纤维素分解酶、其编码核酸及制备和使用它们的方法
【专利摘要】本发明提供具有任何纤维素分解活性例如纤维素酶活性的多肽，编码这些多肽的多核苷酸，以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。本发明涉及具有任何纤维素分解活性例如纤维素酶活性例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或寡聚体酶活性的多肽，编码这些酶的多核苷酸，以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。本发明提供具有寡聚体酶活性的多肽，例如，在生物质的糖化过程中将难分解可溶性寡聚体转化为可发酵的糖类的酶。本发明的多肽可用于多个药学、农业、食物和饲料加工以及工业领域。本发明还提供包含具有本发明的至少一种酶的酶混合物的组合物或制备产品。
【专利说明】纤维素分解酶、其编码核酸及制备和使用它们的方法
[0001]本申请是分案申请，原申请的申请日为2006年12月8日、申请号为200680054166.5 (PCT/US2006/046919)、发明名称为“纤维素分解酶、其编码核酸及制备和使用它们的方法”。
[0002]政府支持
[0003]本发明是依据能源部提供的第1435-04-03-CA-70224、1435-04-04-CA-70224 和DE-FC36-03G013146号DOE合同，在美国政府的支持下进行的。美国政府在本发明中享有一定的权利。
[0004]光盘提交
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发明领域
[0006]本发明涉及分子细胞生物学和生物化学。一方面，本发明提供具有纤维素分解活性例如纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、3 -葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶(mannanse)、木糖苷酶(例如，P _木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或寡聚体酶(oligomerase)活性的多肽、编码这些多肽的多核苷酸以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。一方面，本发明提供具有寡聚体酶活性的多肽(例如，在生物质的糖化中将可溶性寡聚体转化为可发酵的单体糖的酶)、编码这些酶的多核苷酸以及这些多核苷酸和多肽的制备和使用。一方面，本发明提供本发明多肽的热稳定和耐热形式。本发明多肽可用于多个药学、农业和工业领域。
[0007]发明背景
[0008]纤维素是地球上最丰富的可更新资源。它由直链的P 1-4葡萄糖单元和纤维二糖(具有如图5所示的结构的葡萄糖二聚体)重复单元组成。此聚合体被包括内切葡聚糖酶(EG)(随机水解所述纤维素聚合体)和纤维二糖水解酶(CBH)(从纤维素移除末端的纤维二糖残基)的一组酶降解。纤维二糖和纤维寡糖被3 -葡糖苷酶(BG)水解为葡萄糖。所有这三种酶都是将纤维素完全分解为葡萄糖所必需的。对于这三种酶中的每一种，都存在执行相同功能的不同结构的变体。此外，除不同结构的变体外，已知真菌和细菌可生产多种形式的相同结构的变体。
[0009]进一步使此系统变复杂的事实是，已知一些厌氧性细菌和真菌以多酶复合体形式产生这些酶，所述多酶复合体包含均连接至分子量超过200万道尔顿的酶支架的多个酶。为什么一个如此简单的分子必须使用一个如此复杂的酶系统？ 一些研究人员认为这种复杂性是由于底物的难分解性。纤维素链形成微原纤，该微原纤通过相邻链的氢键连接包装成晶态基质。此结构对化学或酶学降解具有高度的抗性。
[0010]CBH由于其对纤维素的酶攻击性而被认为是降解此晶态纤维素的关键酶。与CBH不同，EG具有以垂直的角度攻击纤维素链的开放的裂缝。CBH通过包含活性位点的通道直接攻击纤维素链。目前的看法是纤维素链进入该通道，与此同时，相邻的氢键连接被断裂。一旦纤维二糖水解酶在底物上建立此“立足处”后，则EG即可进入，并且更容易攻击所述底物。[0011]已知的CBH的主要缺陷是它们的低催化活性。一些研究组认为此低活性是因为水解的能量被转化为断裂氢键和使酶沿所述底物前进的动能。CBH是外切作用(exo-acting)酶，并发现于90个糖基水解酶家族中的6个家族。它们包括家族5、6、7、9、10和48。家族5包含许多不同类型的糖基水解酶,包括纤维素酶、甘露聚糖酶(mannanase)和木聚糖酶。虽然此家族内的大多数纤维素酶为内切葡聚糖酶，但是也有纤维二糖水解酶的实例，最显著的是来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的CelO。家族6仅包含内切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶，并且纤维二糖水解酶成员要多于内切葡聚糖酶。这些酶具有转化机制(inverting mechanism),并且晶体学研究暗示,该酶具有包含7个而不是8个平行P -链的扭曲的a/0桶结构。家族7的酶同样由内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶两种酶组成，具有更多的纤维二糖水解酶，并且仅有来自真菌的已知成员。该酶具有保留机制(retainingmechanism),并且晶体结构显示为P -果酱卷(0-jellyroll)结构。家族9包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和3 -葡糖苷酶，并以内切葡聚糖酶占优。但是，褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)产生内切/外切-1，4_葡聚糖酶,其晶体结构显示为(a/a)6桶折叠。该酶兼有内切和外切-葡聚糖酶CBH的性质。家族10仅包含2个纤维二糖水解酶成员，其余主要是木聚糖酶。家族10的纤维二糖水解酶和木聚糖酶具有对甲基-伞形酮(umbelIiferyl)纤维二糖苷的活性。家族48主要包含细菌和厌氧性真菌的纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。其结构为类似于家族9的(^/^)6桶折叠。
