一种温控零背景t载体前体及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种温控零背景T载体前体及其构建方法和应用。所述温控零背景T载体前体，是载体pFLX107，其序列如SEQ?ID?NO.1所示。构建成功的载体体积为3029bp，经XcmI酶切制备而成的T载体体积仅2747bp，与当今市场上的各类商用T载体体积相近，可广泛应用于各类外源PCR片段的TA克隆。由于温控致死基因的存在，在37℃温度下即可实现对重组转化子100%的阳性克隆筛选。同时由于在载体中克隆位点两侧集成了可由生物公司免费提供的通用测序引物序列结合位点，在送样测序时无需再自备引物，进一步降低了成本。
【专利说明】一种温控零背景T载体前体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域中一种载体的构建及制备，特别涉及一种温控零背景T载体前体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]T载体是分子生物学实验中最为常用的分子克隆技术——TA克隆的核心工具。当前T载体的制备主要有两种方法。第一种方法通过末端转移酶或Taq酶将单个脱氧胸腺核苷酸(dTTP)添加到经平末端限制性内切酶酶切后的线性化载体的3’端(Holton andGraham, 1991);第二种方法则是通过在载体中引入串联排列的特定限制性酶切位点，如AspEI, Eamll05I或XcmI等，然后用相应的内切酶酶切产生3’端具有单个T突出的线性T载体(Ichihara and Kurosawa, 1993; Harrison et al, 1994)。第一种方法在制备 T 载体的过程中存在加尾效率较低以及线性质粒在加尾过程中其两端的序列有时会被部分删除等问题。相较之下，第二种方法更为快捷、高效及稳定。
[0003]在T载体的设计过程中另一个值得关注的问题便是对重组转化子的高效筛选。目前，基于大肠杆菌β_半乳糖苷酶α互补原理的蓝白斑法在重组转化子的筛选中最为常见(U1 Imann, 1992)，不过由于β -半乳糖苷酶存在一定的基础活性使得蓝白斑的筛选不够精确，尚需借助其他方式，如PCR或特定限制性内切酶酶切等对重组转化子进行进一步鉴定。此外，该方法还需使用昂贵的化学试剂IPTG和X-gal，成本较高。除β -半乳糖苷酶基因外，其他报告基因，如绿色荧光蛋白、内切葡聚糖酶、酯酶和荧光素酶基因等也可用于重组转化子的筛选(Kwon et al, 1998; Jo et al, 2001; Song et al, 2002; Lim et al, 2010)。在这些筛选系统中，绿色荧光蛋白有时显示出相当的基础活性，会导致假阳性克隆的出现。同时，由于目的克隆的筛选需要紫外线照射，对机体具有一定的伤害性。其他基于报告基因的筛选系统则大多需要在培养基`中加入特殊的化学试剂，而且由于酶切不完全或载体自连也仍难避免假阳性克隆的背景干扰，因而均存在一定的局限性。
[0004]通过在载体中引入对宿主菌具有致死或毒性作用的基因构建阳性选择系统可有效避免以上问题的出现，不过现今已报道的一些阳性选择系统大多有赖于特殊的培养基或化学试剂，或仅限于少数宿主菌(Schlkper et al, 1998) 0相较之下，一种基于裂解基因E及其温控系统构建而成的T载体由于只需通过温度控制即可实现高效阳性选择无疑具有操作上和经济上的便利性(Ma et al，2009)。不过尽管如此，该T载体的构建及制备也仍有其不足之处。首先，该T载体的制备是通过Taq酶将单个脱氧胸腺核苷酸(dTTP)添加到经平末端限制性内切酶EcoRV酶切后的线性化载体的3’端，而如前所述，此类方法效率较低。其次，载体中外源片段的插入位点位于RBS和选择基因(裂解基因E)起始密码子之间，理论上在42°C的诱导温度下只有插入了外源PCR片段破坏基因E表达的转化子可以生长形成阳性克隆，这一设计并不适于对某些毒性基因或致死基因的正向克隆，会一定程度上限制该T载体的应用范围。另一方面，近来利用DNA-Shuffling技术对基因E的人工改造结果显示在5’端缺失单个碱基的情况下其裂解活性反而增强，序列比对结果显示其前74bp序列内含有和许多病毒增强子及一些强启动子-35区域类似的序列(Yu et al，2011)，这些发现也对前述设计的理论合理性构成了挑战，因为这意味着在某些情况下，即使有外源PCR片段的插入，基因E的裂解活性也并一定会完全丧失。最后，与市场上各类商业性T载体相比，该T载体缺乏与各类生物测序公司的“兼容性”，每次测序均需自备测序引物，而商业性T载体内部通常集成有通用测序引物M13-47和M13-48序列，这些引物可由测序公司免费提供。此外，与商业性T载体通常不到3000bp的大小相比，该T载体的体积(3929bp)偏大，不利于大片段的克隆，同时还会降低载体的克隆转化效率，以上问题也普遍存在于现今各类非商业化的T载体之中。
【发明内容】
[0005]1、要解决的技术问题
