构建和培育耐盐草坪草的方法

构建和培育耐盐草坪草的方法
【专利摘要】本发明公开了一种构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）、构建农杆菌重组二元质粒：将拟南芥SOS1，SOS2，SOS3，CBL10完整的表达基因克隆，并将其植入大肠杆菌二元质粒，获得重组二元质粒；（二）、转化农杆菌和草坪草：将重组二元质粒导入农杆菌，并感染草坪草愈伤组织；（三）、选择和培育转基因草坪草。本发明的有益之处在于：转基因耐盐草坪草的构建和培育为改良盐碱地提供了一个新途径，它使盐碱地的改良工程提升到了高新科技的基因工程；这种方法的投入量很少，并且无性繁殖使它具有了不可估量的长远效益。
【专利说明】构建和培育耐盐草坪草的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种构建和培育耐盐草坪草的方法，属于生物转基因【技术领域】。
【背景技术】
[0002]目前，我国耕地有18亿亩，盐碱地面积占到5.4亿亩，我国西部地区地处干旱半干旱地区，由于干旱缺水，盐碱化、荒漠化现象严重。同时，由于近几年来气候原因，全球变暖和人类的活动，使得全国耕地面积变化总体呈现一种下降的趋势，这种现象也日趋严重，已经成为亟待解决的世界性问题。
[0003]现有改善盐碱地的主要方法是构建大量的排水网络，使地表盐分随着灌溉水或降雨流入低处，以及将脱硫渣掺入盐碱地，改善土壤PH值，促进植物生长。但是所有这些方法需要大量的前期投入。
[0004]草坪草作为重要的禾本科草本植物，具有很多优点，是现代化都市中不可缺少的生态环境组成部分。不仅具有保持水土、改造自然、美化环境、改善生态环境等功能，而且可以提供高质量的运动和休憩场地。长期种植还可以改良盐碱土壤，防止水土流失，增加土壤的肥沃度、保护生态环境。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于利用基因工程的方法构建并培育能耐较高盐分的草坪草的方法，从而改善和利用盐碱地。
[0006]为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案:
[0007]一种构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0008](一)、构建农杆菌重组二元质粒:将拟南芥S0S1，S0S2,S0S3, CBLlO完整的表达基因克隆，并将其植入大肠杆菌二元质粒，获得重组二元质粒；
[0009](二)、转化农杆菌和草坪草:将重组二元质粒导入农杆菌，并感染草坪草愈伤组织；
[0010](三)、选择和培育转基因草坪草。
[0011 ] 前述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，在步骤(一冲，选择KEGT-A作为重组二元质粒基本框架，在KEGT-A插入选择基因BAR基因。
[0012]前述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，重组二元质粒的结构为:
[0013]RB 基因-TM220 基因-SOSl 基因-S0S3 基因-S0S2 基因-TMl 基因-CBLlO 基因-TM2基因-BAR基因-TM220基因-LB基因。
[0014]前述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，在步骤(二)中，前述的草坪草愈伤组织由草坪草 种子在MS+5.5ml/L2, 4_D培养基中转化而来。
[0015]前述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，在步骤(三)中，前述的转基因草坪草在MS+2.0ml/L6-BA+l.0ml/L KT培养基中分化出幼芽。
[0016]前述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，在步骤(三)中，前述的转基因草坪草在1/2MS+0.3ml/L IBA培养基中分化出根，前述MS培养基的铁盐加倍。
[0017]本发明的有益之处在于:转基因耐盐草坪草的构建和培育为改良盐碱地提供了一个新途径，它使盐碱地的改良工程提升到了高新科技的基因工程；这种方法的投入量很少，并且无性繁殖使它具有了不可估量的长远效益。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1是本发明的构建和培育耐盐草坪草的方法的流程图；
[0019]图2是二元重组质粒的结构示意图；
[0020]图3是转基因苜蓿基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0021]图4是SOSl基因PCR扩增电泳图；
[0022]图5是S0S2基因PCR扩 增电泳图；
[0023]图6是S0S3基因PCR扩增电泳图；
[0024]图7是CBLlO基因PCR扩增电泳图；
[0025]图8是Southern杂交结果图；
[0026]图9是Northern杂交中SOSl基因的转录水平表达结果图；
[0027]图10是Northern杂交中S0S2基因的转录水平表达结果图；
[0028]图11是Northern杂交中S0S3基因的转录水平表达结果图；
[0029]图12是Northern杂交中CBL10基因的转录水平表达结果图。
【具体实施方式】
[0030]以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0031]参照图1，本发明的构建和培育耐盐草坪草的方法，包括以下步骤:
[0032](一)、构建农杆菌重组二元质粒:将拟南芥S0S1，S0S2,S0S3, CBL10完整的表达基因克隆，并将其植入大肠杆菌二元质粒，获得重组二元质粒；
[0033](二)、转化农杆菌和草坪草:将重组二元质粒导入农杆菌，并感染草坪草愈伤组织；
[0034](三)、选择和培育转基因草坪草。
[0035]下面以高羊茅为例进行说明，其他草坪草的操作一样。
[0036]首先，用PCR将拟南芥SOS基因的完整编码序列从它的cDNA克隆中扩增。
[0037]根据bar、S0S1、S0S2、S0S3、CBL10基因序列，PCR合成引物如下:
[0038]BarF:GCG GTC TGC ACC ATC GTC A
[0039]BarR:GTA CCG GCA GGC TGA AGT CCA
[0040]S0S1-R:5，CCT GCC AAA GGA AAT CAT C3，
[0041]S0S1-F:5’GCT TGC TAC ATT TCT GCT G3’
[0042]S0S2-R:5' CCA TTG AGT TCG CTA CAG C3’
[0043]S0S2-F:5’ TTA GTG GAC AGG GTT ACG A3’
[0044]S0S3-F:5'GGG ATG GGC TGC TCT GTA TCG AAG3’
[0045]S0S3-R:5'ACC ACC GAG CTC TAG GAA GAT ACG3’
[0046]CBL10-F:5，GCA ATT CTG CGC CGT CTT TAT ACC3，[0047]CBLlO-R:5’CAT TTG TTG CAC CTC TTC TCG CTC3’
[0048]PCR反应条件如下:
[0049]在25μ I的PCR反应管中，加入下述反应试剂:0.5μ I Taq酶，2.0 μ I引物，2.0 μ IdNTP，2.5μ 110 X buffer, 1.0μ I 模板和 17.0 μ lddH20。
[0050](I) bar基因PCR反应程序如下:
[0051]94°C 预变性 5min ；
[0052]94。(:变性 30sec ；
[0053]58°C退火 3Osec;
[0054]72°C 延伸 Imin ；
[0055]72? 延伸 5min ；
[0056]循环数:30；
[0057]4°C保存。PCR扩增后将获得的扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测并在凝胶成像仪上照相。
[0058](2) SOSl基因PCR反应程序如下:
[0059]94°C 预变性 5min ；
[0060]94。(:变性 30sec ；
[0061]53°C退火 50sec ;
[0062]72? 延伸 Imin ；
[0063]72°C 延伸 5min ；
[0064]循环数:30；
[0065]4°C保存。PCR扩增后将获得的扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测并在凝胶成像仪上照相。
[0066](3) S0S2基因PCR反应程序如下:
[0067]94°C 预变性 5min ；
[0068]94。(:变性 30sec ；
[0069]52°C退火 30sec
[0070]72。(:延伸 Imin ；
[0071]72。〇延伸511^11;
[0072]循环数:30；
[0073]4°C保存。PCR扩增后将获得的扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测并在凝胶成像仪上照相。
[0074](4) S0S3基因PCR反应程序如下:
[0075]94°C 预变性 5min ；
[0076]94。(:变性 30sec ；
[0077]59O退火 3Osec;
[0078]72。(:延伸 Imin ；
[0079]72 O 延伸 5 min ；
[0080]循环数:30；
[0081]4°C保存。PCR扩增后将获得的扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测并在凝胶成像仪上照相。
[0082](5) CBLlO基因PCR反应程序如下:
[0083]94。0预变性511^11;
[0084]94?变性 30sec ；
[0085]57。〇退火3086。；
[0086]72 O 延伸 Imin ；
[0087]72 O 延伸 5min ；
[0088]循环数:30；
[0089]4°C保存。PCR扩增后 将获得的扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测并在凝胶成像仪上照相。
[0090]然后，选择KEGT-A作为重组二元质粒基本框架，在KEGT-A插入选择基因bar基因。重组二元质粒的结构如图2所示。
[0091]接下来，含有SOS基因的重组二元质粒先被用来转化农杆菌；重组农杆菌再被用来转化草坪草愈伤组织。该愈伤组织在含有植物激素的培养基中长成整株转基因草坪草。具体过程如下:
[0092]1、草坪草种子在MS+5.5ml/L2, 4_D培养基中转化为愈伤组织。
[0093]MS培养基含有以下成分:
[0094](I) 100ml/L 大量元素(10 X 大量元素含有 KN0319g/L ；NH4N0316.5g/L ；CaCL23.33g/L ；MgS04.7H203.7g/L ；KH2P041.7g/L)，