[0012]需要更加廉价和可再生的道路车辆燃料来源。新的燃料来源如果在燃烧后产生无害的终产物，则其将更具吸引力。乙醇是基于石油的燃料的有吸引力的替代品，其可通过发酵衍生自淀粉或木素纤维素的单体糖而获得。但是，由于乙醇的生产成本高，目前的经济条件并不支持其广泛使用。旨在降低成本的一个研究领域是增强可用于从生物质(例如，包含木素纤维素的组合物)产生可发酵的糖的酶的技术功效。更有效地消化生物质(例如，原料)的酶的开发将转化为乙醇生产成本的降低。更有效的过程将降低美国对外国石油的依赖和可能与此依赖有关的价格波动。使用更加清洁的运输燃料(像生物乙醇)可减少CO2净排放，而CO2净排放被认为是造成全球变暖的部分原因。
[0013]由于生物质的复杂性，其转化为单体糖类涉及多种不同酶类的作用，如图6、7、8、62和63所示，这些图包括参与纤维素(图6、7和63)和半纤维素(图8和62)的消化的酶的示意图。生物质主要由糖类和非糖类物质组成。所述糖类可细分为纤维素((6-1, 4连接的葡萄糖部分的直链聚合体)和半纤维素(由3-1，4连接的木糖主链和阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和葡糖醛酸支链组成的复杂支链聚合体)。有时，木糖可被乙酰化，而阿拉伯糖可包含至其他半纤维素链或木质素的阿魏酸酯或肉桂酸酯。生物质的最后一种主要成分是木质素，一种高度交联的类苯基丙烷(phenylpropanoid)结构。纤维素酶将纤维素转化为葡萄糖，并且包括:(I)断裂内部的(6-1, 4糖苷键而生成链更短的葡糖寡糖(glucooligosaccharide)的内切葡聚糖酶，(2)作用于较小的寡糖末端而生成纤维二糖(双糖)的纤维二糖水解酶，和(3)将可溶性寡糖(DP2至DP7)转化为葡萄糖的(6-葡糖苷酶。已表明，单组分酶仅部分消化纤维素，完全转化为葡萄糖需要所有酶的协同作用。将半纤维素消化为糖单体需要更多的酶，包括木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。也可能涉及非糖基水解酶，如乙酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶。
[0014]发明概述
[0015]本发明提供具有纤维素分解活性例如纤维素酶活性如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、& -葡糖苷酶(beta-葡糖苷酶)、木聚糖酶、木糖苷酶(例如P -木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或寡聚体酶活性的多肽、编码它们的核酸以及制备和使用它们的方法。一方面，本发明酶具有提高的催化速率以促进底物(例如，纤维素)水解的过程。此催化速率的效率提高导致糖生成效率的提高，这可用于工业应用，例如，如此生成的糖可被微生物利用来生产乙醇。一方面，本发明提供高活性(例如，具有提高的催化速率)的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、(6-葡糖苷酶(beta-葡糖苷酶)、木聚糖酶、木糖苷酶(例如，(6-木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或寡聚体酶。本发明提供使用本发明酶的工业应用(例如，生物质至乙醇)，具有降低的酶成本，例如，降低的生物质至乙醇转化过程的成本。因此，本发明提供从任何生物质生产生物乙醇和包含生物乙醇的组合物(包括包含生物乙醇的燃料)的有效过程。
[0016]一方面，本发明酶，包括本发明酶“鸡尾酒”(“鸡尾酒”指包含至少一种本发明酶的酶混合物)，用于水解木素纤维素生物质或包含纤维素和/或半纤维素的任何组合物(木素纤维素生物质还包含木质素)的主要成分，所述生物质或组合物例如，种子、谷粒、块茎、食物加工或工业加工中的植物废弃物或 副产品(例如，茎)、玉米(包括玉米穗、玉米秸杆及类似物)、草(例如印度草，如Sorghastrum nutans ;或柳枝稷(switch grass),例如黍属如Panicum virgatum)、木材(包括木片、加工废弃物)、纸、纸衆、回收纸(例如报纸)。一方面，本发明酶用于水解包含P -1, 4-连接的葡萄糖部分的直链的纤维素和/或在不同植物中为各不相同的复杂结构的半纤维素。一方面，本发明酶用于水解包含(6-1, 4连接的木糖分子的主链与间隔的阿拉伯糖、半乳糖、葡糖醛酸和/或甘露糖支链的半纤维素。一方面，本发明酶用于水解包含非糖组分(如木糖的乙酰基和阿拉伯糖的阿魏酸酯)的半纤维素。一方面，本发明酶用于水解共价连接至木质素和/或通过二阿魏酸酯交联偶联至其它半纤维素链的半纤维素。
[0017]一方面，本发明组合物和方法用于生物质的酶消化，并可包括使用多种不同的酶，包括纤维素酶和半纤维素酶。用于实施本发明的纤维素酶可将纤维素消化为葡萄糖。一方面，用于实施本发明的组合物可包括酶的混合物，所述酶例如木聚糖酶、木糖苷酶(例如，3-木糖苷酶)、纤维二糖水解酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶或可将半纤维素消化为单体糖类的其它酶。
