一种应用ssr分子标记技术鉴定商品卷烟的方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用SSR分子标记技术鉴定商品卷烟的方法，属于分子生物学领域。本发明运用SSR技术对单品种烟草进行遗传图谱分析，从中筛选出变异率适中、具有品种特异性的SSR位点。提取商品卷烟烟丝的总DNA，用筛选出的特异性引物进行扩增，将获得的遗传变异式样与单品种的式样进行对比，根据品种特异性位点的有无可分辨出商品卷烟烟丝中所含烟叶品种，对照相应的卷烟配方中烟叶品种的使用情况，便能鉴定卷烟的真伪。同时该方法也适用于单品种烟叶、叶组丝及混合品种烟丝样品的鉴定。
【专利说明】—种应用SSR分子标记技术鉴定商品卷烟的方法
【技术领域】:
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，具体地说，本发明涉及应用一种分子生物学技术方法进行商品卷烟的鉴定。同时，本发明还涉及所述方法对单品种烟叶和混合烟丝样品的鉴定。
【背景技术】:
[0002]烟草作为人类最重要的经济作物之一，其遗传学特征一直都是研究的热点，目前，烟草的基因组全序列图谱已完成，这使人们能够从基因组的层面上更深入地对烟草进行研究。其中，关于烟草品种的遗传多样性研究不在少数，但从叶组配方和商品烟的角度研究还未见报道。原料品质的稳定和杜绝假冒伪劣产品是卷烟品牌生命力的重要保障。分子生物学技术在目前来说是最精确的品种鉴定手段，将其应用到商品卷烟真伪和原料品种的鉴定中，可更精确地了解原料组成，达到防伪的目的。
[0003]DNA简单重复序列(SSR)也称为微卫星DNA，是真核生物基因组中广泛分布的短串联DNA序列，由串联重复的核心序列和两侧较保守的侧翼序列构成。通常每个重复单位仅I-8个碱基，重复数为10-20次。在特定位点上按孟得尔方式分离的微卫星DNA提供了变异丰富、选择中性、共显性的分子标记，可用于植物种间、种内居群间以及个体间的多态性分析，在遗传作图、群体遗传研究、个体间亲缘关系以及品种鉴定等方面得到了广泛应用。成品烟丝由于生产和加工过程中DNA降解较为严重，通常可提取的DNA长度较短，因此限制了对于DNA质量要求较高的遗传标记技术(如AFLP等)的应用。而SSR标记目标DNA片段长度通常在100-400bp，因此，SSR技术为DNA质`量较差的植物产品的分子鉴定提供了可能。对不同烟草品种进行遗传图谱分析，建立烟草品种DNA指纹，筛选品种特异性SSR多态性变异式样，通过比对成品烟丝SSR多态性特征，可能对成品烟原料品种及其来源进行鉴定。并且，SSR技术识别灵敏度高，可鉴别出混合样品中含量较少的目标样品。以往商品卷烟真伪判定依据产品商标、包装和抽吸感官，而采用分子生物学的方法根据卷烟原料品种进行鉴定目前还未有报道。
【发明内容】
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[0004]本发明根据烟草全基因组序列设计烟草SSR引物，用所设计的引物对单品种的烟草DNA进行扩增，筛选有品种特异性的位点。提取需要检测的商品卷烟烟丝或混合品种烟丝的总DNA，用筛选出的具有品种特异性的引物对其进行扩增，根据扩增所得的片段判断样品中品种的组成，从而鉴定商品卷烟或混合烟丝的真伪。此方法可直观从电泳图谱上进行烟草品种的鉴定，鉴别结果准确可靠，灵敏度高，具有较好的应用前景，丰富了卷烟鉴定的手段。
[0005]基于上述认识，本发明的目的在于提供一种直观、准确的鉴定商品卷烟或混合烟丝样品的方法。
[0006]本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的:[0007]—种应用SSR分子标记技术鉴定商品卷烟的方法，将SSR分子标记技术应用于商品卷烟的鉴定中，通过识别单品种或混合品种的特征条带，掌握所鉴定样品的原料品种组成，达到辨别真伪的目的，方法如下:
[0008](I)从烟草基因组序列中随机选择具有SSR序列的区间设计引物，目标片段长度在 110 — 250bp ；
[0009](2)提取单品种烟草DNA ；
[0010](3)品种特异性引物的筛选，将所设计的全部SSR引物在所收集的烟草单品种样品中进行扩增，筛选多态性仅存在于品种间的具有品种特异性的SSR标记；
[0011](4)鉴定，提取需要鉴定样品的总DNA，用筛选出的品种特异性引物进行扩增，根据电泳图谱显示的品种特异性条带，判断样品中品种组成，通过与正品配方进行对比，鉴定卷烟真伪。
[0012]所述的方法适用的鉴定范围为单品种烟叶、叶组丝及混合品种烟丝。
