oxidation-strategiesfor the metabolism of a wide variety of acyl-CoA esters.Biochim.Biophys.Acta.2000，1484:117 - 128)。小鼠线粒体ECIl基因被敲除后会引起很多脂肪酸新陈代谢过程中的改变，诸如肝的脂肪变性和尿液中中间产物不饱和乙二酸的增加(JanssenU and Stoffel W.Disruption of mitochondrial beta-oxidation of unsaturatedfatty acids in the3，2-trans-enoyl-CoA inomerase—deficient mouse.J BiolChemj2002，277(22):19576-19584)。
[0007]基于该基因在生长发育过程中起到的重要作用， 申请人:推测猪ECIl基因可能在影响猪脂肪沉积中起到重要作用，因此将猪ECIl基因作为脂肪沉积的候选基因，采用电子克隆及PCR测序获取猪ECIl基因序列，并PCR测序技术筛选不同类型猪群体间差异的SNP位点，建立了快速检测方法，获得了影响猪脂肪沉积的SNP位点及基因型效应。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克隆与猪脂肪沉积性状相关的ECIl基因，寻找ECIl基因的突变位点以及作为猪脂肪沉积相关基因的多态性检测方法，为标记辅助育种提供一种有用的分子标记。
[0009]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种与猪脂肪沉积性状相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所述，在第157位有I个C157-T157碱基突变，导致Bsm 1-RFLP 多态性。
[0010]所述碱基突变的位点位于猪ECIl基因第3内含子第54bp处，命名为Intron3-C54To
[0011]本发明还提供一种所述分子标记的制备方法，其以猪基因组DNA为模板，设计引物，进行PCR扩增，目的在于扩增包含Intron3-C54T位点的DNA序列。所述引物的核苷酸序列如下:[0012]正向引物:5’ -GCTGCCTCCTCTCCCTCA-3 ’ ；
[0013]反向引物:5，-GGAACAGCCAGCCACTTG-3’。
[0014]PCR 反应体系为 25 μ L，其中 10XPCR Buffer2.5 μ L，lOmmol/LdNTP mix2.0 μ L,5pmol/ μ L 的引物各 I μ L，Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0.5 μ L，DNA 模板 I μ LCDNA 约 lOOng),加 dd H20 M 25 μ L0
[0015]PCR 反应条件为 95°C 预变性 5min ;95°C变性 30s，65°C 复性 30s，72°C 延伸 20s，36个循环；72°C延伸7min ;降温至4°C保持。
[0016]具体地说，所述分子标记的获得是通过以下步骤实现的:
[0017]1、猪ECII基因的克隆测序
[0018]在NCBI 网站上(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/database/indem html)同源比对人ECIl 基因(NM_001919)，获得猪ESTs序列，经过多次BLAST、比对和拼接，最后得到1401bp的电子克隆序列，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。根据SEQ ID N0.2序列设计引物ECIl-1和ECI1-2 (见表1)，PCR扩增猪ECIl基因mRNA序列，纯化回收扩增产物并连接到PEASY-T3克隆载体，转染Transl-Tl感受态细胞，培养并鉴定重组质粒，测序，连接ECIl-1和ECI1-2产物序列，以确证所述电子克隆序列的正确性。
[0019]2、猪ECIl基因SNP筛选
[0020]将克隆测序得到的猪ECIl基因mRNA序列在UCSC网站(http://genome, ucsc.edu/)猪基因组数据库中BLAT，得到该基因的定位和DNA序列，设计3对引物ECI1-3、ECI1-4和ECI1-5 (见表I)。以藏猪、滇南小耳猪和大约克猪基因组DNA为模板，利用上述3对引物，扩增ECIl基因的所有外显子和部分内含子序列。对扩增得到的PCR产物进行测序，比对，筛选群体间突变频率差异的SNPs位点，结果在猪ECIl基因第3内含子第54bp处发现C/T碱基突变，命名为Intron3-C54T。
[0021]3、猪ECIl基因分子标记检测方法，具体步骤如下:
[0022]针对筛选到的猪ECIl基因的Intron3-C54T突变位点，设计引物ECI1_6(见表1)，目的扩增包含Intron3-C54T突变位点的DNA序列，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0023]其中:序列表SEQ ID N0.1所述的第157bp处有一个位于ECIl第3内含子第54bp处的c/τ碱基突变，该突变可被Bsm I内切酶识别。
[0024]表1.猪ECIl基因PCR引物
[0025]
【权利要求】
1.一种与猪脂肪沉积性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQID N0.1所示，在第157位有I个C157-T157碱基突变，导致Bsm 1-RFLP多态性。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述碱基突变的位点为Intron3-C54T位点，位于猪ECIl基因第3内含子第54bp处。
3.权利要求1所述的分子标记的制备方法，其特征在于，以猪基因组DNA为模板，设计引物，进行PCR扩增，目的在于扩增包含Intron3-C54T位点的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下: 正向引物:5’ -GCTGCCTCCTCTCCCTCA-3，； 反向引物:5’ -GGAACAGCCAGCCACTTG-3’。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，PCR反应体系为25μ L，其中IOXPCR Buffer2.5μ L，10mmol/L dNTP mix2.0 μ L，5pmol/μ L 的引物各 I μ L，Taq DNA 聚合酶(5υ/μ L) 0.5μ L, DNA 模板 I μ L (DNA 约 lOOng)，加 dd H20 至 25μ L。
6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，PCR反应条件为95°C预变性5min ;95°C变性30s，65°C复性30s，72°C延伸20s, 36个循环；72°C延伸7min ;降温至4°C保持。
7.一种用于扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其核苷酸序列如下: 正向引物:5’ -GCTGCCTCCTCTCCCTCA-3，； 反向引物:5’ -GGAACAGCCAGCCACTTG-3’。
8.权利要求1所述的分子标记在猪标记辅助选择中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103451180SQ201310373535
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】张 浩, 鲁云风, 强巴央宗, 李庆岗, 吴克亮, 张博, 王志秀 申请人:中国农业大学