一种枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶突变体t305a及其应用的制作方法
【专利摘要】一种枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶突变体T305A，是利用现代分子酶工程技术对来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis）的左聚糖蔗糖酶氨基酸序列进行分子改造，通过易错PCR和活力筛选，获得突变体T305A，将其基因插入pSE380构建重组载体，导入大肠杆菌宿主表达。该突变体酶与野生型酶相比，在以蔗糖为底物转糖苷形成左聚糖反应中的底物浓度耐受性显著提高，达到最高转化率时的底物浓度由野生型酶的10%提高到突变体酶的25%，有利于提高批次产量和设备利用率，降低生产成本。
【专利说明】—种枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶突变体T305A及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体是一种枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶突变体T305A及其应用。
【背景技术】
[0002]左聚糖(Levan)是一类主要来源于微生物、通常以β-(2，6)糖苷键连接而成高分子量果聚糖。左聚糖已经被证实具有多种生物学活性，在抗肿瘤，抗病毒，增强身体免疫等方面都有一定的效果。左聚糖还具有增强免疫应激，改善肠道失衡的功能，是一种重要的食品添加剂，可以用于益生元、膳食纤维、低热食品、减肥产品、降脂产品生产，还可以作为乳化剂、保湿剂、凝胶剂等等使用。左聚糖在保湿性能上和目前化妆品行业需求大价格高昂的透明质酸具有同等效果，在化妆品行业的应用有极大潜力。目前国内的左聚糖市场主要由韩国进口产品垄断。
[0003]左聚糖鹿糖酶(levansucrase)又称为果糖基转移酶(fructosyltransferase,FTF, FTase, sucrose: 2, 6-D-fructan-6-D-fructosy I transferase, Lis, EC2.4.1.10),是一类可以将蔗糖水解成果糖和葡萄糖，并且可以通过转糖苷作用将蔗糖中的果糖基转移形成果聚糖的酶。
[0004]目前国内外已有一些利用微生物发酵方式产生左聚糖的研究，但还未成熟地实现产业应用。而利用左聚糖蔗糖酶转化蔗糖生产左聚糖的研究报道很少，将左聚糖蔗糖酶进行分子改造提高效能的研究也开展得很少。已经报道的左聚糖蔗糖酶普遍存在着反应最适温度低、热稳定性不佳、底物浓度耐受性低或底物转化率低等问题，相当多已经报道的左聚糖蔗糖酶其蔗糖底物浓度超过10%则引起转化率显著下降，制约了生产应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶突变体T305A及其应用，该突变体能够使以蔗糖为底物转糖苷形成左聚糖反应中的底物浓度耐受性显著提高，由原酶的10%提高到突变体酶的25%，有利于提高批次产量和设备利用率。
[0006]本发明采用的技术方案是:一种枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶突变体T305A，是利用现代酶工程技术将野生型基因上的第913个碱基由A替换为G，实现将野生型左聚糖蔗糖酶第305位氨基酸从原来的THR替换为ALA，改造得到一个新的左聚糖蔗糖酶突变体T305A。由于在工程菌构建中酶切和连接反应的需要，突变体T305A比野生型多一个氨基酸残基Val，位于起始密码子之后，因此在突变体T305A的氨基酸序列中，其第306位氨基酸对应于野生型左聚糖蔗糖酶第305位。
[0007]一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)左聚糖鹿糖酶(levansucrase)突变体基因t305a，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述的左聚糖蔗糖酶突变体基因t305a编码的蛋白质T305A，由474个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所不。[0009]所述的左聚糖蔗糖酶突变体基因t305a编码的蛋白质T305A在以蔗糖为底物转糖苷产生左聚糖(Levan)中的应用。
[0010]所述的左聚糖蔗糖酶突变体基因t305a编码的蛋白质T305A，在野生型酶第305位氨基酸残基相同位点突变所得突变体在以蔗糖为底物转糖苷产生左聚糖中的应用。
[0011] (I)左聚糖蔗糖酶突变体基因t305a的获得
[0012]所述的左聚糖蔗糖酶突变体基因t305a是根据Genbank已公布的NC_014479枯草芽孢杆菌str.W23的左聚糖蔗糖酶基因sacB全长序列设计两端引物，其中上游引物Fl含有Nco I酶切位点，下游引物Rl含有Pst I酶切位点和6个组氨酸(His)标签，
[0013]上游引物Fl 为:GATCCATGGTGAACATCAAAAAGTTTGC
[0014]下游引物Rl 为:GATCTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGTTTGTTAATTGTTAATT。
[0015]通过常规PCR扩增获得枯草芽孢杆菌sp.56A野生型左聚糖蔗糖酶基因片段，连接到pSE380载体构建出重组质粒PSE-SS56A，经测序验证该野生型左聚糖蔗糖酶氨基酸序列与已公布的NC_00964枯草芽孢杆菌Subsp.subtilis str.168的sacB基因编码的左聚糖蔗糖酶的氨基酸序列仅有第472位一个氨基酸残基不同；再以重组质粒PSE-SS56A为模板，采用相同引物通过易错PCR扩增产生突变基因，将易错PCR产物连接到pSE380载体转化到大肠杆菌，通过抗性平板筛选重组子和活性测定得到突变体酶。
[0016](2)重组质粒的构建与验证
[0017]用限制性内切酶EcoR I对提取的重组质粒进行单酶切验证，根据线性重组质粒的分子量初步判断是否构建成功，并进一步将重组质粒进行DNA测序分析，得出连入外源片段的核酸序列，确定正确的转化子。
[0018](3)基因工程菌株的构建:
[0019]采用CaCl2化学法将验证正确的重组质粒转化到E.coli XLlO-Gold感受态细胞，利用氨苄青霉素抗性平板初筛获得重组子，将重组子经液体培养，收集培养细胞经超声波破胞后，测定破胞的粗酶液酶活力进行复筛，选出活力有改变的工程菌。用IPTG诱导工程菌表达重组蛋白，通过镍亲和层析法纯化目的蛋白，检测纯化后的酶蛋白活力。
[0020]本发明的突出的实质性特点和技术效果在于:
[0021]利用现代微生物生物技术和分子酶工程技术，获得一个新的枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶突变体T305A，其在第305位氨基酸由野生型酶的THR突变为ALA。该突变体酶与野生型酶相比，在以蔗糖为底物转糖苷形成左聚糖反应中的底物浓度耐受性显著提高，达到最高转化率时的底物浓度由野生型酶的10%提高到突变体酶的25%，有利于提高批次产量和设备利用率，降低生产成本，更适合于工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为左聚糖蔗糖酶突变体基因PCR扩增电泳图。
[0023]图2为连接有左聚糖蔗糖酶突变体基因的PSE380重组质粒的单酶切验证电泳图。
[0024]图3为经镍亲和层析纯化后所得左聚糖蔗糖酶突变体T305A纯化产物的蛋白质SDS-PAGE电泳图。
[0025]图4为左聚糖蔗糖酶野生型酶在不同底物浓度下将蔗糖转化为左聚糖的相对产率和相对转化率的变化。[0026]图5为左聚糖蔗糖酶突变体T305A在不同底物浓度下将蔗糖转化为左聚糖的相对产率和相对转化率变化。
【具体实施方式】
[0027]本发明使用的枯草芽孢杆菌菌种可以从菌种保藏中心购买，也可以通过野外采集或者其他途径获得。微生物培养、基因克隆、表达技术和相关的技术方案是本领域中常用的成熟技术，涉及的专业术语也是本领域中常见的专业术语，实施例是说明性的，而不是限定性的，不能被解释为限定本发明的保护范围。
[0028]下面将通过实施例对本发明作详细描述:
[0029](I)左聚糖蔗糖酶突变体基因t305a的获得
[0030]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) sp.56A是本实验室从土壤中筛选所得,经过16S rRNA序列分析比对鉴定为枯草芽孢杆菌。通过提取枯草芽孢杆菌sp.56A的基因组DNA为模板，根据Genbank已公布的NC_014479枯草芽孢杆菌str.W23的左聚糖蔗糖酶基因sacB全长序列设计两端引物，其中上游引物Fl含有Nco I酶切位点，下游引物Rl含有Pst I酶切位点和6个组氨酸(His)标签，通过常规PCR扩增枯草芽孢杆菌sp.56A野生型左聚糖蔗糖酶基因，将PCR产物用Nco I和Pst I双酶切后连接到同样双酶切的PSE380载体，构建出携带有枯草芽孢杆菌sp.56A野生型左聚糖蔗糖酶基因的重组质粒pSE-SS56A，经测序验证该野生型左聚糖蔗糖酶氨基酸序列与已公布的NC_00964枯草芽孢杆菌Subsp.subtilis str.168的sacB基因编码的左聚糖蔗糖酶氨基酸序列仅有第472位一个氨基酸残基不同；再以重组质粒PSE-SS56A为模板，采用相同引物通过易错PCR扩增产生突变基因，将易错PCR产物连接到pSE380载体转化到大肠杆菌，通过抗性平板筛选重组子和活性测定得到突变体酶。
[0031 ]上游引物 Fl 为:GATCCATGGTGAACATCAAAAAGITTGC [0032]下游引物Rl 为:GATCTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGTTTGTTAATTGTTAATT
[0033]常规PCR 扩增反应体系为:5XPrimer STAR PCR buffer5.0 μ L，2.5mmol/L 的dNTPs2.0yL, 50mmol/L 的上下游引物各 1.0 μ L，DNA 模板 0.5 μ L, Primer STAR?0.5 μ L,加超纯水至反应总体积为25 μ L
[0034]常规PCR扩增条件为:95°C解链3min，94°C变性30sec ;42°C退火30sec ;72°C延伸3min ;共进行30个循环反应；然后于72°C继续延伸lOmin。
[0035]易错PCR 扩增反应体系为:10XPCR bufferl0.Ομ L，25mmol/L 的MnCl22.0 μ L, 25mmol/L 的 MgCl222.0 μ L, 100mmol/L 的 dATP0.2 μ L, 100mmol/L 的dGTP0.2 μ L, IOOmmoI/L 的 dCTPl.0yL, IOOmmoI/L 的 dTTPl.0yL, 50mmol/L 的上下游引物各2.0 μ L，DNA模板I μ L，Lc Taq3.0U,加超纯水至反应总体积为100 μ L。