[0018]一方面，用于实施本发明的组合物包括“纤维素酶”，该酶是至少三种不同类型的酶的混合物:(1)断裂内部的(6-1, 4键而生成更短的葡糖寡糖的内切葡聚糖酶，(2)以“外切”方式作用，向前释放纤维二糖单元((6-1, 4葡萄糖-葡萄糖二糖)的纤维二糖水解酶，和(3)从短的纤维寡糖(例如纤维二糖)释放葡萄糖单体的(6-葡糖苷酶。[0019]一方面，本发明酶具有葡聚糖酶(例如，内切葡聚糖酶)活性,例如,催化内部的内切-(6-1, 4-和/或P-1，3-葡聚糖酶键的水解。一方面，所述内切葡聚糖酶活性(例如，内切-1，4-0_D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(glucano hydrolase)活性)包括水解纤维素、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)地衣淀粉中的1，4-和/或(6-1, 3-P-D-糖苷键、混合的0_1，3葡聚糖(如谷物P-D-葡聚糖或木葡聚糖)和包含纤维质部分的其它植物材料中的(6-1, 4键。
[0020]一方面，本发明酶具有内切葡聚糖酶(例如，内切-0-1，4-葡聚糖酶，EC3.2.1.4 ；内切-@-1,3(1)-葡聚糖酶，EC3.2.1.6 ;内切-(6-1, 3-葡聚糖酶，EC3.2.1.39)活性，并可水解纤维素和葡聚糖中的内部@-1，4-和/或(6-1, 3-糖苷键以生成更小分子量的葡萄糖和葡萄糖寡聚体。本发明提供使用本发明的这些酶生成更小分子量的葡萄糖和葡萄糖寡聚体的方法。
[0021]一方面，本发明酶用于产生葡聚糖，例如，从1，4-0 -和/或1，3-糖苷-连接的D-吡喃葡萄糖形成的多糖。一方面，本发明内切葡聚糖酶用于食物工业，例如，用于烘焙以及水果和蔬菜加工、分解农业废弃物、生产动物饲料、生产纸浆和纸、纺织品生产以及家用和工业清洗剂。一方面，本发明酶(例如，内切葡聚糖酶)由微生物(例如，真菌和/或细菌)产生。 [0022]一方面，本发明酶(例如，内切葡聚糖酶)用于水解beta-葡聚糖(P _葡聚糖)，该糖是谷物的主要非淀粉多糖。多糖的葡聚糖含量可因品种和生长条件而有显著差异。此多糖的物理化学性质使其在氧化条件下形成粘性溶液或甚至凝胶。此外，葡聚糖具有高度的水结合能力。所有这些特性给几种工业(包括酿造、烘焙、动物营养)带来了问题。在酿造应用中，葡聚糖的存在造成麦芽汁过滤性和池雾形成(haze formation)问题。在烘焙应用(特别是糕点(cookie)和脆点心(cracker))中，葡聚糖会造成难以机器加工和减小饼干(biscuit)大小的粘性生面团。因此,本发明酶(例如，内切葡聚糖酶)用于减少包含(6-葡聚糖的组合物中(6-葡聚糖的量，例如，本发明酶用于降低溶液或凝胶的粘性的过程；降低组合物(例如，包含(6-葡聚糖的组合物)的水结合能力；用于酿造过程(例如，增加麦芽汁过滤性和减少浊雾形成)，降低生面团(例如，用于制作糕点、面包、饼干及类似产品的生面团)的粘性。
[0023]此外，糖类(例如，(6-葡聚糖)参与烘焙产品的快速再水化，造成脆性损失和保存期限缩短。因此，本发明酶(例如，内切葡聚糖酶)用于保留脆性、增加脆性或降低脆性损失率，以及增加任何含糖的食物、饲料或饮料(例如，含3 -葡聚糖的食物、饲料或饮料)的保存期限。
[0024]本发明酶(例如，内切葡聚糖酶)用于降低肠内容物(例如，在动物如反刍动物或人中，例如谷物膳食的动物)的粘性。因此，在可选择的方面，本发明酶(例如，内切葡聚糖酶)用于有利地影响食物或饲料的消化性和动物(例如，人或家畜)的生长速率，并在一个方面中用于提高饲料转化效率。对于谷物膳食的单胃动物的饲料应用，^ -葡聚糖是促进肠内容物粘性的因素，进而不利地影响饲料的消化性和动物生长速率。对于反刍动物，这些P -葡聚糖代表主要的纤维摄入组分，更加完全的葡聚糖消化将有利于提高饲料的转化效率。因此，本发明提供包含本发明内切葡聚糖酶的动物饲料和食物，并且一方面，这些酶在动物消化道中(例如，在胃和/或肠中)具有活性。[0025]本发明酶(例如，内切葡聚糖酶)用于消化纤维素或任何包含(6-1, 4-连接的葡聚糖的合成的或天然的物质(包括那些发现于任何植物材料中的物质)。本发明酶(例如，内切葡聚糖酶)用作商业用酶来消化任何来源的纤维素，所述来源包括所有生物来源，如植物生物质(例如，玉米、谷粒、草(例如，印度草如Sorghastrum nutans ;或柳枝稷(switchgrass),例如黍属如Panicum virgatum))或木材或木材加工副产品；例如，在木材加工、纸浆和/或纸工业中，在纺织品生产以及在家用和工业清洗剂中和/或在生物质废弃物加工中。
[0026]一方面，本发明提供包含本发明酶、多肽或多核苷酸的组合物(例如，药物组合物、食物、饲料、药物、膳食补剂)。这些组合物可配制成多种形式，例如，作为片剂、凝胶、丸剂、植入物、液体、喷雾剂、粉剂、食物、颗粒饲料(feed pellets)或作为任何类型的包胶形式(encapsulated form)。
[0027]本发明提供包含与本发明示例性核酸在至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、I100、I150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500 个或更多个残基的区域内具有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全的(100%)序列同一性的核酸序列的分离的、合成的或重组的核酸，所述示例性核酸包括 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:1USEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 19,SEQ ID