[0095](2)101111/1微量元素(100\ 微量元素含有 MnS04.4H202230mg/L ；KI83mg/L；H3B03620mg/L ；ZnS04.7H20860mg/L ；Na2Mo04.2H2025mg/L ；CuS04.5H202.5mg/L ；CoCL2.6H202.5mg/L),
[0096](3) lOml/L 铁盐(100X 铁盐含有 FeS04 *7H202780mg/L ;Na2_EDTA *2H203730mg/L),
[0097](4) lOml/L有机成分(100X有机成分含有IV A肌醇10g/L ；IV B烟酸50mg/L ;维生素 B650mg/L ;维生素 B110mg/L ;甘氨酸 200mg/L)，
[0098]pH 为 5.8。
[0099]2、转基因草坪草在MS+2.0ml/L6-BA+l.0ml/L KT培养基中分化出幼芽。
[0100]3、转基因草坪草在1/2MS (铁盐加倍)+0.3ml/L IBA培养基中分化出根。
[0101]再然后，我们分别用了 PCR、Southern杂交、Northern印迹杂交来证实转基因草坪草中含有拟南芥SOS基因,且其闻效表达。分别说明如下:
[0102]1、PCR扩增时，模板为转基因苜蓿基因组DNA (P1-P7)，阳性对照(CK+)为质粒基因组DNA，阴性对照(CK-)为野生型草坪草基因组DNA。PCR结果见图3至图7。
[0103]2、Southern杂交时，模板为转基因苜蓿基因组DNA (P1、P2)，阳性对照(CK+)为质粒基因组DNA，阴性对照(CK-)为野生型草坪草基因组DNA。具体的反应条件如下:
[0104]Southern 试剂配制:
[0105]变性液:1.5mol/L NaCl ;0.5mol/L NaOH
[0106]中和液:lmol/LTris-Cl (pH8.0) ；1.5mol/L NaCl
[0107]转移液(20XSSC):3mol/L NaCl ;0.3mol/L柠檬酸钠；pH7.0 (高压灭菌，室温保存)
[0108]10%SDS (配制时68°C加热助溶，浓盐酸调pH至7.2，定容室温保存)
[0109]洗膜缓冲液1:2 X SSC ；0.1%SDS (用 20 X SSC 和 10%SDS 溶液配制)
[0110]洗膜缓冲液2:0.5 X SSC ；0.1%SDS (用 20 X SSC 和 10%SDS 溶液配制)
[0111]洗液(washingsolution):0.lmol/L Maleic acid (马来酸)；0.15mol/L NaCl ；ρΗ7.520°C) ；0.3%Tween20
[0112]Maleic acid buffer (马来酸缓冲液):0.lmol/L Maleic acid ;0.15mol/LNaCl ；pH7.5 (20。。)(固体 NaOH 调 pH 至 7.5)
[0113]Detection buffer:0.lmol/L Tris-Cl ；0.lmol/L NaCl ；pH7.5 (20°C )
[0114]I)制备探针
[0115]提取带有目的基因的质粒，进行PCR扩增bar (460bp)，对PCR产物进行回收(方法参考天根公司提供的回收试剂盒)。取2ul DNA加灭菌去离子水至16 μ I在开水中温育IOmin,然后在冰水浴中骤冷。
[0116]反应体系:
[0117]
【权利要求】
1.构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，包括以下步骤: (一)、构建农杆菌重组二元质粒:将拟南芥S0S1，S0S2,S0S3, CBLlO完整的表达基因克隆，并将其植入大肠杆菌二元质粒，获得重组二元质粒； (二)、转化农杆菌和草坪草:将重组二元质粒导入农杆菌，并感染草坪草愈伤组织； (三)、选择和培育转基因草坪草。
2.根据权利要求1所述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，在步骤(一)中，选择KEGT-A作为重组二元质粒基本框架，在KEGT-A插入选择基因BAR基因。
3.根据权利要求2所述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，重组二元质粒的结构为: RB基因-TM220基因-SOSl基因-S0S3基因-S0S2基因-TMl基因-CBLlO基因-TM2基因-BAR基因-TM220基因-LB基因。
4.根据权 利要求1所述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，在步骤(二)中，所述的草坪草愈伤组织由草坪草种子在MS+5.5ml/L2, 4_D培养基中转化而来。
5.根据权利要求1所述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，在步骤(三)中，所述的转基因草坪草在MS+2.0ml/L6-BA+l.0ml/L KT培养基中分化出幼芽。
6.根据权利要求5所述的构建和培育耐盐草坪草的方法，其特征在于，在步骤(三)中，所述的转基因草坪草在1/2MS+0.3ml/L IBA培养基中分化出根，所述MS培养基的铁盐加倍。
【文档编号】C12N15/84GK103540610SQ201310488229
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月17日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】麻冬梅, 许兴, 郭伶娜, 蔡进军, 杨亚亚 申请人:宁夏大学