[0013]品种特异性引物的设计和筛选采用:
[0014](I) SSR多态性引物设计
[0015]从烟草基因组序列中随机选择具有SSR序列的区间设计引物。从GENBANK数据库中下载烟草全基因组序列，通过SSR Hunter软件搜索包含SSR位点的序列，通过01igo6.0在其两侧设计引物，目标片段长度在110 - 250bp。
[0016](2)单品种烟草DNA提取
[0017]取新鲜或干燥不同年份、产地红花大金元、NC102、K326等单品种烟草叶片，分别将其组织研磨成细粉末，放入2mL离心管中，加入0.4-lmL65°C预热的CTAB提取缓冲液和I-2 μ L0.2% V/V的巯基乙醇，震荡混匀；65°C水浴40min，每隔8min混匀一次，水浴结束后每管样品加入等体积的24:1氯仿/异戊醇混合液，混匀，12000r/min离心IOmin后，将上清液转入新的2mL离心管中，重复此步骤一次；离心管中加入70%体积已在4°C冰箱中放置预冷的异丙醇，混匀液体，放置_20°C冰箱Ih ;再用12000r/min离心lOmin，弃上清，沉淀用20-40mL70%乙醇和无水乙醇各洗两次，倒出管中乙醇后，将管子敞口放置40°C恒温箱中干燥；待管子完全干燥后，置于_20°C冰箱中储存。
[0018](3)品种特异性引物筛选
[0019]全部SSR引物在所收集的烟草单品种样品中进行PCR扩增，筛选多态性仅存在于品种间的具有品种特异性的SSR标记，引物筛选中PCR产物均用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色。用品种特异性的标记引物扩增全部样品，PCR产物通过QIAxcel进行毛细管电泳，读取片段长度。保留所筛选出的具有品种特异性的引物。
[0020]PCR反应在PTC-200PCR仪上按以下程序进行:93 °C预热3min，40-44个循环(930C 30s，52-56°C 30s，72°C 15s)，72°C 7min。由于成品烟丝中DNA质量较差，反应中退火温度比引物理论退火温度相应降低5-10°C。反应体系25 μ L(包括IOXPCR缓冲液2.5 μ L，dNTP (2.5 μ mo I each) 0.5 μ L，引物各 0.5 μ L (5 μ mol/L)和 Taq DNA0.3 μ L (TaKaRa))。
[0021]以红花大金元、NC102和Κ326为例，筛选出的具红花大金元品种特异性引物ΝΤ5在红花大金元品种中扩增片段长度为209bp，在NC102和K326品种中扩增片段长度为213bp ；筛选出的具NC102品种特异性引物NTlO在NC102品种中扩增片段长度为156bp，在红花大金元和K326品种中扩增片段长度为159bp ;筛选出的具K326品种特异性的引物NTl在K326品种中扩增片段长度为149bp，在红花大金元和NC102品种中扩增长度为152。
[0022]混合品种烟丝和商品卷烟的鉴定按下述方法进行:
[0023]按前述步骤提取需要鉴定的样品总DNA，应用筛选出的品种特异性引物对其进行PCR扩增，并与相应引物扩增的单品种烟草样品PCR产物同时电泳，对比电泳图谱，便可知样品中所含烟草品种，对比商品卷烟的配方，样品中所含品种是否与配方一致，若不一致便能判断其是伪品。
[0024]于云烟(紫)和云烟(软珍品)两个牌号和混合品种的叶组丝中验证该方法，结果表明该方法对商品卷烟和混合品种烟丝中所含烟草品种判断准确，可以应用于商品卷烟真伪的鉴定。
[0025]本发明针对商品卷烟的特点，选用SSR分子标记技术进行对其进行鉴定。与现有技术相比，本发明具有如下优势:
[0026](1)针对卷烟配方中烟草品种进行鉴定，可在多个品种混合的样品中找到目标品种的条带，鉴定结果准确、可靠。可用于商品卷烟、混合烟丝、烟草品种的鉴定，有较好的应用价值。以往商品卷烟真伪判定依据产品商标、包装和抽吸感官，而采用分子生物学的方法根据卷烟原料品种进行鉴定，结果准确可靠，丰富了卷烟鉴定的手段。
[0027](2)根据文献报道，我国烟草各类型间遗传一致性较高，遗传多样性低，因此要选择在烟草品种间分辨率较高的分子生物学手段进行鉴定。经过文献查阅和前期研究，SSR分子标记在烟草品种间有较好的分辨率，能准确定位目标品种，适合用于烟草品种的区分。
