一种提高厌氧发酵目标产物转化率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高厌氧发酵目标产物转化率的方法，它包括在培养基中培养工业微生物，通过厌氧发酵合成目标产物，再从所述的培养基中收集目标产物的步骤，通过在无转氢酶基因功能的工业微生物中异源表达转氢酶基因，提高还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸产率，从而提高目标产物的转化率。通过本发明方法可以调节发酵体系内辅酶平衡水平，将胞内过剩的NADPH转化为NADH，用以提供代谢途径中所需的还原力，避免为提供NADH而消耗的葡萄糖，从而有更多的葡萄糖用于目的物质的厌氧生产，提高厌氧阶段目的物质的转化率，能够解决现有技术存在的问题，该发明适合于工业微生物厌氧发酵提高目的物质的转化率的生产。
【专利说明】一种提高厌氧发酵目标产物转化率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】，具体是微生物厌氧发酵法生产目的物质。
【背景技术】
[0002]有机酸和醇类的发酵是传统工业生产的典型例证，被广泛应用于食品，药品，染料等众多工业领域，但其真正的潜力是作为大规模工业原料的应用。社会对有机酸和醇类的需求正逐年增加，但是传统的以石油产品作为原料生产有机酸和醇类的方法具有污染重，成本高等缺点，同时也不符合国家提出的构建和谐社会的理念。为了能经济、环保、可持续发展，有机酸和醇类的生产方式得到很大的改善。目前，利用微生物发酵生产目的产物的策略深入人心。
[0003]产有机酸和醇类的工业微生物菌种很多，具有代表性的是大肠杆菌(Escherichia coli),产丁二酸放线菌(Actinobacillus succinogenes),谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),酿酒酵母,烧嗜热厌氧杆菌等。随着生物技术、基因工程技术、代谢工程技术的迅猛发展，采用分子生物学手段，加强微生物代谢有机酸和醇类途径中的基因的表达，削弱副产物代谢途径，从而增加目标产物的产量。从发酵调控角度，可以通过优化发酵条件，使微生物获得最优的生产环境。除了丁二酸、乳酸、乙醇等一些大众化学品之外，微生物生产的物质种类很多，例如一些抗生素和维生素等，这些物质在代谢途径中可以作为合成目标代谢物质的前体，参与代谢流。
[0004]在利用上述各种工业微生物生产有机酸和醇类时，每种物质都是由细胞内代谢途径合成的。例如在谷氨酸棒 杆菌厌氧代谢产目的物质有机酸和醇类时，参与代谢流的有糖，碳酸盐等，但其中重要的是一种辅酶一NADH，即还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。NADH对微生物代谢反应中相应酶作用是必须的，例如在谷氨酸棒杆菌代谢生产丁二酸的代谢途径中，生成Imol的丁二酸需要消耗2mol的NADH。
[0005]微生物生产目的产物过程中，存在NADPH过剩的问题，这样在一定程度上不利于目的产物的积累。大肠杆菌报道中，其中与NADH产生有关的酶之一是转氢酶(Transhydrogenase)，转氢酶是直接催化辅酶NDAH和NADPH互相转换的酶，能够调节辅酶水平。Anderlund等人将大肠杆菌中的转氢酶基因导入不含有转氢酶基因的酿酒酵母中，但是反应中氢离子的转移方向与大肠杆菌中不同，是从NADPH转移到NAD+。Nissen等将来源于Azotobacter vinelandii的可溶性转氢酶转入酿酒酵母，由于缺乏NADPH产生大量α—酮戊二酸。然而在重组酿酒酵母木糖代谢过程中，由于XR和XDH的作用，导致细胞质中NADH和NADP+，需再生NADPH和NAD+，才能保证代谢顺利进行，但是引入外源转氢酶后，辅酶产生方向与所需方向相反，所以未能起到提高重组酵母利用木糖生产酒精的能力。上述现有的技术表明NADH作为反应主要的还原力，当NADPH不足时，并不会使辅酶产生的方向与所需方向一致，这样的报道给本发明提供进一步依据，当胞内NADPH过剩时，异源表达转氢酶基因，能够使辅酶产生方向与所需方向一致，提供足够的NADH用于生产目的物质，同时减少用于合成所需的NADH而消耗的葡萄糖，从而提高目的产物的产率。
【发明内容】
[0006]本发明的所要解决的技术问题是解决微生物厌氧发酵生产体系内辅酶不平衡，导致目的产物转化率不高的问题，从而提供一种提高厌氧发酵目标产物转化率的方法。