N0:2USEQID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID N0:3USEQ ID NO:33,SEQID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:45,SEQID NO:47,SEQ ID NO:49 ,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:53,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:57,SEQID NO:59,SEQ ID N0:6USEQ ID NO:63,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:69,SEQID N0:7USEQ ID NO:73,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:79,SEQ ID N0:8USEQID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID N0:9USEQ ID NO:93,SEQID NO:95,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:117,SEQ ID NO:119,SEQ ID N0:121、SEQ ID NO:123,SEQ ID NO:125,SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ IDNO:139,SEQ ID NO:141,SEQ ID NO:143,SEQ ID NO:145,SEQ ID NO:147,SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ IDN0:161、SEQ ID NO:163,SEQ ID NO:165,SEQ ID NO:167,SEQ ID NO:169,SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ IDNO:183,SEQ ID NO:185,SEQ ID NO:187,SEQ ID NO:189,SEQ ID N0:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ IDNO:205,SEQ ID NO:207,SEQ ID NO:209,SEQ ID N0:211、SEQ ID N0:213、SEQ ID N0:215、SEQ ID 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NO:361,SEQ ID NO:363,SEQ ID NO:365,SEQ ID NO:367,SEQ ID NO:369,SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:379、SEQ IDNO:381、SEQ ID NO:383,SEQ ID NO:385,SEQ ID NO:387,SEQ ID NO:389,SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:395、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:401、SEQ IDNO:403,SEQ ID NO:405,SEQ ID NO:407,SEQ ID NO:409,SEQ ID N0:411、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:417、SEQ ID N0:419、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:423, SEQ IDNO:425,SEQ ID NO:427,SEQ ID NO:429,SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:433,SEQ ID NO:435,SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:439, SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:443, SEQ ID NO:445, SEQ IDNO:447,SEQ ID NO:449,SEQ ID NO:451、SEQ ID NO:453,SEQ ID NO:455,SEQ ID NO:457,SEQ ID NO:459、SEQ ID NO:461、SEQ ID NO:463、SEQ ID NO:465、SEQ ID NO:467、SEQ IDNO:469,SEQ ID NO:471、SEQ ID NO:473,SEQ ID NO:475,SEQ ID NO:477,SEQ ID NO:479,SEQ ID NO:481、SEQ ID NO:483、SEQ ID NO:485、SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:489、SEQ IDN0:491、SEQ ID NO:493,SEQ ID NO:495,SEQ ID NO:497,SEQ ID NO:499,SEQ ID N0:501、SEQ ID NO:503、SEQ ID NO:505、SEQ ID NO:507、SEQ ID NO:509、SEQ ID NO:511、SEQ IDNO:513、SEQ ID NO:515、SEQ ID NO:517、SEQ ID NO:519、SEQ ID NO:521 和 / 或 SEQ IDNO:523 (另请参见下文的表1、2和3，实施例1和4，以及序列表);在可选择的方面，这些核酸编码至少一个具有纤维素分解活性的多肽，所述纤维素分解活性例如纤维素酶活性，例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、(6-葡糖苷酶(beta-葡糖苷酶)、木聚糖酶、木糖苷酶(例如，(6-木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或寡聚体酶活性。