一种石油降解菌群的固定化方法
【专利摘要】本发明公开一种石油降解菌群的固定化方法，属于微生物固定领域。具体的，包括以下步骤：（1）石油降解菌群液体发酵；（2）石油降解菌群在硅藻土/活性炭复合载体上的固定化。本发明所提出的石油降解菌群固定化方法具有成本低，利于大规模应用和除油效率高的优点，固定化的降解菌群协同作用强、降解能力大，适用于各类含油固废物的生物降解。
【专利说明】-种石油降解菌群的固定化方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种石油降解菌群的固定化方法，属于微生物固定领域。
【背景技术】：
[0002] 近年来，随着世界各国对石油及其制品日渐增长的需求，油气资源勘探、开发钻井 过程中产生的大量含油固废物，因其含有石油烃类、重金属和有机物等污染物，已被列入国 家危险废弃物，若不经处理就直接排放，将会对生态环境造成严重危害。因此，含油固废污 染已经成为人们必须面对的重大环境问题。在含油固废物处理技术中，生物处理技术因具 有安全、经济、高效、无二次污染等优点，已成为现场含油固废物安全处理和处置的重要手 段，特别是对机械装置无法清除的孔隙油和薄油层，同时又限制使用化学药剂时，运用生物 处理技术可显出更大的优越性。
[0003] 石油是一种含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳烃和脂环烃）及少量其他有机物 (硫化物、氮化物和环烷酸类）的复杂混合物。一个典型的石油样品含有不同的烃类化合物 可达200?300种。不同的微生物对石油组分具有不同的降解能力，单一的石油降解菌很 难将石油从环境中彻底去除，因此，石油成分的复杂性决定了其降解需要多种微生物的共 同参与。石油降解菌群的构建可充分利用各降解菌之间共生和协同作用，实现石油组分的 同步降解，大大提高石油污染物的降解速率和程度，有效缩短石油污染物的降解周期。
[0004] 微生物固定化技术是通过采用物理或化学的方法将游离微生物固定于限定空间 区域内，保留其固有活性，且能够被重复和连续使用的现代生物工程工艺。关于石油降解单 菌的固定化技术已有报道，200910255830. 8公开了一种以芦苇地表根须为载体的石油降解 菌固定化方法；201210006059. 2公开了石油降解菌固定化法及其应用，这两种方法的固定 化单菌，由于单菌降解菌对石油烃降解种类的局限性，不能实现石油组分的同步降解，致使 降解周期较长。
【发明内容】
：
[0005] 本发明主要目的是为了克服现有的生物法处理含油固废物速率不高、周期长的现 有缺陷，提出一种石油降解菌群的固定化方法。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -种石油降解菌群的固定化方法，包括以下步骤：
[0008] (1)石油降解菌群液体发酵；
[0009] (2)石油降解菌群在硅藻土 /活性炭复合载体上的固定化。
[0010] 具体地，所述石油降解菌群包括三种单菌，分别为假单胞菌Pseudomonus sp.、芽 孢杆菌Bacillus sp.和微球菌Micrococcus sp.，按照质量比例1 :1 :1混合。
[0011] 具体地，步骤（1)所述液体发酵包括以下过程：向装有高温灭菌的发酵培养基的 发酵罐中，按照5-10%的接种量接种石油降解菌群液体种子，于30-37°C，100_120r/min通 空气培养12-60h ;按5-10%的接种量转入另一装有新鲜发酵培养基的发酵罐中进行转接培 养，当转接次数大于5后，即得到石油降解菌群发酵液。
[0012] 具体地，所述石油降解菌群液体种子制备包括以下过程：分别取所述单菌，等质量 混合均匀，按照5-10%的总接种量接种于发酵培养基中，于30-37°C，100-120r/min，通空气 培养12-36h至培养基中石油降解菌群总数量为10 8CFU/mL以上，得到石油降解菌群液体种 子。
[0013] 具体地，所述发酵培养基包含以下重量分数的组分：8-10%蛋白胨，3-5%牛肉浸 膏，8-10%NaCl，所述培养基的pH为中性，液体发酵培养基需灭菌使用。
[0014] 具体地，步骤（2)所述石油降解菌群固定化包括以下过程：将步骤（1)中的石油降 解菌群发酵液同灭菌后的硅藻土 /活性炭复合载体等体积混合，得到菌体-载体混合液，然 后将混合液滴入CaCl2溶液中，连续搅拌12-24h，室温吹干、备用。