[0028](3)商品卷烟和烘烤、陈化过的烟丝经过多道工序加工及较长时间的存放，其中所含DNA往往降解严重。经对比，新鲜叶片经硅胶干燥后提取的DNA长度约20kb，而商品卷烟烟丝中提取的总DNA长度在600-800bp，说明商品卷烟烟丝中DNA存在严重降解。因此，商品卷烟的鉴定不适宜采用对DNA质量要求较高的遗传标记技术。而SSR分子标记技术分析的目标DNA片段长度通常在在100-400bp，相对其他技术来说受DNA降解的影响较小，因此，此方法适用性较广。
[0029](4)卷烟配方中往往含有多个品种的烟丝，有的品种的烟丝在配方中所占的比例较小，实验表明，本发明中所采用的分析方法可识别混合品种样品中含量很低的组分，具有较高的灵敏度，因此此方法在商品卷烟的鉴定中有较高的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】:
[0030]图1为不同品种烟叶与云烟(紫)烟丝SSR分析毛细管电泳图，[D01-09分别为NTl, NT5, NTlO三对引物在NC102，K326和红花大金元三个品种中变异式样的毛细管电泳图；D10-12依次为NTl在云烟(印象)，云烟(软珍品)和云烟(紫)中的式样];
[0031]图 2 为 NT5 在 NKl，NK2, NK3, HKl，HK2, HK3, HNl，HN2, HN3, CYl，CY2, CY3 (从左至右)中式样的毛细管电泳图；
[0032]图 3 为 NTlO 在 NKl，NK2, NK3, HKl，HK2, HK3, HNl，HN2, HN3, CYl，CY2, CY3 (从左
至右)中式样的毛细管电泳图。
【具体实施方式】:
[0033]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，通过实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
[0034]实施例1:
[0035](I)SSR多态性引物设计
[0036]从烟草基因组序列中随机选择具有SSR序列的区间设计引物。从GENBANK数据库中下载烟草全基因组序列，通过SSR Hunter软件搜索包含SSR位点的序列，通过01igo6.0在其两侧设计引物，目标片段长度在110 - 250bp。
[0037](2)单品种烟草DNA提取
[0038]取新鲜或干燥不同年份、产地的红花大金元、NC102、K326等单品种烟草叶片，分别将其组织研磨成细粉末，放入2mL离心管中，加入0.4-lmL65°C预热的CTAB提取缓冲液和I-2 μ L0.2% V/V的巯基乙醇，震荡混匀；65°C水浴40min，每隔8min混匀一次，水浴结束后每管样品加入等体积的24:1氯仿/异戊醇混合液，混匀，12000r/min离心IOmin后，将上清液转入新的2mL离心管中，重复此步骤一次；离心管中加入70%体积已在4°C冰箱中放置预冷的异丙醇，混匀液体，放置_20°C冰箱Ih ;再用12000r/min离心lOmin，弃上清，沉淀用20-40mL70%乙醇和无水乙醇各洗两次，倒出管中乙醇后，将管子敞口放置40°C恒温箱中干燥；待管子完全干燥后，置于_20°C冰箱中储存。
[0039](3)品种特异性引物筛选
[0040]全部SSR引物在所收集的烟草单品种样品中进行PCR扩增，筛选多态性仅存在于品种间的具有品种特异性的SSR标记，引物筛选中PCR产物均用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色。用品种特异性的标记引物扩增全部样品，PCR产物通过QIAxcel进行毛细管电泳，读取片段长度。保留所筛选出的具`有品种特异性的引物。
[0041 ] PCR反应在PTC-200PCR仪上按以下程序进行:93 °C预热3min，40-44个循环(930C 30s，52-56°C 30s, 72°C 15s)，72°C 7min。由于成品烟丝中DNA质量较差，反应中退火温度比引物理论退火温度相应降低5-10°C。反应体系25 μ L(包括IOXPCR缓冲液2.5 μ L，dNTP (2.5 μ mo I each) 0.5 μ L，引物各 0.5 μ L (5 μ mol/L)和 Taq DNA0.3 μ L (TaKaRa))。
[0042]以红花大金元、NC102和Κ326为例，筛选出的具红花大金元品种特异性引物ΝΤ5在红花大金元品种中扩增片段长度为209bp，在NC102和K326品种中扩增片段长度为213bp ；筛选出的具NC102品种特异性引物NTlO在NC102品种中扩增片段长度为156bp，在红花大金元和K326品种中扩增片段长度为159bp ;筛选出的具K326品种特异性的引物NTl在K326品种中扩增片段长度为149bp，在红花大金元和NC102品种中扩增长度为152。