寡聚体酶可以例如将可溶性纤维寡糖和阿拉伯木聚糖寡聚体水解(降解)为单体木糖、阿拉伯糖和葡萄糖，或编码能够产生可与本发明多肽特异性结合的抗体的多肽，或者，这些核酸可用作鉴定或分离编码纤维素酶的核酸的探针，或用于抑制表达纤维素酶的核酸的表达(所有这些方面均称为“本发明的核酸”)。一方面，所述序列同一性通过使用序列比较算法的分析或通过视觉检测(visual inspection)石角定。 [0028] 本发明核酸还包括编码本发明示例性酶的分离的、合成的或重组的核酸，所述示例性酶包括具有下述序列号的序列(以下述序列号提出的序列)的多肽:SEQ ID NO: 2,SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:100,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ IDNO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ IDNO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:209、SEQ IDN0:210、SEQ ID NO:212,SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216,SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220,SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ IDNO:232、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:252、SEQ IDNO:254、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:26 6、SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:274、SEQ IDNO:276、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:280、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:296、SEQ IDNO:298、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:318、SEQ IDNO:320、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:324、SEQ ID NO:326、SEQ ID NO:328、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:334、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:340、SEQ IDNO:342、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:346、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:352、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:362、SEQ IDNO:364、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:368、SEQ ID NO:370、SEQ ID NO:372、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:384、SEQ IDNO:386、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:406、SEQ IDNO:408,SEQ ID N0:410、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:414,SEQ ID N0:416、SEQ ID N0:418、SEQ ID NO:420,SEQ ID NO:422, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:428, SEQ IDNO:430、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:436、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:440、SEQ ID NO:442,SEQ ID NO:444, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:450,SEQ IDNO:452、SEQ ID NO:454、SEQ ID NO:456、SEQ ID NO:458、SEQ ID NO:460、SEQ ID