一种海胆抗菌肽及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种海胆抗菌肽及其制备方法，包括构建分泌型重组酵母表达菌株和培养分泌型重组酵母表达菌株两步，在合适的培养基和培养条件下，分泌型重组酵母表达菌株将表达的海胆抗菌肽蛋白分泌到培养液中，抗菌肽的含量可以高达210mg/L，且对致病性鳗弧菌显示出较好的抑制活性；而通过该方法生产的抗菌肽酵母制剂不需要提纯，抑菌活性更强，可以直接在养殖水环境中使用，生产工艺简便，适于大规模生产，成本低。
【专利说明】一种海胆抗菌肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种海胆抗菌肽及其制备方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]近年来，抗生素、化学药物在养殖业中的大量使用，导致细菌耐药性不断出现，一些感染性疾病严重威胁到人类健康和畜牧业的发展。抗菌肽是一类具有抗菌活性，对真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及一些包膜病毒都表现出显著活性，但对正常的哺乳动物和昆虫细胞却无明显的毒副作用。
[0003]现有的海胆抗菌肽由于其在组织中含量低，很难利用分离提取的方法获得大量天然抗菌肽，而人工合成多肽的成本高，同样限制了抗菌肽的应用，通过基因工程方法进行微生物发酵生产抗菌肽，成本低廉，更容易在生产上推广，但现在分子克隆生产的海胆抗菌的表达量和活性都相对不高，因此提高重组表达的抗菌肽活性是解决抗菌肽大规模发酵生产应用的重要问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种海胆抗菌肽，抗菌肽活性更强，同时提供上述海胆抗菌肽的制备方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
[0006]一种海胆抗菌肽，其氨基酸序列为:
[0007]Met Trp Asn Pro Phe Arg Lys Leu Tyr Arg Lys Glu Cys Asn Asp`[0008]Val Tyr Ser Cys Asp Tyr Val Ser Gly Val Lys Tyr Cys Tyr Lys
[0009]Lys Asn Cys Cys His Arg Lys Phe Phe Gly Lys Tyr He Leu Lys
[0010]Ala Pro Glu Cys Tyr Val He Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys0
[0011]上述一种海胆抗菌肽的制备方法，其制备方法如下:
[0012]1.构建分泌型重组酵母表达菌株:根据海胆抗菌肽的氨基酸序列设计出海胆抗菌肽的基因序列，选用毕赤酵母的偏嗜密码子，通过SOE法合成海胆抗菌肽的基因片段，所述基因全长为ISObp ;将海胆抗菌肽的基因片段克隆入pPICZa -A质粒，从而得到分泌型重组酵母的表达载体PPICZ a -A-SK，将表达载体pPICZ a -A-SK通过电击法转入毕赤酵母中，构建得到分泌型重组酵母表达菌株；
[0013]2.培养分泌型重组酵母表达菌株:将构建得到的分泌型重组酵母表达菌株加入培养基中进行摇瓶培养，每24h补加培养基体积2%的甲醇，培养72h后，海胆抗菌肽即可获得高效表达，分泌到培养液中，培养时摇床转速为200-250r/min，培养温度为28 — 31°C。
[0014]上述一种海胆抗菌肽的制备方法，其中，所述的培养基各组分按质量百分比计的比例为:酵母粉0.2-3%、蛋白胨1-3%、葡萄糖1-2%、双蒸水92-97.8%，所述培养基的PH值为
6.0。
[0015]上述一种海胆抗菌肽的制备方法，其中，所述的海胆抗菌肽的基因序列为:[0016]atg tgg aat cca ttt aga aaa ttg tat aga aaa gaa tgt aat gat
[0017]gtt act tct tgt gat act gtt tct ggt gtt aaa act tgt act aaa
[0018]aaa aat tgt tgt cat aga aaa ttt ttt ggt aaa act att ttg aaa
[0019]get cca gaa tgt act gtt att tct aaa aaa aaa aaa aaa aaa tga
[0020]本发明的有益效果为:
[0021]1.在合适的培养基和培养条件下,分泌型重组酵母表达菌株将表达的海胆抗菌肽蛋白分泌到培养液中，抗菌肽的含量可以高达210mg/L，且对致病性鳗弧菌显示出较好的抑制活性；对抗菌肽进行抑菌效果的研究，并将其抑菌效果与优化前的海胆抗菌肽进行对t匕，其抑菌圈直径分别为1.1cm和1.3cm,比优化前增加了 0.2cm，抑菌效率增加18.18%，而通过该方法生产的抗菌肽酵母制剂不需要提纯，抑菌活性更强，可以直接在养殖水环境中使用，生产工艺简便，适于大规模生产，成本低。
[0022]2.分泌型重组酵母表达菌株将表达的海胆抗菌肽在原来的天然海胆抗菌肽的成熟肽段后面加上6个赖氨酸，增强多肽C端的正电荷数，使抗菌肽更容易牢固的吸附在细菌细胞膜的表面。
【具体实施方式】
[0023]以下通过具体实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0024]实例一
[0025]一种海胆抗菌肽的制备方法，其制备过程如下:`[0026]1.构建分泌型重组酵母表达菌株:根据海胆抗菌肽的氨基酸序列设计出海胆抗菌妝的基因序列，，所述的海胆抗菌妝的基因序列为:
[0027]atg tgg aat cca ttt aga aaa ttg tat aga aaa gaa tgt aat gat
[0028]gtt act tct tgt gat act gtt tct ggt gtt aaa act tgt act aaa
[0029]aaa aat tgt tgt cat aga aaa ttt ttt ggt aaa act att ttg aaa
[0030]get cca gaa tgt act gtt att tct aaa aaa aaa aaa aaa aaa tga，选用毕赤酵母的偏嗜密码子，通过SOE法合成海胆抗菌肽的基因片段，所述基因全长为ISObp ；将海胆抗菌肽的基因片段克隆入pPICZ a -A质粒，从而得到分泌型重组酵母的表达载体pPICZ a -A-SK，将表达载体pPICZ a -A-SK通过电击法转入毕赤酵母中，构建得到分泌型重组酵母表达菌株；
[0031]2.培养分泌型重组酵母表达菌株:将构建得到的分泌型重组酵母表达菌株加A BMMY培养基中进行摇瓶培养，每24h补加培养基体积2%的甲醇，培养时摇床转速为200-250r/min,培养温度为29°C，培养72h后，海胆抗菌肽即可获得高效表达，分泌到发酵液中。
[0032]通过以上方法制得的海胆抗菌肽，其氨基酸序列为:
[0033]Met Trp Asn Pro Phe Arg Lys Leu Tyr Arg Lys Glu Cys Asn Asp Val Tyr SerCys Asp Tyr Val Ser Gly Val Lys Tyr Cys Tyr Lys Lys Asn Cys Cys His Arg Lys PhePhe Gly Lys Tyr He Leu Lys Ala Pro Glu Cys Tyr Val He Ser Lys Lys Lys Lys LysLys
[0034]在合适的培养基和培养条件下,分泌型重组酵母表达菌株将表达的海胆抗菌肽蛋白分泌到培养液中，抗菌肽的含量可以高达210mg/L，且对致病性鳗弧菌显示出较好的抑制活性；对抗菌肽进行抑菌效果的研究，并将其抑菌效果与优化前的海胆抗菌肽进行对比，其抑菌圈直径分别为1.1cm和1.3cm,比优化前增加了 0.2cm，抑菌效率增加18.18%，而通过该方法生产的抗菌肽酵母制剂不需要提纯，抑菌活性更强，可以直接在养殖水环境中使用，生产工艺简便，适于大规模生产，成本低。分泌型重组酵母表达菌株将表达的海胆抗菌肽在原来的天然海胆抗菌肽的成熟肽段后面加上6个赖氨酸，增强多肽C端的正电荷数，使抗菌肽更容易牢固的吸附在细菌细胞膜的表面 [0035]这里本发明的描述和应用是说明性的，并非想将本发明的范围限制在上述实施例中，因此，本发明不受本实施例的限制，任何采用等效替换取得的技术方案均在本发明保护的范围内。
【权利要求】
1.一种海胆抗菌肽，其氨基酸序列为:
Met Trp Asn Pro Phe Arg Lys Leu Tyr Arg Lys Glu Cys Asn Asp Val Tyr Ser CysAsp Tyr Val Ser Gly Val Lys Tyr Cys Tyr Lys Lys Asn Cys Cys His Arg Lys Phe PheGly Lys Tyr He Leu Lys Ala Pro Glu Cys Tyr Val He Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys0
2.如权利要求1所示的一种海胆抗菌肽的制备方法，其制备方法如下: (1)构建分泌型重组酵母表达菌株:根据海胆抗菌肽的氨基酸序列设计出海胆抗菌肽的基因序列，选用毕赤酵母的偏嗜密码子，通过SOE法合成海胆抗菌肽的基因片段，所述基因全长为ISObp ;将海胆抗菌肽的基因片段克隆入pPICZ a -A质粒，从而得到分泌型重组酵母的表达载体pPICZa -A-SK，将表达载体pPICZa -A-SK通过电击法转入毕赤酵母中，构建得到分泌型重组酵母表达菌株； (2)培养分泌型重组酵母表达菌株:将构建得到的分泌型重组酵母表达菌株加入培养基中进行摇瓶培养，每24h补加培养基体积2%的甲醇，培养72h后，海胆抗菌肽即可获得高效表达，分泌到培养液中，培养时摇床转速为200-250r/min，培养温度为28 — 31°C。
3.如权利要求1或2所述的一种海胆抗菌肽的制备方法，其特征为，所述的培养基各组分按质量百分比计的比例为:酵母粉0.2-3%、蛋白胨1-3%、葡萄糖1-2%、双蒸水92-97.8%，所述培养基的PH值为6.0。
4.如权利要求1或2所述的一种海胆抗菌肽的制备方法，其特征为，所述的海胆抗菌肽的基因序列为:
atg tgg aat cca ttt aga aaa ttg tat aga aaa gaa tgt aat gat gtt act tct tgtgat act gtt tct ggt gtt aaa act tgt act aaa aaa aat tgt tgt cat aga aaa ttt tttggt aaa act att ttg aaa get cca gaa tgt act gtt att tct aaa aaa aaa aaa aaa aaatga。
【文档编号】C12N15/12GK103641900SQ201310518822
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】迟恒, 丁善忠 申请人:迟恒