[0015] 具体地，所述硅藻土 /活性炭复合载体，使用过程，活性炭和硅藻土混合的质量比 例为1:1。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] (1)使用的固定化材料为活性炭和硅藻土，来源广泛，对微生物菌群的固定化作用 效果好、寿命长、成本低，有利于商品化、产业化。
[0018] (2)发明所述的方法能够将几种降解菌同时固定化于载体上，协同作用强，可实现 石油不同组分的同步降解，有效提高石油降解速率，适用于各类含油固废物的生物降解。
【具体实施方式】：
[0019] 实施例1 :
[0020] (1)石油降解菌群液体发酵
[0021] 降解菌群液体种子制备：分别取假单胞菌、芽孢杆菌和微球菌等质量混合均匀，按 照5%的总接种量接种于500mL锥形三角摇瓶中，每瓶发酵培养基的装液量为300mL，30°C， 100r/min通空气培养12h，至培养基中石油降解菌群总数量为10 8CFU/mL以上，得到石油降 解菌群液体种子。
[0022] 其中，发酵培养基包含以下重量分数的组分：8%蛋白胨，3%牛肉浸膏，8%NaCl，所 述培养基的pH为中性，灭菌使用。
[0023] 菌群液体发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5%的接种量接种 降解菌群液体种子，30°C，100r/min通空气培养12h ;按5%的接种量转入另一装有新鲜发酵 培养基的发酵罐中进行转接培养，当转接6次后，将石油降解菌群发酵液进行固定化。
[0024] (2)石油降解菌群在硅藻土 /活性炭复合载体上的固定化：
[0025] 将步骤（1)得到的石油降解菌群发酵液同灭菌后的硅藻土 /活性炭固定化载体等 体积混合，得到菌体-载体混合液，将混合液轻轻滴入CaCl2溶液中，连续搅拌12h后，室温 吹干、备用。
[0026] 其中，石硅藻土 /活性炭复合载体，使用过程，活性炭和硅藻土混合的质量比例为 1:1。
[0027] 实施例2
[0028] 降解菌群液体种子制备：分别取假单胞菌、芽孢杆菌和微球菌等质量混合均匀，按 照10%的总接种量接种于500mL锥形三角摇瓶中，每瓶发酵培养基的装液量为300mL，37°C， 120r/min通空气培养36h，至培养基中石油降解菌群总数量为108CFU/mL以上，得到石油降 解菌群液体种子。
[0029] 其中，发酵培养基包含以下重量分数的组分：10%蛋白胨，5%牛肉浸膏，10%NaCl， 所述培养基的pH为中性，灭菌使用。
[0030] 菌群液体发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照10%的接种量接 种降解菌群液体种子，37°C，120r/min通空气培养48h ;按10%的接种量转入另一装有新鲜 发酵培养基的发酵罐中进行转接培养，当转接6次后，将石油降解菌群发酵液进行固定化。
[0031] (2)石油降解菌群在硅藻土 /活性炭复合载体上的固定化：
[0032] 将步骤（1)得到的石油降解菌群发酵液同灭菌后的硅藻土 /活性炭固定化载体等 体积混合，得到菌体-载体混合液，将混合液轻轻滴入CaCl2溶液中，连续搅拌24h后，室温 吹干、备用。
[0033] 其中，石硅藻土 /活性炭复合载体，使用过程，活性炭和硅藻土混合的质量比例为 1:1。
[0034] 实施例3
[0035] 降解菌群液体种子制备：分别取假单胞菌、芽孢杆菌和微球菌等质量混合均匀，按 照8%的总接种量接种于500mL锥形三角摇瓶中，每瓶发酵培养基的装液量为300mL，35°C， llOr/min通空气培养24h，至培养基中石油降解菌群总数量为108CFU/mL以上，得到石油降 解菌群液体种子。
[0036] 其中，液体发酵培养基包含以下重量分数的组分：9%蛋白胨，4%牛肉浸膏， 9%NaCl，所述培养基的pH为中性，灭菌使用。
[0037] 菌群液体发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照8%的接种量接种 降解菌群液体种子，35°C，120r/min通空气培养24h ;按8%的接种量转入另一装有新鲜发酵 培养基的发酵罐中进行转接培养，当转接6次后，将石油降解菌群发酵液进行固定化。
[0038] (2)石油降解菌群在硅藻土 /活性炭复合载体上的固定化：
[0039] 将步骤（1)得到的石油降解菌群发酵液同灭菌后的硅藻土 /活性炭固定化载体等 体积混合，得到菌体-载体混合液，将混合液轻轻滴入CaCl2溶液中，连续搅拌24h后，室温 吹干、备用。
