一种酿酒酵母变异菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种酿酒酵母变异菌株GDC01（SaccharomycesCerevisiaeDrugtolerant），于2013年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTTCCNO：M2013411。提供多级驯化选育方法，选择具有耐毒性的酿酒酵母变异菌株，将该酿酒酵母变异菌株用于生产纤维素乙醇，结果表明，糖醇转化率达85%以上，耐毒酵母经连续传代5次，其产乙醇性能基本维持在100g/L，产乙醇性能基本保持稳定。
【专利说明】一种酿酒酵母变异菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有耐毒酿酒酵母变异株的选育方法、选育得到的菌株的应用，属于生物技术和微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着化石燃料资源的日益枯竭和使用过程中产生的一系列环境污染问题，纤维素乙醇以木质纤维素来源广泛，可再生，被认为是最具有发展前景的新型能源之一。但是在木质纤维素的预处理的过程中，会不可避免地产生一些对酿酒酵母生长和发酵有抑制作用的物质，这些抑制因子主要是甲酸、乙酸、糠醛，它们能延长一般用于淀粉质发酵中的酿酒酵母生长的延滞期，严重减少乙醇产量，成为木质纤维素开发为燃料乙醇的关键难题。
[0003]研究发现,传统用于淀粉质的酿酒酵母iSaccharomyces Cerevisiae)在经过预处理后的木质纤维素糖化液中，糖醇率仅为50%左右。为了促进纤维素乙醇的工业化进程，人们对水解液进行脱毒处理，但是此方法会增加生产成本，而且在脱毒处理过程中也会损失部分糖类。而通过驯化选育耐毒酿酒酵母，不仅成本低廉，而且相比较基因重组的菌种而言，具有稳定的遗传性，因此寻找耐毒的高产酒精酵母对纤维素乙醇的可持续发展具有重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种酿酒酵母变异菌株(Saccharomyces Cerevisiaedrugtolerant)，该酿酒酵母变异菌株经驯化选育后对乙酸、甲酸、糠醛具有一定的耐毒性。
[0005]所述的酿酒酵母变异菌株GDC01(Saccharomyces Cerevisiae Drugtolerant),于2013年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTTCC NO:M 2013411，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种耐毒性酿酒酵母变异菌株的驯化选育方法，所述的耐毒酿酒酵母变异菌株是以淀粉质糖化液发酵良好的酿酒酵母为原始出发菌株，为淀粉质乙醇发酵行业目前普遍使用的酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)菌株,该菌株乙醇发酵性能优良(安琪酵母股份有限公司生产赠送)。
[0007]按照逐级驯化的培养方法，经逐级驯化后，筛选出来的菌株接种到含有0_4g/L乙酸0.1-0.5甲酸和ο-lg/L糠醛的斜面培养基中，保持菌株的耐毒能力。图1为耐毒性酿酒酵母菌株选育及性能评价流程图，具体步骤为:
1)将在4°C冰箱保藏的斜面酿酒酵母菌种在室温下活化4-6小时后，接种至250mL装有100mL培养基的三角瓶中，在3°C、150rpm条件下摇瓶培养24小时后，可以用于转接；
2)取斜面培养基上的一环菌种接种到活化培养基中，28°C、150 r/min培养24h，取10mL活化后的菌液接种到90mL驯化培养基中，保证最初的生物量为0.lg/L,每隔6_12h测量样品中的生物量和葡萄糖含量；
3)当培养液中的葡萄糖含量小于起始葡萄糖含量的百分之九十时，摇床停止晃动，静止15min，使培养基中的菌体自然沉淀在摇瓶底部，在无菌的条件下，把摇瓶底部的10mL菌液接种到下一个批次90mL的驯化培养基中，摇床恢复晃动，此时作为下一个批次驯化的起始位点，重复以上操作，完成逐级驯化，在驯化菌种的过程中，当培养液中的葡萄糖含量小于起始葡萄糖含量的百分之九十时，要迅速更换培养基，每个抑制剂在逐级驯化中至少重复8次。
[0008]所述的斜面培养基的组分为:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，麦芽浸粉3 g/L，琼脂20 g/L ;活化培养基的组分为:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3g/L，麦芽浸粉3 g/L ;驯化培养基的组分为:葡萄糖25g/L，酵母浸粉lg/L，KH2P04 1 g/L,(NH4)2S04 0.4g/L, MgS04.7H20 0.08 g/L，抑制剂。
