一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法及应用，属于酶制剂、酿酒添加剂【技术领域】。本发明涉及将从普罗威登斯菌（Providenciasp.）JNB815中提取的具有降解尿素和氨基甲酸乙酯(EC)活性的游离双功能酶，经壳聚糖吸附、明胶包埋和京尼平交联，得固定化双功能酶。该固化酶以尿素为底物时，最适温度为40℃，最适pH为4.0；以EC为底物时，最适温度60℃，最适pH为4.5。两种酶活的贮存半衰期分别为54d及45d。本发明还涉及这种固定化双功能酶的应用：尿素去除率可达93.03%，EC去除率为56.60%。本发明可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，且固定化双功能酶可以重复利用，在去除黄酒中微量尿素和EC的应用中具有更多的优势。
【专利说明】一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法及应用，具体地说是将普罗威登斯菌iProvidencia sp.) JNB815中提取的游离双功能酶，经壳聚糖吸附、明胶包埋，京尼平交联，固化得固定化双功能酶，属于酶制剂、酿酒添加剂【技术领域】。
【背景技术】
[0002]氨基甲酸乙酯(EC)，是2A类致癌性的物质，微量存在于大部分发酵食品和酒精饮料中。研究发现黄酒中90%氨基甲酸乙酯主要由尿素和乙醇经化学反应生成的。通过向酒中添加少量的脲酶可以有效去除尿素、抑制氨基甲酸乙酯形成，而EC降解酶则能直接有效的分解成品黄酒中已经产生的EC。
[0003]本实验室所筛选的普罗威登斯菌sp.)JNB815能产生兼有降解尿素和EC活性的双功能酶，将这种菌产生的粗酶经过初步提纯后进行固定化，可应用在黄酒中同时去除尿素和EC，且可以分离回收再利用。此外本发明采用的固定化材料为天然大分子壳聚糖、明胶和京尼平，这三者均无毒性，亲水性好，具有适合酶催化反应的天然微环境。[0004]我国出口黄酒中所用的脲酶均从国外进口，国内尚未形成生产规模，而国内及国际上关于EC降解酶的报道也较少。因此酒用脲酶和EC降解酶的研究对我国酿酒业的品质提升及国际市场拓展等方面均有深远的意义。而具有同时降解尿素和EC酶活的双功能酶则在黄酒的应用中具有更多的优势。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种天然材料体系复合固定化酒用双功能酶的制备方法及应用，将从sp.JNB815菌体细胞破碎液中提取的游离双功能酶，经壳聚糖吸附、明胶包埋和京尼平交联，得固定化双功能酶，并应用于黄酒中去除尿素和EC。
[0006]本发明的技术方案:一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法，将从普罗威登斯菌iProvidencia sp.) JNB815菌体细胞破碎液中提取的游离双功能酶，经壳聚糖吸附、明胶包埋和京尼平交联，得固定化酒用双功能酶。工艺为:
A、游离酶提取:
(1)菌种:采用普罗威登斯菌O0Toriofeflciasp.)JNB815,本实验室筛选，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号=CGMCC N0.8326 ；
(2)游离酶的提取:
种子培养:种子培养基组成以g/L计:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2P042，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用NaOH调pH 7.0，用纯水配制；接种量3%，37°C摇床培养8_12h,转速 150 rpm ；
发酵培养:发酵培养基组成以g/L计:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO42，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0.05，六水硫酸镍0.05，HCl调ρΗ5.5，用纯水配制；接种量5%，37°C摇床培养20-24 h，转速150 rpm ；
收集菌体:将发酵液4°C、8000 r/min离心5 min后，弃上清，所得菌体用去离子水洗涤两次，PH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，每升发酵液离心后所得菌体复溶于PH4.5的100 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中；
超声波破碎:超声波功率300 W，破碎时间15 min (破碎时间3 S、间隔时间3 S)，处理量35 mL ;将破碎液于4°C下10000 r/min离心20 min,收集上清液，即为游离酶酶液；
B、固定化过程:
(3)称取壳聚糖:3-5g、明胶广3 g，溶于100 mL 1%的乙酸中，置于磁力搅拌器上搅拌均匀后，超声脱泡；取质量浓度20%的NaOH溶液和无水乙醇按4:1的体积比混合均匀制成200-300 mL凝结液；用注射器将壳聚糖和明胶混合溶液滴入凝结液中，形成直径3-4 _的微球，凝结一段时间后用去离子水洗涤壳聚糖微球至中性，滤干；
(4)将步骤(3)所得壳聚糖微球在30°C恒温水浴震荡的条件下，与质量浓度0.4%的京尼平溶液进行交联，壳聚糖微球:京尼平溶液的比g/mL计为1: 5，交联时间为6h，洗涤除去游离的京尼平溶液；活化后的微球与步骤A中的游离酶酶液在4°C冰箱中静置8h进行固定，每g微球加入2.5 mL酶液；最后，吸出未固定的游离酶酶液，并洗涤微球至表面无游离酶为止，所得固定化酶贮存在4 V冰箱中，备用。
[0007]2、该固定化酒用双功能酶的性质:
最适温度、最适pH及忙存半衰期的确定:
(I)在20-70°C范围内，每隔10°C，分别测定酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。固定化酒用双功能酶催化尿素及EC的最适温度分别为40°C及60°C。
[0008](2)在ρΗ3.0-8.0范围内，每隔0.5个pH梯度，分别测定酶活，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。固定化酒用双功能酶催化尿素及EC的最适pH分别为4.0及4.5。
[0009](3)将固定化酒用双功能酶放于柠檬酸缓冲液中，4°C冰箱内保存，每隔三天测定固定化酶以尿素和EC为底物的酶活，两种酶活的半衰期分别为54 d及45 d。
[0010]3、固定化酒用双功能酶的应用:在内径3 cm,长12 cm的层析柱中,黄酒的固定化酶加量为37.5 U/mL,调节流速I mL/min,使400 mL的酒样流过反应器,循环处理4次,尿素去除率能达到96.92%。在32°C，摇床转速100 rpm的条件下，黄酒样品中固定化尿素降解酶加酶量为0.04 U/mL黄酒时，固定化酶处理黄酒20 h后，尿素去除率可达93.03%。同样摇床条件下，样品中固定化EC降解酶的加酶量为0.17 U/mL时，反应20 h后，EC去除率为 56.60%ο
[0011]游离酶活测定方法:采用靛酹蓝反应(Berthelot reaction)比色法
酶活力定义:在常压，37°C，pH4.5条件下，每分钟分解底物尿素或氨基甲酸乙酯产生IMfflol氨为一个酶活力单位。其中，尿素降解酶和EC降解酶活力的测定分别采用尿素和EC为底物。
[0012]固定化酒用双功能酶酶活测定方法:取0.5 g固定化酒用双功能酶分别浸入一定体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制的PH4.5的3%的尿素或EC溶液中，在37°C恒温水浴箱中保温20 min后，过滤取其滤液，余下的方法与游离酶活力测定相同。固定化双功能酶活力定义同游离酶。
[0013]尿素含量的测定方法:二乙酰一肟法。[0014]EC含量的测定方法:采用气相色谱质谱联用法。
[0015]本发明的有益效果:游离酶的提取方法可以用工业生产方法代替，固定化酒用双功能酶的制作过程可以用机器制作代替，实现工业化生产。该固定化酒用双功能酶能在酒中稳定发挥作用，尿素去除率高，在黄酒中加入固定化酒用双功能酶后尿素去除率能达到93.03%，EC去除率能达到56.60%。且固定化酒用双功能酶便于回收，可重复利用多次。本发明可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，在勾兑，澄清酒的过程中，添加固定化酒用双功能酶，就可以降低尿素和EC含量，是目前较为理想的同时去除酒中尿素和EC的方法。
[0016]生物材料样品保藏:一株普罗威登斯菌G0Toriofeflcia sp.)JNB815,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号:CGMCC N0.8326，保藏日期2013年10月12日。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1固定化酒用双功能酶制备工艺示意图。
【具体实施方式】[0018]实施例1:称取称取壳聚糖:1-5 g、明胶广3 g，溶于100 mL 1%的乙酸中，置于磁力搅拌器上搅拌均匀后，超声脱泡。取20%的NaOH溶液和无水乙醇按4:1的体积比混合均匀制成200-300 mL凝结液。用注射器将壳聚糖和明胶混合溶液滴入凝结液中，形成直径3-4 _的微球，凝结一段时间后用去离子水洗涤壳聚糖微球至中性。在30°C恒温水浴震荡的条件下，将壳聚糖微球与质量浓度0.4%的京尼平溶液进行交联，壳聚糖微球:京尼平溶液的比g/mL计为1: 5,交联时间为6h,洗漆除去游离的京尼平溶液；活化后的微球与游离酶液在4°C冰箱中静置8h进行固定，每g微球加入2.5 mL酶液；最后吸出未固定的游离酶，并洗涤微球至表面无游离酶为止，所得固定化酶贮存在4°C冰箱中，备用。