NO:462、SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:466, SEQ ID NO:468, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:472, SEQ IDNO:474、SEQ ID NO:476、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:480、SEQ ID NO:482、SEQ ID NO:484、SEQ ID NO:486, SEQ ID NO:488, SEQ ID NO:490,SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:494,SEQ IDNO:496、SEQ ID NO:498、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:502、SEQ ID NO:504、SEQ ID NO:506、SEQ ID NO:508、SEQ ID NO:510、SEQ ID NO:512、SEQ ID NO:514、SEQ ID NO:516、SEQ IDNO:518、SEQ ID NO:520,SEQ ID NO:522 和 / 或 SEQ ID NO:524 (另请参见下文的表 1、2 和3，实施例1和4，以及序列表)，以及其子序列和其变体。一方面，所述多肽具有纤维素分解活性，例如纤维素酶活性，例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、P -葡糖苷酶(beta-葡糖苷酶)、木聚糖酶、木糖苷酶(例如，(6-木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶，和/或寡聚体酶。寡聚体酶可以例如可将可溶性纤维寡糖和阿拉伯木聚糖寡聚体水解(降解)为单体木糖、阿拉伯糖和葡萄糖。
[0029] 一方面，本发明提供编码纤维素分解酶的核酸，例如编码内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、(6-葡糖苷酶(beta-葡糖苷酶)、木聚糖酶、木糖苷酶(例如，@-木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或寡聚体酶的核酸，这些核酸具有共同的新颖性，因为它们衍生自混合的培养物。本发明提供从混合的培养物中分离的编码纤维素或寡糖水解(降解)酶的核酸，所述核酸包含本发明多核苷酸，例如，与本发明示例性核酸在至少约50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150 或更多的区域内具 有至少约 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全的(100%)序列同一性的序列，所述示例性核酸例如 SEQ ID N0:USEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ IDNO:1USEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 19,SEQ ID N0:2USEQ IDNO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID N0:3USEQ ID NO:33,SEQ IDNO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:45,SEQ IDNO:47,SEQ ID NO:49,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:53,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:57,SEQ IDNO:59,SEQ ID N0:6USEQ ID NO:63,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:69,SEQ IDN0:7USEQ ID NO:73,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:79,SEQ ID N0:8USEQ IDN0:83、SEQ ID N0:85、SEQ ID N0:87、SEQ ID N0:89、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:93、SEQID NO:95,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:117,SEQ ID NO:119,SEQ ID N0:121、SEQ ID NO:123,SEQ ID NO:125,SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ IDNO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ IDN0:161、SEQ ID NO:163,SEQ ID NO:165,SEQ ID NO:167,SEQ ID NO:169,SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ IDNO:183,SEQ ID NO:185,SEQ ID NO:187,SEQ ID NO:189,SEQ ID N0:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ IDNO:205,SEQ ID NO:207,SEQ ID NO:209,SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ IDNO:227,SEQ ID NO:229,SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:233,SEQ ID NO:235,SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:247、SEQ IDNO:249,SEQ ID NO:251,SEQ ID NO:253,SEQ ID NO:255,SEQ ID NO:257,SEQ ID NO:259,SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:265、SEQ ID NO:267、SEQ ID NO:269、SEQ IDNO:271、SEQ ID NO:273,SEQ ID NO:275,SEQ ID NO:277,SEQ ID NO:279,SEQ ID NO:281、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:291、SEQ IDNO:293,SEQ ID NO:295,SEQ ID NO:297,SEQ ID NO:299,SEQ ID N0:301、SEQ ID NO:303,SEQ ID NO:305、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:309、SEQ ID NO:311、SEQ ID NO:313、SEQ IDNO:315、SEQ ID NO:317,SEQ ID NO:319、SEQ ID NO:321,SEQ ID NO:323,SEQ ID NO:325、SEQ ID NO:327、SEQ ID NO:329、SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:335、SEQ IDNO:337,SEQ ID NO:339,SEQ ID NO:341,SEQ ID NO:343,SEQ ID NO:345,SEQ ID NO:347,SEQ ID NO:349、SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:357、SEQ IDNO:359,SEQ ID NO:361,SEQ ID NO:363,SEQ ID NO:365,SEQ ID NO:367,SEQ ID NO:369,SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:379、SEQ IDNO:381、SEQ ID NO:383,SEQ ID NO:385,SEQ ID NO:387,SEQ ID NO:389,SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:395、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:401、SEQ IDNO:403,SEQ ID NO:405,SEQ ID NO:407,SEQ ID NO:409,SEQ ID N0:411、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:417、SEQ ID N0:419、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:423, SEQ IDNO:425,SEQ ID NO:427,SEQ ID NO:429,SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:433,SEQ ID NO:435,SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:439, SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:443, SEQ ID NO:445, SEQ IDNO:447,SEQ ID NO:449,SEQ ID NO:451、SEQ ID NO:453,SEQ ID NO:455,SEQ ID NO:457,SEQ ID NO:459、SEQ ID NO:461、SEQ ID NO:463、SEQ ID NO:465、SEQ ID NO:467、SEQ IDNO:469,SEQ ID NO:471、SEQ ID NO:473,SEQ ID NO:475,SEQ ID NO:477,SEQ ID NO:479,SEQ ID NO:481、SEQ ID NO:483、SEQ ID NO:485、SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:489、SEQ IDN0:491、SEQ ID NO:493,SEQ ID NO:495,SEQ ID NO:497,SEQ ID NO:499,SEQ ID N0:501、SEQ ID NO:503、SEQ ID NO:505、SEQ ID NO:507、SEQ ID NO:509、SEQ ID NO:511、SEQ IDNO:513、SEQ ID NO:515、SEQ ID NO:517、SEQ ID NO:519、SEQ ID NO:521 和 / 或 SEQ IDNO:523 (参见下文的表1、2和3，实施例1和4，以及序列表)。[0030] 一方面，本发明提供编码纤维素分解酶的核酸，例如编码内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β -葡糖苷酶(beta-葡糖苷酶)、木聚糖酶、木糖苷酶(例如，β -木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或寡聚体酶的核酸，其包括本发明的示例性多核苷酸序列(另请参见下文的表1、2和3，实施例1和4，以及序列表)，并提供了由这些核酸编码的多肽，包括本发明的酶，例如本发明示例性多肽，例如SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID
【权利要求】
1.一种分离的、合成的或重组的核酸，其包括: (a)SEQ ID NO: 519的核酸序列，其中所述核酸编码具有寡聚体酶活性的多肽；或 (b)编码序列为SEQID NO:520的多肽的核酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述寡聚体酶活性包括将可溶性寡聚体水解为可发酵的单体糖。
3.如权利要求1所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述寡聚体酶活性包括将可溶性纤维寡糖和阿拉伯木聚糖寡聚体水解为单体，并且所述单体包括木糖、阿拉伯糖和葡萄糖。
4.一种表达盒，其包含:包含权利要求1所述的序列的核酸。
5.一种载体,其包含:包含权利要求1所述的序列的核酸。
6.一种克隆载体,其包含:包含权利要求1所述的序列的核酸。
7.一种转化的细胞，其包含:包含权利要求1所述的序列的核酸、或权利要求4所述的表达盒、权利要求5所述的载体或权利要求6所述的克隆载体。
8.权利要求1所述的序列在制备转基因植物中的应用。
9.权利要求1所述的序列在制备转基因种子中的应用。
10.一种分离的、合成 的或重组的多肽
(i)具有与SEQ ID N0:520 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高或100%序列同一性的氨基酸序列； (ii)具有由权利要求1所述的核酸编码的氨基酸序列，其中所述多肽具有寡聚体酶活性。
11.如权利要求10所述的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述寡聚体酶活性包括将可溶性寡聚体水解为可发酵的单体糖。
12.如权利要求10所述的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述寡聚体酶活性包括将可溶性纤维寡糖和阿拉伯木聚糖寡聚体水解为单体，并且所述单体包括木糖、阿拉伯糖和葡萄糖。
13.一种制备转基因植物的方法，该方法包括如下步骤: (a)将异源核酸序列引入细胞，其中所述异源核酸序列包含权利要求1所述的序列，从而生成转化的植物细胞； (b)从所述转化的细胞生产转基因植物。
14.一种在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，该方法包括如下步骤: (a)使用可操作地连接至启动子的异源核酸序列转化所述植物细胞，其中所述异源核序列包含权利要求1所述的序列； (b)在其中所述异源核酸序列在所述植物细胞中表达的条件下培养所述植物。
15.一种燃料，其包含权利要求10所述的多肽、或由权利要求1所述的核酸编码的多肽。
16.一种用于制备燃料的方法，该方法包括使包含纤维素或可发酵的糖类的组合物与权利要求10所述的多肽、或由权利要求1所述的核酸编码的多肽接触。
17.一种用于制备生物乙醇的方法，该方法包括使包含纤维素或可发酵的糖类的组合物与权利要求10所述的多肽、或由权利要求1所述的核酸编码的多肽接触。
18.如权利要求7所述的转化的细胞，其中所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
19.如权利要求8所述的应用，所述植物为玉米植物、高粱植物、马铃薯植物、番茄植物、小麦植物、含油种子植物、油菜植物、大豆植物、水稻植物、大麦植物、草或烟草植物。
20.如权利要求9所述的应用，其中所述种子是玉米种子、小麦仁、含油种子、油菜籽、大豆种子、棕榈仁、葵花籽、芝麻种子、大米、大麦、花生或烟草植物种子。
21.如权利要求14所述的燃料，其中所述寡聚体酶为寡聚体酶-1(0-葡糖苷酶)或寡聚体酶-2(3-木糖苷酶)。
22.如权利要求14所述的燃料，其中所述燃料衍生自植物材料。
23.如权利要求14所述的燃料，其中所述植物材料包括马铃薯、大豆(油菜籽)、大麦、黑麦、玉米、燕麦、小麦、甜菜或甘蔗。
24.如权利要求14所述的燃料，其中所述燃料包括生物乙醇或汽油-乙醇混合物。
25.如权利要求15所述的方法，其中所述包含纤维素或可发酵的糖类的组合物包括植物、植物产品或植物衍生物。
26.如权利要求15所述的方法，其中所述植物或植物产品包括蔗糖植物或植物产品、甜菜或糖甜菜、小麦、玉米、大豆、马铃薯、水稻或大麦。
27.如权利要求16所述的方法，其中所述寡聚体酶为寡聚体酶-1(0-葡糖苷酶)或寡聚体酶-2(3-木糖苷酶)。
28.如权利要求16所述的方法，其中所述燃料包括生物乙醇或汽油-乙醇混合物。
29.如权利要求17所述的方法，其中所述包含纤维素或可发酵的糖类的组合物包括植物、植物产品或植物衍生物。
30.如权利要求17所述的方法，其中所述植物或植物产品包括蔗糖植物或植物产品、甜菜或糖甜菜、小麦、玉米、大豆、马铃薯、水稻或大麦。
31.如权利要求17所述的方法，其中所述寡聚体酶为寡聚体酶-1(0-葡糖苷酶)或寡聚体酶-2(3-木糖苷酶)。
【文档编号】C12N15/63GK103602692SQ201310373583
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2006年12月8日 优先权日:2006年2月10日
【发明者】凯文·A·格雷, 莉姗·赵, 米歇尔·卡约特 申请人:维莱尼姆公司