[0036]易错PCR扩增条件为:95°C解链3min，94°C变性30sec ;42°C退火30sec ;72°C延伸3min ;共进行30个循环反应；然后于72°C继续延伸lOmin。
[0037]将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到扩增产物大小与目的基因片段大小基本吻合(图1)。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒(天泽公司产品)进行纯化，具体步骤参考试剂盒说明书。纯化的PCR产物用限制性内切酶Nco I和Pst I双酶切后连接到同样双酶切的PSE380载体，连接产物用CaCl2K学法转化到大肠杆菌E.coli XLlO-Gold感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性平板筛选挑取重组子。从挑取的重组子提取质粒，用EcoR I单酶切验证，所得重组质粒分子量与携带有目的片段的PSE380载体理论分子量基本吻合(图
2)，则可进一步进行DNA测序分析确定正确的转化子。
[0038]用CaCl2K学法将验证正确的重组质粒转化到E.coli XLlO-Gold感受态细胞，构建基因工程菌。将构建好的基因工程菌接种于含100 μ g/mL氨苄青霉素的5mL液体LB培养基，37°C培养10h。取2.0mL的液体种子接种到含100 μ g/mL氨苄青霉素的200mL液体LB培养基，37°C培养2-3h，当0D_达到0.6~1.0之时，加入终浓度为0.5~1.0mmoI/L的IPTG，于20°C、200r/min转速下进行诱导培养20h左右，收集细胞，采用超声波破胞制备粗酶液，经过镍亲和层析纯化，纯化重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，得到比较明显的单一条带(图3)，说明重组酶纯化效果较好，可用于酶活力测试。
[0039]本发明采用提取称重法测定左聚糖蔗糖酶以蔗糖为底物转糖苷产生左聚糖的聚合酶活力。
[0040]酶活测定的步骤为:取适量的左聚糖蔗糖酶纯化液，在适当PH缓冲体系中与蔗糖反应一定时间。反应结束后，在反应体系加入2-3倍无水乙醇，于4°C静置过夜使多糖充分沉淀，同时使单糖尽量溶解在溶液里。然后在4°C用13000g离心30分钟，弃去上清，所得左聚糖沉淀在60°C真空烘干至恒重，称出左聚糖产物的重量，即可计算聚合酶活力。
[0041]野生型酶在蔗糖底物浓度为10%时达到最高的产物转化率(图4)，之后随着底物浓度升高转化率明显逐步下降；而左聚糖蔗糖酶突变体酶T305A在蔗糖底物浓度为25%达到最高的产物转化率(图5)，之后才略有下滑。可见，仅仅在野生型酶第305位一个氨基酸残基的改变对左聚糖蔗糖酶的底物浓度耐受性有显著影响。
[0042]提高酶的底物浓度耐受性意味着可以在单个批次生产中投放更多的底物原料而不影响酶的产物转化效率，提`高设备利用率，缩短生产周期，降低生产成本，更适合工业化生产应用。
[0043]应该理解的是，对本领域技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，例如，所述的野生型左聚糖蔗糖酶除了来源于枯草芽孢杆菌之外，还可以来源于地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、类芽孢杆菌等菌株。所述的载体适于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、毕赤酵母等宿主中表达，也可通过电转化法、原生质体转化法等将本发明的左聚糖蔗糖酶突变体转入原核或者真核宿主中，以实现左聚糖蔗糖酶突变体的表达。或者通过酶工程技术对同一位点的氨基酸残基进行替换。而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)左聚糖鹿糖酶(levansucrase)突变体基因t305a，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根据权利要求1所述的左聚糖蔗糖酶突变体基因t305a编码的蛋白质T305A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.根据权利要求1所述的左聚糖蔗糖酶突变体基因t305a，其特征在于，该突变体基因是根据Genbank已公布的NC_014479枯草芽孢杆菌str.W23的左聚糖蔗糖酶基因sacB全长序列设计两端引物，其中上游引物Fl含有Nco I酶切位点，下游引物Rl含有Pst I酶切位点和6个组氨酸(His)标签， 上游引物 Fl 为:GATCCATGGTGAACATCAAAAAGITTGC 下游引物 Rl 为:GATCTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGITTGTTAATTGTTAATT。
4.根据权利要求2所述的左聚糖蔗糖酶突变体基因t305a编码的蛋白质T305A在以蔗糖为底物转糖苷产生左聚糖Levan中的应用。
5.根据权利要求2所述的左聚糖蔗糖酶突变体基因t305a编码的蛋白质T305A，在野生型酶第305位氨基酸残基相同 位点突变所得突变体在以蔗糖为底物转糖苷产生左聚糖中的应用。
【文档编号】C12P19/04GK103484482SQ201310403373
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】杨辉, 黄日波 申请人:广西大学