[0006]为了解决当前TA克隆中由于假阳性克隆的存在对重组转化子筛选造成的背景干扰，实现对目的克隆的高效筛选。同时，兼顾操作上的便利性与生物测序公司的“兼容性”，降低实验成本。最后是实现载体用途的多元化，这也是未来克隆载体设计发展的趋势之一。本发明涉及一种温控零背景T载体前体及其构建和应用。
[0007]2、技术方案
[0008]本发明涉及一种温控零背景T载体前体，是载体PFLX107，其序列如SEQ ID N0.1所示。其物理图谱如图1，包括源自质粒PKF396M-3的复制子序列，氯霉素乙酰转移酶基因，内部HindIII位点被沉默突变的温敏阻遏蛋白cI857m序列，lambda右向启动子pR，增强子T7gl0和SD序列，lambda t0转录终止子，核糖体RNA操纵子T1T2终止子，以及噬菌体phiX174裂解基因E突变体mE。在该载体中，基于扩大载体应用范围的考虑，根据密码子同义突变原理，将对宿主菌具有致死作用的噬菌体phiX174裂解基因E改造成含Hindlll、BclI > SalI/AccI >EagI > SacI > SnaBI >XhoI/AvaI >PstI 等限制性酶切位点的突变体 mE, XcmI酶切位点则分别位于HiE两端`，通过XcmI酶切即可形成3’端单个T突出的线性T载体，克服了通过平末端限制性内切酶EcoRV酶切加T的低效性以及将外源片段的插入位点设计在RBS和裂解基因E起始密码子之间的理论缺陷及应用上的局限性。
[0009]载体中mE基因由源自λ噬菌体右向启动子pR及其温敏阻遏子cI857m构建而成的温控表达系统所控制，形成阳性选择系统。当温度低于30°C时，基因mE被稳定抑制，而当温度高于30°C (通常为42°C)，由于阻遏蛋白CI857热激失活基因mE即可开始表达，对宿主菌形成致死效应，因此在此温度下只有插入了外源片段使mE基因失活了的重组转化子可以生长从而实现阳性选择。
[0010]为了兼顾与生物测序公司的“兼容性”，在TA克隆位点两侧分别集成有生物公司通用测序引物M13-48和M13-47结合位点。由于进行DNA测序时，紧接引物的10~30碱基有时不一定能完全读清楚，因此在TA克隆位点与测序引物之间各自预留35bp的间距，其中M13-48和TA克隆位点之间的序列由增强子T7gl0和SD盒等构成，可以进一步增强mE基因的转录翻译效率。TA克隆位点和M13-47之间的序列则由无任何特定意义的核酸序列组成。
[0011]此外，为了减少载体体积，提高载体的克隆转化效率，载体中冗余的序列被去除。同时，为了防止启动子阻塞效应的出现，载体中各启动子所控制基因下游均置有强的终止子序列，不过正向表达的mE和反向表达的氯霉素乙酰转移酶共用一个终止子rrnbTlT2,这主要是因为rrnbTlT2具有双向终止功能，而且通过这种设计可以进一步减少载体体积。最后，在载体各功能部件的“结合”处均预留有限制性酶切位点(图1)，为将来对载体进行进一步改造，如抗性基因或复制子类型转换等，提供便利操作空间。
[0012]本发明还公开了所述温控零背景T载体前体PFLX107在制备T载体中的应用。
[0013]3、有益效果
[0014]构建成功的载体体积为3029bp，经XcmI酶切制备而成的T载体体积仅2747bp，与当今市场上的各类商用T载体体积相近，可广泛应用于各类外源PCR片段的TA克隆，甚至包括各类对宿主菌具有毒性或致死效应基因的TA克隆，因这些基因被克隆进该载体后会产生一个碱基的移码，而这种移码效应会使这些基因的表达丧失活性。
[0015]其次，由于温控致死基因的存在，在37°C温度下即可实现对重组转化子100%的阳性克隆筛选。同时由于在载体中克隆位点两侧集成了可由生物公司免费提供的通用测序引物序列结合位点，在送样测序时无需再自备引物,进一步降低了成本。
[0016]最后，由于裂解基因E通常被用于革兰氏阴性菌菌蜕疫苗的制备以及mE基因内存在众多的限制性酶切位点，使得该载体除可用于制备T载体外，还可用外源片段的定向克隆及革兰氏阴性菌菌蜕疫苗的生产制备。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是质粒PFLX107的物理图谱
[0018]Or1:复制起始区；cI857m:温敏阻遏蛋白cI857突变体；pR:lambda噬菌体右向启动子；mE:噬菌体phiX174裂解基因E突变体；Cat:氯霉素乙酰转移酶基因；t0 =Iambda t0转录终止子；rrnbTlT2:核糖`体RNA操纵子T1T2终止子。
【具体实施方式】
[0019]表1:本发明中所用引物
[0020][0021]
【权利要求】
1.一种温控零背景T载体前体，是载体PFLX107，其序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述温控零背景 T载体前体pFLX107在制备T载体中的应用。
【文档编号】C12N15/64GK103497965SQ201310488129
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月17日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】付立霞, 魏文志, 王秀英 申请人:扬州大学