[0007]对于在微生物体内进行的丁二酸、木糖醇、乳酸等很多物质的合成，需要很多还原反应的参与。NADH作为这些物质合成的主要还原力。例如，在丁二酸的合成途径中，苹果酸脱氢酶，富马酸合成酶需要NADH作为辅酶；在乳酸的合成途径中，乳酸脱氢酶需要NADH作为辅酶。因此，在微生物厌氧合成丁二酸、乳酸、乙酸等物质时，NADH还原力的供给是必不可少的。
[0008]NADH在生物体内的糖酵解、柠檬酸循环和光合作用等过程中，起着电子传递的重要作用。在生物合成反应中，约80%的反应需要腺嘌呤二核苷酸(NAD，NADH)作为辅酶，10%的反应以腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP，NADPH)为辅酶。
[0009]在谷氨酸棒杆菌发酵生产丁二酸的过程中，产生不能被利用的成分NADPH，胞内过剩的NADPH造成微生物生产体系内辅酶不平衡，并且谷氨酸棒杆菌微生物内本身不含有能实现NADPH高效转化为NADH的功能基因，从而造成目的产物转化率不高，副产物积累的问题日趋显现。
[0010]为此，本发明提出了一种假设，在利用谷氨酸棒杆菌等微生物厌氧发酵生产丁二酸等物质时，不能被细胞利用的物质会不可避免地蓄积起来，造成胞内NADPH浓度增加(假设I)。
[0011]
【发明者】提出一种假设，在利用谷氨酸棒杆菌等微生物厌氧发酵生产丁二酸等物质时，细胞内很多氧化还原反应需要大量的辅酶NADH参与，为提供足够的NADH，就会不可避免地消耗葡萄糖，从而目的物质的产率下降(假设2)。
[0012]基于上面两种假设，如果能够将谷氨酸棒杆菌等微生物体内过多的NADPH转化为NADH，这样能够减少用于NADH合成所需要的葡萄糖，同时有足够的NADH用于丁二酸等目的物质的合成，这样微生物能以更高的转化率厌氧生产目的物质。
[0013]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0014]一种提高厌氧发酵目标产物转化率的方`法，它包括在培养基中培养工业微生物，通过厌氧发酵合成目标产物，再从所述的培养基中收集目标产物的步骤，通过在无转氢酶基因功能的工业微生物中异源表达转氢酶基因，提高还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸产率，从而提高目标产物的转化率。
[0015]其中，所述的工业微生物为棒状杆菌或球菌。优选为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、烷嗜热厌氧杆菌、梭状芽孢杆菌或乳酸球菌。最优选谷氨酸棒杆菌。
[0016]其中，所述的目标产物为有机酸、醇类物质或还原性气体。优选为丁二酸、丙酮酸、乳酸、丁酸、木糖醇、1，3-丙二醇或氢气。最优选丁二酸。
[0017]其中，所述的转氢酶基因来源于大肠杆菌JM109。优选的是，所述的转氢酶基因为膜结合转氢酶基因(即PntAB基因)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，共2932bp。
[0018]本发明中转氢酶基因的来源是该微生物具有调节辅酶平衡，实现NADH和NADPH之间转化的功能基因，例如膜结合的转氢酶。所用的工业微生物菌株是本身不具备转氢酶基因功能且胞内辅酶不平衡，急需提高目的代谢物转化率的菌株，适用产物为厌氧阶段发酵所得。本发明特选谷氨酸棒杆菌异源表达来自大肠杆菌中的转氢酶基因，提高厌氧目的物质丁二酸产率的方法为例说明问题。
[0019]一种表达载体，包含如SEQ ID NO:1所示的转氢酶基因。
[0020]上述表达载体,优选为重组表达载体pXMJ19。
[0021]一种谷氨酸棒杆菌，包含SEQ ID NO:1所示的转氢酶基因。
[0022]上述谷氨酸棒杆菌，优选为包含有重组质粒pXMJ19_pntAB的谷氨酸棒杆菌。
[0023]菌株构建的具体步骤如下:
[0024](I)使用PCR方法从大肠杆菌JM109 (购自Taraka公司)中克隆出转氢酶基因的DNA片段，由于转氢酶基因是两个亚基组成的，因此必须把它们各自的基因pntA，pntB均扩增出来。用于扩增pntA pntB基因3kb区大小的引物是:
[0025]5’ -GATTCTAGAAAAGGAGGACAACCATGCGAATTGGCATACCA-3’ (SEQ ID NO:2)；
[0026]5’ -GGGGTACCCAGGGTTACAGAGCTTTCAG-3’ (SEQ ID NO:3)。