[0019]实施例2:将实施例1所得的固定化酒用双功能酶15 g (即加酶量为37.5U/mL)装入内径3 cm,长12 cm的柱子中，调节酒样流速I mL/min,使400 mL的酒样(尿素含量为74.94 mg/L)流过反应器，所有酒样流过柱子后，测定总尿素去除率。循环处理4次，测定每次过柱后的尿素去除率。固定化酒用双功能酶首次可去除酒样中50.77%的尿素，同一黄酒样品经重复过柱4次后,尿素去除率达96.92%,尿素终浓度降低为2.31 mg/L。
[0020]实施例3:分别配制15 mL尿素加量均为25 mg/L的黄酒及模拟酒(50%乙醇)样品，样品中固定化酒用双功能酶加量分别为0.03 U/mL和0.04U/mL，32°C摇床100 rpm反应20 h，测定尿素去除率。在两种不同加酶量条件下，固定化酒用双功能酶对黄酒的尿素去除率分别为74.16%和93.03%，对模拟酒的尿素去除率分别为95.16%和98.01%。
[0021]实施例4:将实施例1所得的固定化酒用双功能酶按0.10U/mL和0.17U/mL的比例分别加到15 mL黄酒样品中(EC含量277.83 Pg/L)，32°C摇床100 rpm反应20 h，采用GC-MS外标法测定黄酒样品的EC含量。固定化双功能酶的EC去除率分别为46.06%及56.60%。
【权利要求】
1.一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法，其特征在于将从普罗威登斯菌iProvidencia sp.)JNB815菌体细胞破碎液中提取的游离双功能酶，经壳聚糖吸附、明胶包埋和京尼平交联，得固定化酒用双功能酶；工艺为: A.游离酶提取: (1)菌种:采用普罗威登斯菌O0Toriofeflciasp.)JNB815,本实验室筛选，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号=CGMCC N0.8326 ； (2)游离酶的提取:菌种经过种子培养和发酵培养获得一定量菌体，将发酵液4°C、.8000rpm离心5 min后，弃上清，所得菌体用去离子水洗涤两次，pH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，离心获得全细胞；将获得的全细胞用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释到原发酵液体积的1/10，重新悬浮菌体，搅匀，进行超声波破碎，超声波破碎条件为300 W、.15min,破碎时间3 S、间隔时间3 s,处理量35 mL ;破碎液在4°C、10000 rpm离心20 min,收集上清液，即为游离酶酶液； B.固定化过程: (3)称取壳聚糖:3~5g、明胶广3 g，溶于100 mL 1%的乙酸中，置于磁力搅拌器上搅拌均匀后，超声脱泡；取质量浓度20%的NaOH溶液和无水乙醇按4:1的体积比混合均匀制成.200-300 mL凝结液；用注射器将壳聚糖和明胶混合溶液滴入凝结液中，形成直径3-4 _的微球，凝结一段时间后用去离子水洗涤壳聚糖微球至中性，滤干； (4)将步骤(3)所得壳聚糖微球在30°C恒温水浴震荡的条件下，与质量浓度0.4%的京尼平溶液进行交联，壳聚糖微球:京尼平溶液的比g/mL计为1: 5，交联时间为6h，洗涤除去游离的京尼平溶液；活化后的微球与步骤A中的游离酶酶液在4°C冰箱中静置8h进行固定，每g微球加入2.5 mL酶液；最后，吸出未固定的游离酶酶液，并洗涤微球至表面无游离酶为止，所得固定化酶贮存在4°C冰箱中，备用。
2.用权利要求1方法制备的固定化酒用双功能酶，其特征在于该固定化酒用双功能酶催化尿素反应的最适温度为40°C，最适pH为4.0，酶活半衰期为54 d ;催化EC反应的最适温度60°C，最适pH为4.5，酶活半衰期为45 d。
3.用权利要求1方法制备的固定化酒用双功能酶的应用:其特征在于在内径3cm，长.12 cm的层析柱中，黄酒的固定化酶加量为37.5 U/mL，调节流速I mL/min，使400 mL的酒样流过反应器，循环处理4次，尿素去除率能达到96.92% ;在32°C、摇床转速100 rpm的条件下，黄酒样品中固定化尿素降解酶加酶量为0.04 U/mL黄酒时，固定化酒用双功能酶处理黄酒20 h后，尿素去除率可达93.03% ;同样摇床条件下，样品中固定化EC降解酶的加酶量为0.17 U/mL时，反应20 h后，EC去除率为56.60%。
【文档编号】C12N11/04GK103525803SQ201310513221
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】田亚平, 查小红, 杨广明 申请人:江南大学