一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的编码基因序列及氨基酸序列的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种编码海蚯蚓蛋白酶的编码基因序列及其氨基酸序列，属于医药生物工程领域。编码海蚯蚓蛋白酶的核苷酸序列全长795bp，编码的海蚯蚓蛋白酶氨基酸序列长264个氨基酸，包含19个氨基酸残基组成的信号肽。本发明的有益效果是：根据本发明的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，可以从海蚯蚓的消化道组织中克隆该酶的编码基因。该编码基因通过基因重组技术，可以在原核表达系统中获得表达。重组海蚯蚓蛋白酶具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，可作为潜在的新型基因工程抗肿瘤药物，进一步开发。
【专利说明】一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的编码基因序列及氨基酸序列
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海蚯蚓蛋白酶，具体地说是一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的编码基因序列及其氨基酸序列，属于医药生物工程领域。
【背景技术】
[0002]蛋白酶是一类分布于动物、植物和微生物中能够特异水解肽键的水解酶，其中部分为丝氨酸内切蛋白酶，这些蛋白酶在生物体发挥不同的生理作用，如凝集、纤溶、消化、免疫、调节胚胎发育等。近年来的实验及临床研究表明，蛋白酶在抗肿瘤方面也起到重要作用，有望成为新型抗肿瘤药物。
[0003]海洋生物海艇蝴(Arenicola cristata)属于环节动物门多毛纲小头虫目沙纟屬科，形似蚯蚓，生活于潮间带多沙地带，营管居生活，故名海蚯蚓，主要分布于我国渤海、黄海沿岸，繁殖力强，资源丰富。目前对海蚯蚓的研究方向主要集中在其形态结构、生理代谢、营养成分分析等方面。关于海蚯蚓的开发应用尚未见报道，特别是未见它在抗肿瘤方面应用的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案:
以来自海蚯蚓消化道上皮细胞的mRNA为模板，采用同源序列克隆法，通过3' RACE、RACE技术，获得了一种编码具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。将该序列表达活性肽的部分经PCR扩增，克隆到表达载体pET-2Ia上，在原核表达系统大肠杆菌E.coliBL21中诱导表达，生产具有抗肿瘤活性的重组海蚯蚓蛋白酶。重组海蚯蚓蛋白酶具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，可作为新型的基因工程药物。
[0006]海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的克隆:
(O设计引物:根据丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶催化活性中心Ser附近所含的高度保守序列GDSGGP设计引物。
[0007](2)目的基因cDNA 3'端序列扩增及测序:由步骤(1)得到引物，和来自海蚯蚓消化道组织的总cDNA为模板，通过3' RACE CcDNASi末端快速扩增技术)扩增海蚯蚓蛋白酶的基因cDNA 3'端序列。PCR产物胶回收后分别连TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5 α，测序。
[0008](3)目的基因cDNA 5'端序列扩增及测序:根据获得的目的基因cDNA 3'端序列设计两对特异性引物，以来自海蚯蚓消化道组织的总cDNA为模板，采用5' RACECcDNA 5'末端快速扩增技术)，进行套式PCR，扩增海蚯蚓蛋白酶基因cDNA 5'端序列。PCR产物胶回收后分别连TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5a，测序。[0009](4)拼接:应用contigexpress软件对步骤(2)和(3)得到的目的基因cDNA端和5'端序列进行拼接，获得本发明的海蚯蚓蛋白编码基因的DNA (mRNA)序列。
[0010](5)根据上述步骤(4)得到的DNA (mRNA)序列，使用DNAMAN软件，获得该海蚯蚓蛋白酶cDNA编码的氨基酸序列。
[0011]一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的编码基因序列，该序列如下:
IGCCACGCGTC GACTAGTACG GGGGGGGGGG GGGAGAGTGT AACCATGTTG TTTGCTGTGG
61 TCATCATCAG CGCCCTCCTG GTGGAGAGCC AGGCGCAGTT CCAGCTAGGA CGGCACCGTA 121 TTATCGGTGG AGAGGATGTG GACCCTCCAG GGAAGTACCC GTGGCAGGTG TCACTGACTC 181 TGCTCGGCCA GCACAACTGC GGTGGCTCCC TCATCACCCC TCAACATGTT CTGACGGCTG 241 CACACTGCGT GGAGGGATTC GGCGCACTGA CACGGATTCG AGTGGGACAA CATGACCGCT 301 CTGGGAATAT GGGCGACCCA AGGATACACG ATCCGGACAG CTGGGTCATC CATGAAGAGT 361 GGGGAGGCAT CAACTCAGGC GCTGATGGGT ATCCCAACGA CATCGCCATC ATCAAGCTGT 421 CAGAGCCGGT CGACATGACT AATGAGTATG TAGACATAAT CCCCCTGGCC GAGGGTGCAG 481 AGGAGGACTA TGAAGGAAGG ACCTGTGTCA TCACAGGCTG GGGGTTGACT GAAGACCTGG 541 TGATCCCTGA CATCCTGCAG GAGGCACCCG TGCAGGTCCA CACTCAAGAA TTCTGTCGTG 601 AATGGTGGGA GGGCGATGCT GGCGGGACTG TGCTCGATTC TCACGTGTGT GTCAGTGAGC 661 CTGGTGAGCG AGGCGCCTGC AGTGGAGACA GCGGTGGCCC CCTCATGTGC GAGACTGAGA 721 ATGGCTGGGA ATTACTGGGC ATCACCTCCT GGGGTCACTC CCTGTGTAAT ACTAATTACC 781 CCTCTGTCTA CGGCAGGGTG CCTTACTTCC GACAGTGGGT GGAAGACAAC CTCAACTGAC 841 ATCTTATTAT GACACTCTTT ACAAAATAAA CCAAAAACCA AAAAAAAAAA AAAAAAgo [0012]
序列中划线加粗标示的ATG为起始密码子，划线加粗标示的TAA为终止密码子。
[0013]根据海蚯蚓蛋白的原始cDNA序列，得到一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的氨基酸序列。该序列如下:
IMLFAVVIISA LLVESQAQFQ LGRHRIIGGE DVDPPGKYPff QVSLTLLGQH NCGGSLITPQ
61HVLTAAHCVE GFGALTRIRV GQHDRSGNMG DPRIHDPDSff VIHEEffGGIN SGADGYPNDI
121 AIIKLSEPVD MTNEYVDIIP LAEGAEEDYE GRTCVITGffG LTEDLVIPDI LQEAPVQVHT
181 QEFCREffffEG DAGGTVLDSH VCVSEPGERG ACS⑶SGGPL MCETENGffEL LGITSffGHSL
241 CNTNYPSVYG RVPYFRQffVE DNLN。
[0014]
划线标示部分(MLFAVV11SALLVESQAQF)为该蛋白酶的信号肽序列。划线⑶SGGP为丝氨酸蛋白酶家族的高度保守序列。
[0015]本发明的有益效果是:根据本发明的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，可以从海蚯蚓消化道组织总cDNA中克隆该酶的编码基因。通过基因重组技术，使该酶的编码基因在原核表达系统大肠杆菌中表达。重组海蚯蚓蛋白酶能够抑制肿瘤细胞增殖，可作为潜在的新型抗肿瘤药物，进一步开发。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为海蚯蚓蛋白酶全长cDNA序列克隆的实验步骤流程图。[0017]图2为丝氨酸蛋白酶家族的高度保守序列比对一引物设计区。
[0018]图3为海蚯蚓蛋白酶重组蛋白表达纯化及活性测定的实验步骤流程图。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
海蚯蚓蛋白酶全长cDNA的克隆及序列测定。