[0027]在pntAB基因的上游引入XbaI酶切位点，在pntAB基因的下游引入KpnI酶切位点，这两个酶切位点不存在于pntAB基因的内部。引物DNA由金斯瑞生物技术公司合成。PCR产物进行纯化，用Xbal，KpnI双切纯化后的片段。
[0028](2)对pXMJ19质粒用XbaI，KpnI双酶切后回收大片段。
[0029](3)将双酶切后的载体PXMJ19和片段pntAB通过T4DNA连接酶连接，转化进入大肠杆菌感受态细胞中，获得重组质粒pXMJ19-pntAB,进行测序鉴定。
[0030](4)将正确的重组质粒pXMJ19_pntAB通过电转化的方法进入谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，通过PCR验证，获得的阳性转化子即为异源表达转氢酶基因的谷氨酸棒杆菌重组菌株。
[0031]采用本方明所述的构建方法得到一株异源表达转氢酶基因的工程菌菌株，命名为 Corynebacterium glutamicum resl67 Δ Idh-pntAB,原始菌株为 Corynebacteriumglutamicum resl67 Δ Idh0
[0032]本发明所述异源表达转氢酶基因的工程菌株的应用，包括菌种活化、种子培养、厌
氧发酵培养产丁二酸三步骤。
[0033](I)菌种活化:划线保藏的异源表达转氢酶基因工程菌的菌液于含有氯霉素的平板上，培养24h，挑取平板上长出的单菌落于加有氯霉素的LB培养基中，30 0C，200rpm,培养12h。
[0034](2)种子培养:按照体积比4%的接种量接入种子培养基中，好氧培养菌体至OD=0.8-1.0时加入0.8mM的IPTG进行诱导，其中好氧培养基:尿素2g/L，酵母浸粉2g/L,酪蛋白氨基酸 7g/L，(NH4) S047g/L, KH2PO40.5g/L, K2HPO40.5g/L, MgSO4.7Η200.5g/L, MnSO4.H204.2mg/L, FeSO4.7H206mg/L,生物素 0.2mg/L,维生素 B10.2mg/L,葡萄糖 400g/L0
[0035](3)厌氧发酵培养产丁二酸:将好氧阶段的菌体转入厌氧培养基中，其中厌氧发酵培养基:ΚΗ2Ρ040.5g/L, K2HPO40.5g/L, MgSO4.7H200.5g/L, MnSO4.H204.2mg/L, FeSO4.7H206mg/L,生物素 0.2mg/L,维生素 B10.2mg/L,无水碳酸钠 300mmol/L,葡萄糖400g/L。
[0036]与现有技术相比，本方明具有以下有益结果:[0037](I)本发明采用基因工程技术，从含有能调节辅酶平衡功能基因的微生物中扩增得到目的基因片段，克隆到本身体系内辅酶不平衡且没有能调节辅酶水平基因存在的微生物中，正如在谷氨酸棒杆菌中表达来自大肠杆菌中的转氢酶基因，能够解决发酵体系内NADPH过剩，所需还原力NADH不足的问题。
[0038](2)相比于现有技术，例如在酿酒酵母中表达转氢酶基因，由于体系内本身NADPH不足，生成辅酶方向与所需方向相反，并没有起到提高酿酒酵母厌氧产物乙醇的收率。本发明能避免出现这样的问题。现有技术大多是研究好氧阶段辅酶问题，对厌氧阶段调节辅酶平衡，提高目的物质转化率的研究并不多。本发明能调节厌氧发酵体系内辅酶水平，提高厌氧产物的转化率。
【专利附图】
【附图说明】 [0039]图1:谷氨酸棒杆菌产丁二酸代谢图。
[0040]图2:重组质粒构建图谱。
[0041]图3:重组质粒双酶切验证电泳图。
【具体实施方式】
[0042]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的基因构建、发酵及测定条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0043]本发明中生物材料的来源说明
[0044]1、质粒和菌株来源:
[0045]pXMJ19 质粒:购自 Taraka 公司
[0046]Corynebacterium glutamicum resl67 Δ Idh:保藏编号为 CGMCC N0.3973 (记载于中国专利CN102102086A中)。
[0047]2、基因组模板来源:
[0048]大肠杆菌基因组DNA:大肠杆菌JM109购自Taraka公司。
[0049]3、引物设计及合成:
[0050]引物自行设计并由金斯瑞生物技术公司合成。
[0051]实施例1:大肠杆菌JM109总基因组DNA的提取。