[0009]所述的抑制剂为乙酸或甲酸或糠醛，所述的乙酸的浓度为0.8^4.0g/L,甲酸的浓度为0.0.5g/L，糠醛的浓度为0.2^1.0g/L。
[0010]所述的乙酸的逐级驯化培养浓度分别为0.8 g/L、l.6 g/L,2.4 g/L,3.2 g/L、4.0g/L;甲酸的逐级驯化培养浓度分别为0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L ;糠醛的逐级驯化培养浓度分别为0.2 g/L、0.4 g/L,0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L。
[0011]耐毒能力:变异株在毒性环境下也能生长旺盛。抑制剂浓度在乙酸3.2g/L，糠醛0.8g/L，甲酸0.4g/L时，在18h后，耐毒酵母就进入对数生长期，生物量随着时间的增加而缓慢增长，而且原始菌株一直处于延滞期，生物量一直没有明显的变化，细胞密度低于106个。图2为耐毒酿酒酵母与传统淀粉质酿酒酵母生物量在抑制剂乙酸3.2g/L，糠醛0.8g/L，甲酸0.4g/L时的培养基中的生长差异曲线图。
[0012]细胞膜的完整性:通过对胞外镁离子含量的测定，原始出发菌株胞外镁离子含量为1.0257 ug/mL，而耐毒酵母外泄的镁离子含量为0.3976 ug/mL，说明耐毒酵母在专利所要求的范围内抑制剂浓度下，细胞膜基本完好。如图3为耐毒酵母与传统淀粉质酿酒酵母在耐毒环境下(即，抑制剂乙酸3.2g/L，糠醛0.8g/L，甲酸0.4g/L)细胞膜完整性差别。
[0013]本发明的又一目的在于提供一种经驯化选育的酿酒酵母变异菌株在生产纤维素乙醇上的应用。
[0014]本发明的耐毒酿酒酵母能够将纤维素质来源的可发酵性糖转化成乙醇和二氧化碳，所述的纤维素乙醇按照有关国家标准，与汽油或柴油配混后，可用于机动车、船等的燃料。
[0015]本发明的再一目的在于提供一种经驯化选育的酿酒酵母变异菌株生产纤维素乙醇的方法。具体为:
原料粉碎:将木质纤维素首先粉碎成1.0-3.0mm的粉料。
[0016]预处理:并将粉碎的纤维质原料与水以质量比为1:1_1:3混合，在温度180-230°C、压力为0.5-lMPa下，保温l_5min，快速卸料，收集料液，去除了大部分木质素，以利于纤维素酶的酶解糖化。
[0017]酶解:控制上述纤维素料液含量在20%(w/w)以上，按纤维素酶滤纸酶活30-45 (U/g)，β -葡萄糖苷酶15-25 (U/g)，木聚糖酶200-400 (U/g)添加酶制剂，混合搅拌，并往搅拌罐通入蒸汽和水后，水解，可得到糖浓度在100g/L以上的糖化液。
[0018]发酵:将酿酒酵母变异株的种子液依次接种至一级种子罐中、二级种子罐，培养至还原糖浓度降低到0.2% (w/v)，再接种到纤维素糖化液中进行发酵其中糖化液中添加浓度为 0.15g/L 的 ΚΗ2Ρ04。
[0019]分离:发酵终止后经板框过滤除渣，滤液经蒸馏得到乙醇液。
[0020]所述的酶解过程中控制搅拌罐的温度为50±2°C，搅拌速度为80-150rpm，pH为
4.6土2，水解时间为144-150h。
[0021]所述的发酵过程中二级种子罐体积是一级种子罐体积的8-12倍，种子罐内温度为30 土 2°C，pH 4.2 土 0.2，转速280 _350rpm、通气量0.lvvm，发酵罐内的温度为30 土 2°C，发酵 pH 值为 4.2+0.3，转速为 80-100 rpm。
[0022]所述的木质纤维素原料为作物秸杆、废气林木、草本植物杆。
[0023]糖醇转化率:对工业生产所用的木质纤维素糖化液，其糖醇转化率可达到85%以上。
[0024]产乙醇稳定性能:耐毒酵母经连续传代5次，其产乙醇性能稳定，基本维持在100g/L，结果如表1所示。
[0025]表1耐毒酵母产乙醇性能稳定性测试
【权利要求】
1.酿酒酵母变异菌株GDC01 (Saccharomyces Cerevisiae Drugtolerant),于 2013 年 9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTTCC NO ：M 2013411。