[0020]1.设计引物序列:3R为含接头引物序列的反转录引物；3R1为:T端接头引物；3F1是根据丝氨酸蛋白酶家族高度保守序列⑶SGGP编码区(如图2:1，2，3，4分别为fetida fibrinolytic protease O, GenBank: DQ836917.1 -,Eisenia fetida fibrinolyticprotease I,GenBank: DQ418454.1 -,Eisenia fetida fibrinolytic protease 2,GenBank:DQ836918.1 -,Urechis unicinctus fibrinolytic enzyme, GenBank: HM623463.1)设计的简并引物。5R为oligodT反转录引物。5R1、5R2是根据3' RACE获得的3'端序列设计的特异性引物；5F1为含51端接头引物序列的引物；5F2为5'端接头引物。
【权利要求】
1.一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列，其特征在于，此序列由897个碱基对组成，此核苷酸序列为: IGCCACGCGTC GACTAGTACG GGGGGGGGGG GGGAGAGTGT AACCATGTTG TTTGCTGTGG 61 TCATCATCAG CGCCCTCCTG GTGGAGAGCC AGGCGCAGTT CCAGCTAGGA CGGCACCGTA 121 TTATCGGTGG AGAGGATGTG GACCCTCCAG GGAAGTACCC GTGGCAGGTG TCACTGACTC 181 TGCTCGGCCA GCACAACTGC GGTGGCTCCC TCATCACCCC TCAACATGTT CTGACGGCTG 241 CACACTGCGT GGAGGGATTC GGCGCACTGA CACGGATTCG AGTGGGACAA CATGACCGCT 301 CTGGGAATAT GGGCGACCCA AGGATACACG ATCCGGACAG CTGGGTCATC CATGAAGAGT 361 GGGGAGGCAT CAACTCAGGC GCTGATGGGT ATCCCAACGA CATCGCCATC ATCAAGCTGT 421 CAGAGCCGGT CGACATGACT AATGAGTATG TAGACATAAT CCCCCTGGCC GAGGGTGCAG 481 AGGAGGACTA TGAAGGAAGG ACCTGTGTCA TCACAGGCTG GGGGTTGACT GAAGACCTGG 541 TGATCCCTGA CATCCTGCAG GAGGCACCCG TGCAGGTCCA CACTCAAGAA TTCTGTCGTG 601 AATGGTGGGA GGGCGATGCT GGCGGGACTG TGCTCGATTC TCACGTGTGT GTCAGTGAGC 661 CTGGTGAGCG AGGCGCCTGC AGTGGAGACA GCGGTGGCCC CCTCATGTGC GAGACTGAGA 721 ATGGCTGGGA ATTACTGGGC ATCACCTCCT GGGGTCACTC CCTGTGTAAT ACTAATTACC 781 CCTCTGTCTA CGGCAGGGTG CCTTACTTCC GACAGTGGGT GGAAGACAAC CTCAACTGAC 841 ATCTTATTAT GACACTCTTT ACAAAATAAA CCAAAAACCA AAAAAAAAAA AAAAAAgo
2.根据权利要求1所述的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列，其表达的蛋白质为海蚯蚓蛋白酶，其特征在于，海蚯蚓蛋白酶由264个氨基酸组成，其氨基酸序列为: IMLFAVVIISA LLVESQAQFQ LGRHRIIGGE DVDPPGKYPff QVSLTLLGQH NCGGSLITPQ
·61HVLTAAHCVE GFGALTRIRV GQHDRSGNMG DPRIHDPDSff VIHEEffGGIN SGADGYPNDI
·121 AIIKLSEPVD MTNEYVDIIP LAEGAEEDYE GRTCVITGffG LTEDLVIPDI LQEAPVQVHT
·181 QEFCREWffEG DA·GGTVLDSH VCVSEPGERG ACS⑶SGGPL MCETENGffEL LGITSffGHSL · 241 CNTNYPSVYG RVPYFRQffVE DNLN。
【文档编号】C12N15/57GK103525846SQ201310523204
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】赵春玲 申请人:潍坊医学院