[0043](4)市售云烟(紫)的鉴定
[0044]卷烟专卖店中购买一包云烟(紫)进行真伪鉴定。
[0045]取出卷烟样品中的烟丝，按前述步骤提取总DNA，应用筛选出的品种特异性引物对其进行PCR扩增(步骤、反应条件同前)。与相应引物扩增的单品种烟草样品的PCR产物同时通过QIAxcel仪器进行毛细管电泳，电泳图谱如图1所示。
[0046]图1中，DOl-09分别为NT1，NT5, NTlO三对引物在NC102，K326和红花大金元三个品种中变异式样的毛细管电泳图；D10-12依次为NTl在云烟(印象)，云烟(软珍品)和云烟(紫)中的式样。
[0047]DO 1-D03为NTI在NC102，K326和红花大金元中的变异式样，假如样品中存在K326，图谱中将显示有K326的变异式样。D10-D12分别为NTl在云烟(印象)，云烟(软珍品)和中的式样，从图上可知云烟(紫)样品中没有显示K326的式样，从而可推断云烟(紫)样品中可能不含有K326，对照红云红河集团叶组配方表，可知2011年7月一 2012年I月生产的云烟(紫)配方中没有K326，所购买的云烟(紫)为2011年底生产，其配方中应不含有K326组分。证明所购买的卷烟为正品。
[0048]实施例2:
[0049](I) SSR多态性引物设计、单品种烟草DNA提取、品种特异性引物筛选步骤同实施例I。
[0050](2)混合样品中目标品种的鉴定
[0051]将三个品种的烟叶按不同比例两两混合，混合品种和比例如表I所示。
[0052]表I混合样品组成
【权利要求】
1.一种应用SSR分子标记技术鉴定商品卷烟的方法，其特征在于将SSR分子标记技术应用于商品卷烟的鉴定中，通过识别单品种或混合品种的特征条带，掌握所鉴定样品的原料品种组成，达到辨别真伪的目的，方法如下: (1)从烟草基因组序列中随机选择具有SSR序列的区间设计引物，目标片段长度在110 — 250bp ； (2)提取单品种烟草DNA; (3)品种特异性引物的筛选，将所设计的全部SSR引物在所收集的烟草单品种样品中进行扩增，筛选多态性仅存在于品种间的具有品种特异性的SSR标记； (4)鉴定，提取需要鉴定样品的总DNA，用筛选出的品种特异性引物进行扩增，根据电泳图谱显示的品种特异性条带，判断样品中品种组成，通过与正品配方进行对比，鉴定卷烟真伪。
2.如权利要求 1所述的方法，其特征在所鉴定的烟叶为单品种烟叶、叶组丝或商品卷烟中的烟丝。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的品种特异性SSR多态性引物设计是从烟草基因组序列中随机选择具有SSR序列的区间设计引物，从GENBANK数据库中下载烟草全基因组序列，通过SSR Hunter软件搜索包含SSR位点的序列，通过Ol igo6.0在其两侧设计引物，目标片段长度在110 - 250bp。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的单品种烟草为红花大金元、NC102、K326，或其他烟草品种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的品种特异性引物筛选是全部SSR引物在所收集的烟草单品种样品中进行PCR扩增，筛选多态性仅存在于品种间的具有品种特异性的SSR标记，引物筛选中PCR产物均用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色；用品种特异性的标记引物扩增全部样品，PCR产物通过QIAxcel进行毛细管电泳，读取片段长度；保留所筛选出的具有品种特异性的引物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的混合品种烟丝和商品卷烟的鉴定是按所述步骤提取需要鉴定的样品总DNA，应用筛选出的品种特异性引物对其进行PCR扩增，并与相应引物扩增的单品种烟草样品PCR产物同时电泳，对比电泳图谱，便可知样品中所含烟草品种，对比商品卷烟的配方，样品中所含品种是否与配方一致，若不一致便能判断其是伪品。
【文档编号】C12Q1/68GK103451296SQ201310403350
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】杨莹, 张天栋, 周博, 付磊, 王欣林, 赵英良, 汤丹瑜, 张玲, 雷声, 陈绍田 申请人:红云红河烟草(集团)有限责任公司