2.权利要求1所述的酿酒酵母变异菌株，具有耐毒性，其特征在于：所述的耐毒性包括 以下驯化选育方法：1)将在4°C冰箱保藏的斜面酿酒酵母菌种在室温下活化4-6小时后，接种至250mL装 有100mL培养基的三角瓶中，在3°C、150rpm条件下摇瓶培养24小时后，可以用于转接；2)取斜面培养基上的一环菌种接种到活化培养基中，28°C、150 r/min培养24h，取10 mL活化后的菌液接种到90mL驯化培养基中，保证最初的生物量为0. lg/L，每隔6_12h测量 样品中的生物量和葡萄糖含量；3)当培养液中的葡萄糖含量小于起始葡萄糖含量的百分之九十时，摇床停止晃动，静 止15min，使培养基中的菌体自然沉淀在摇瓶底部，在无菌的条件下，把摇瓶底部的10mL菌 液接种到下一个批次90mL的驯化培养基中，摇床恢复晃动，此时作为下一个批次驯化的起 始位点，重复以上操作，完成逐级驯化，在驯化菌种的过程中，当培养液中的葡萄糖含量小 于起始葡萄糖含量的百分之九十时，要迅速更换培养基，每个抑制剂在逐级驯化中至少重 复8次。
3.根据权利要求2所述的酿酒酵母变异菌株，其特征在于：斜面培养基的组分为：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，麦芽浸粉3 g/L， 琼脂20 g/L ；活化培养基的组分为：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，麦芽浸粉3 g/L；驯化培养基的组分为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉lg/L，KH2P04 1 g/L, (NH4)2S04 0 . 4g/L， MgS04. 7H20 0. 08 g/L，抑制剂。
4.根据权利要求2或3所述的酿酒酵母变异菌株，其特征在于：抑制剂为乙酸或甲 酸或糠醛，所述的乙酸的浓度为0. 8^4. 0g/L,甲酸的浓度为0. ro. 5g/L，糠醛的浓度为 0. 2?1. 0g/L。
5.根据权利要求4所述的酿酒酵母变异菌株，其特征在于：乙酸的逐级驯化培养浓度 分别为0.8 g/L、1.6 g/L、2.4 g/L、3. 2 g/L、4. 0 g/L ;甲酸的逐级驯化培养浓度分别为0. 1 g/L、0. 2 g/L、0. 3 g/L、0.4 g/L、0. 5 g/L ;糠醛的逐级驯化培养浓度分别为 0. 2 g/L、0. 4 g/ L、0. 6 g/L、0. 8 g/L、1.0 g/L。
6.一种如权利要求2所述的经驯化选育的酿酒酵母变异菌株的应用，其特征在于：经 驯化选育的耐毒性酿酒酵母变异菌株用于生产纤维素乙醇。
7.如权利要求6所述的经驯化选育的酿酒酵母变异菌株生产纤维素乙醇的方法，将木 质纤维素首先粉碎成1. 0-3. 0mm的粉料，并将粉碎的纤维质原料与水以质量比为1 :1_3混 合，在温度180-230°C、压力为0. 5-lMPa下，保温l_5min，快速卸料，收集料液，其特征在于： 该方法还包括以下步骤，1)酶解：控制上述纤维素料液含量在20%(w/w)以上，按纤维素酶滤纸酶活30-45(U/ g)，葡萄糖苷酶15-25 (U/g),木聚糖酶200-400 (U/g)添加酶制剂，混合搅拌，并往搅拌 罐通入蒸汽和水后，水解，得糖化液；2)发酵：将酿酒酵母变异株的种子液依次接种至一级种子罐中、二级种子罐，培养至还 原糖浓度降低到0. 2%( w/v )，再接种到纤维素糖化液中进行发酵，其中糖化液中添加浓度为`0.15g/L 的 ΚΗ2Ρ04 ；3)分离:发酵终止后经板框过滤除渣，滤液经蒸馏得到乙醇液。
8.根据权利要求7所述的经驯化选育的酿酒酵母变异菌株生产纤维素乙醇的方法，其特征在于:酶解过程中控制搅拌罐的温度为50±2°C，搅拌速度为80-150rpm，pH为4.6土2，水解时间为144-150h。
9.根据权利要求7所述的经驯化选育的酿酒酵母变异菌株生产纤维素乙醇的方法，其特征在于:发酵过程中二级种子罐体积是一级种子罐体积的8-12倍，种子罐内温度为30 土 2°C，pH 4.2 土 0.2，转速280 _350rpm、通气量0.lvvm ;发酵罐内的温度为30 土 2°C，发酵pH 值为 4.2+0.3，转速为 80-100 rpm。
10.根据权利要求7所述的经驯化选育的酿酒酵母变异菌株生产纤维素乙醇的方法，其特征在于:木质纤维素原料为`作物秸杆、废气林木、草本植物杆中的一种或多种。
【文档编号】C12N1/16GK103627644SQ201310513453
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月26日 优先权日:2013年10月26日
【发明者】龚大春, 李小娟, 肖玲玲, 郭金玲, 吕育财, 田毅红, 李德莹, 陈卫峰 申请人:三峡大学