一种中国被毛孢的长期保藏方法
【专利摘要】本发明公开了一种中国被毛孢的长期保藏方法，该方法是从冬虫夏草分离得到菌丝体，然后将其在PDA斜面培养，再将斜面培养好的菌丝体转接至PDA平板，18℃培养30天后，用解剖刀将其切成带菌丝体的琼脂块，将琼脂块移至无菌的10-20％甘油的冷冻管中，用封口膜将冷冻管盖封好，置于-70℃冰箱内保藏。本发明降低了菌种因转接次数多而造成菌种的变异和污染率的问题。
【专利说明】一种中国被毛孢的长期保藏方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，尤其涉及的是一种中国被毛孢的长期保藏方法。
【背景技术】
[0002]冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)是名贵中药和珍稀滋补品，是由其无性型中国被毛孢(Hirsutella sinensis)侵染蝠蛾属(Hepialus spp.)幼虫形成的菌虫复合体，分布在我国青海、西藏、四川、云南和甘肃等地的海拨3500~5000m高寒灌丛草甸。
[0003]由于冬虫夏草菌具有完全形(也称为有性世代)和不完全形(也称无性世代)两个完全不相同的形态，10年前菌种鉴定方面手段落后，分子鉴定还未开展，有很长一段时期大都仅凭分离菌丝形态误将蝙蝠蛾拟青霉当作冬虫夏草菌种来培养，走了不少弯路。在冬虫夏草无性型的确定问题上，学术界一直争论不休。目前，与冬虫夏草有关的无性型菌种已报道有22个学名，涉及13个属之多，而且从NCBI数据库检索得到的多个已注册为“冬虫夏草”的序列彼此之间的差异十分显著。
[0004]菌种保藏是运用物理、生物手段让菌种处于完全休眠状态，使在长时间储存后仍能保持菌种原有生物特性和生命力的菌种储存措施。冬虫夏草菌种的分离比较困难，而传统的斜面4保藏，只能短期出个月)保藏，其转种频繁，这就造成了工作量较大，菌种易变异等问题。由于频繁转种，污染的几率也就大。因此菌种的长期保藏也是冬虫夏草研究及开发亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在保藏冬虫夏草菌中存在的问题，提供了一种中国被毛孢的长期保藏方法。`
[0006]本发明的技术方案如下:
[0007]—种中国被毛孢的长期保藏方法，是从冬虫夏草分离得到菌丝体，然后将其在PDA斜面18°C培养30天，将斜面培养好的菌丝体转接至PDA平板，18°C培养30天后，用解剖刀将其切成带菌丝体的琼脂块，将琼脂块移至无菌的甘油冷冻管中，用封口膜将冷冻管盖封好，置于冰箱内保藏。
[0008]所述的长期保藏方法，其带菌丝体的琼脂块的大小为5*5mm。
[0009]所述的长期保藏方法，其甘油的体积浓度为10-20%。
[0010]所述的长期保藏方法，其冰箱内保藏温度为-70°C。
[0011]所述的长期保藏方法，其保藏时间为4年以上。
[0012]本发明降低了菌种因转接次数多而造成菌种的变异和污染率的问题。
【具体实施方式】
[0013]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0014]1、材料与方法[0015]1.1供试菌种
[0016]从云南省中甸白马雪山虫草分离得到菌丝体，经ITS序列鉴定为中国被毛孢。
[0017]1.2菌丝体的分离方法:新鲜的冬虫夏草，取子座部分，用消毒酒精进行表面消毒，用镊子取l*2mm大小的组织块放在PDA平板上18°C培养，每天在解剖镜下观察生长情况。将组织块萌发菌丝、生长较慢、致密的菌丝体移至PDA斜面18°C继续培养，期间观察有无污染。取无污染的斜面菌丝体，提取DNA，ITS引物PCR扩增、测序，通过序列比对鉴定是否是中国被毛孢。
[0018]1.3PDA试管斜面菌种的培养方法:马铃薯洗净去皮，称取300g，将马铃薯切成小块，加水煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可，用四层纱布过滤，补足水分至1000毫升。再加葡萄糖20克，琼脂15~20克，ph自然。再加热使琼脂融化，分装试管，加塞、包扎，(121 °C )灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
[0019]取中国被毛孢菌丝体置于上述试管斜面，18°C培养30天左右。
[0020]1.4斜面低温保藏法
[0021]将培养好的PDA试管斜面菌种，放置于4°C冰箱内保存。
[0022]1.5石蜡油保藏法
[0023]将培养好的PDA试管斜面菌种，加5ml无菌石蜡油，将试管置于4°C冰箱内保存。
[0024]1.6琼脂块甘油 保藏法
[0025]将斜面培养好的菌种转接至PDA平板，18°C培养30天后，用解剖刀切成5*5mm大小的带菌丝体的琼脂块，将琼脂块移至无菌的体积浓度为10-20%甘油的冷冻管中，用封口膜将冷冻管盖封好，置于-70°C冰箱内保存。
[0026]2、实验结果
[0027]表1是三种菌种保藏方法对保藏中国被毛孢菌种的比较。从表1可以看出，由于在低温条件下，斜面半年以上就已经失去大部分水分而干掉。斜面低温保藏法保藏的中国被毛孢，比较适合短期3~6个月保藏。石蜡油保藏法保藏的中国被毛孢，可以保藏2年以上，但菌种活化时间较长，菌丝体长势较差。琼脂块甘油保藏法保藏的中国被毛孢最好，菌种活化时间较短，菌丝体长势好，目前已保藏了四年多。因此，琼脂块甘油保藏法适合长时间保藏中国被毛孢菌种。
[0028]表1三种菌种保藏方法对保藏中国被毛孢菌种的比较
[0029]
【权利要求】
1.一种中国被毛孢的长期保藏方法，其特征在于，从冬虫夏草分离得到菌丝体，然后将其在PDA斜面18°C培养30天，将斜面培养好的菌丝体转接至PDA平板，18°C培养30天后，用解剖刀将其切成带菌丝体的琼脂块，将琼脂块移至无菌的甘油冷冻管中，用封口膜将冷冻管盖封好，置于冰箱内保藏。
2.根据权利要求1所述的长期保藏方法，其特征是，带菌丝体的琼脂块的大小为5氺5mm。
3.根据权利要求1所述的长期保藏方法，其特征是，甘油的体积浓度为10-20%。
4.根据权利要求1所述的长期保藏方法，其特征是，冰箱内保藏温度为-70°C。
5.根据权利要求1 所述的长期保藏方法，其特征是，保藏时间为4年以上。
【文档编号】C12N1/04GK103881912SQ201310706395
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】沙涛, 普春龙, 张亚平, 田国樑 申请人:云南大学