[0040] 其中，石硅藻土 /活性炭复合载体，使用过程，活性炭和硅藻土混合的质量比例为 1:1。
[0041] 固定化降解菌群在油基钻屑中石油烃降解中的应用效果分析
[0042] 应用实例1 :
[0043] 石油降解菌群：由实施例1固定化
[0044] 油基钻屑：初始油含量30000mg/kg
[0045] 在应用中，首先在油基钻屑中添加营养盐，使油基钻屑中的C:N:P=100 :10:1 (质 量比)，同时调整固废物上层浸出液pH为7. 0-8. 0,将固定化降解菌群按照重量比为0. 05% 的施加量加入油基钻屑中，随后依次加入电子受体，表面活性剂，膨松剂，并含水量控制在 20%?30%，混合均匀。每7d翻耕一次，15天后，测定油基钻屑中石油烃含量，石油烃含量由 30000mg/kg 降至 10350mg/kg，油去除率达 65. 6%。
[0046] 应用实例2:
[0047] 石油降解菌群：由实施例2固定化
[0048] 油基钻屑：初始油含量85000mg/kg
[0049] 在应用中，首先在油基钻屑中添加营养盐，使油基钻屑中的C:N:P=100 :10:1 (质 量比)，同时调整固废物上层浸出液pH为7. 0-8. 0,将固定化降解菌群按照重量比为0. 05% 的施加量加入油基钻屑中，随后依次加入电子受体，表面活性剂，膨松剂，并含水量控制在 20%?30%，混合均匀。每7d翻耕一次，30天后，测定油基钻屑中石油烃含量，石油烃含量由 85000mg/kg 降至 20100mg/kg，油去除率达 76. 4%。
[0050] 应用实例结果表明，固定化菌群能够对油基钻屑中石油烃污染物进行高效降解， 降解30天后，油含量为2%，达到HJ607-2011《废矿物油回收利用污染控制技术规范》中钻 屑安全排放标准。
【权利要求】
1. 一种石油降解菌群的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 石油降解菌群液体发酵； (2) 石油降解菌群在硅藻土 /活性炭复合载体上的固定化； 其中，步骤（1)所述石油降解菌群包括假单胞菌Pseudomonus sp.、芽孢杆菌Bacillus sp.和微球菌 Micrococcus sp.。
2. 根据权利要求1所述的石油降解菌群的固定化方法，其特征在于：假单胞菌 Pseudomonus sp.、芽抱杆菌Bacillus sp.和微球菌Micrococcus sp.，按照质量比例 1 :1 : 1混合。
3. 根据权利要求1或2所述的石油降解菌群的固定化方法，其特征在于：所述石油 降解菌群液体发酵包括以下过程：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5-10% 的接种量接种石油降解菌群液体种子，于30-37°C，100_120r/min通空气培养12-60h ;按 5-10%的接种量转入另一装有新鲜发酵培养基的发酵罐中进行转接培养，当转接次数大于 5后，即得到石油降解菌群发酵液。
4. 根据权利要求3所述的石油降解菌群的固定化方法，其特征在于，所述石油降解菌 群液体种子制备包括以下过程：取石油降解菌群，按照5-10%的总接种量接种于发酵培养 基中，于30-37°C，100_120r/min，通空气培养12-36h至培养基中石油降解菌群总数量为 10 8CFU/mL以上，得到石油降解菌群液体种子。
5. 根据权利要求1或2所述的石油降解菌群的固定化方法，其特征在于，所述发酵培 养基包含以下重量分数的组分：8-10%蛋白胨，3-5%牛肉浸膏，8-10%NaCl，所述培养基的pH 为中性。
6. 根据权利要求1或2所述的石油降解菌群的固定化方法，其特征在于，所述石油降解 菌群固定化包括以下过程：将石油降解菌群发酵液同灭菌后的硅藻土 /活性炭复合载体等 体积混合，得到菌体-载体混合液，然后将混合液滴入CaCl2溶液中，连续搅拌12-24h，室温 吹干、备用。
7. 根据权利要求1或2所述的石油降解菌群的固定化方法，其特征在于，所述石硅藻土 /活性炭复合载体，使用过程，活性炭和硅藻土混合的质量比例为1:1。
【文档编号】C12R1/38GK104140962SQ201310523187
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】单海霞, 何焕杰, 刘明国, 王中华, 马金, 刘晓宇, 位华 申请人:中国石油化工集团公司, 中石化中原石油工程有限公司钻井工程技术研究院