[0052]大肠杆菌JM109在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC110g/L)中培养12h，取l-5ml细菌培养液，12，000rpm/min离心lmin，尽量吸净上清。无菌水洗涤菌体，加入400 μ L裂解缓冲液(40mMTris-醋酸，PH7.8的20mM醋酸钠，ImMEDTA, 1%SDS)，用微量吸管快速吹打，使其混合，加入200 μ L的5M NaCl (5mol/L)。混匀后，12，OOOrpm/mim离心IOmin0将上清液移至另一灭菌EP管，加入等体积的苯酚，萃取离心取上层于另一灭菌EP管中，加入等体积的氯仿。12，000rpm/min离心3min,吸取上层水相至另一灭菌EP管中。加2倍体积无水乙醇，低温放置15min，离心得沉淀，待乙醇挥发后，用无菌水溶解沉淀，即为基因组DNA。
[0053]实施例2:转氢酶基因的克隆。
[0054]以实施例1得到的大肠杆菌JM109总基因组DNA为模板，以下列核苷酸序列作为引物:
[0055]Primerl 上游引物:
[0056]5，-GATTCTAGAAAAGGAGGACAACCATGCGAATTGGCATACCA-3 ’，加入 XbaI 酶切位点(下划线部分)。
[0057]Primer2 下游引物:
[0058]5’ -GGGGTACCCAGGGTTACAGAGCTTTCAG-3，,加入 KpnI 酶切位点(下划线部分)。
[0059]PCR反应在50 μ L体系中进行:模板DNA0.5 μ L，高保真酶0.5 μ L，5*PSBufferlOy L, 2.5mmol/L dNTP4 μ L，10 μ mol/L 引物 I 和引物 2 各 I μ L，补加 ddH20 至20 μ L0
[0060]PCR 反应条件:95V，5min ； (95。。30s，62。。15s, 72°C 3min30s, 30 个循环)；72°C，IOmin,纯化扩增出的转氢酶基因片段。
[0061]实施例3:转氢酶基因在表达载体上的构建。
[0062]纯化出的pntAB基因片段与表达载体pXMJ19分别用XbaI和KpnI进行双酶切，连接，采用氯化钙转化方法进入E.coliJM109感受态细胞中，经过培养，挑选转化子进行验证，构建过程见附图1。使用XbaI和KpnI酶切鉴定转化子，得到条带大小分别是6.582kb和3kb，结果见附图2，酶切结果及测序结果表明，重组质粒pXMJ19-pntAB构建成功。
[0063]实施例4:谷氨酸棒杆菌宿主转化。
[0064]本实例说明构建包含转氢酶pntAB的重组菌株，其过程包括:
[0065]将构建成功的重组质粒pXMJ19_pntAB电转进入谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，经过10yg/ml的氯霉素平板筛选,筛选的培养基为10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，1.5g/L琼脂粉，100mg/mL氯霉素。手提基因组PCR验证，获得异源表达转氢酶基因的谷氨酸棒杆菌重组菌株，为 Corynebacterium glutamicum resl67 Δ ldh-pntAB。
[0066]制备电转谷氨酸棒杆菌感受态的过程:
[0067]1，挑取ATCC (鸟AA)单菌落，在LB平板上活化，30°C培养12小时以上。
[0068]2，用接种环挑取一环菌泥于5mLLB摇管中，30°C，200rpm过夜培养。
[0069]3，次日，转接200uL到含3%甘氨酸和0.l%Tween80, 50mL液体培养基中于30°C，200rpm，培养至微微的浑浊即可，雾状(0D600大概为0.25)，这一过程需要3_4h。
[0070]设置对照组:0.5%Tween80, 2.5%甘氨酸。
[0071]4，培养结束后先将菌液冰浴15min，然后离心收集菌体，4°C，4000rpm，5min用预冷的15%甘油洗涤菌体4次。
[0072]5，200uL15%甘油重悬细胞，用1.5mLEP管分装，每管50_60uL，可直接用于电转化。
[0073]6,加入luL(0.4ug/uL)质粒轻轻混匀，冰浴30min,30min期间将洗干净的泡在无水乙醇中的电转杯置于超净台中，开启通风，紫外灭菌15min。
[0074]7，待电转杯里的乙醇彻底挥发，将感受态细胞转移至电转杯中，置于冰上冰浴15min。
[0075]8，电击细胞，电击条件
[0076]质粒线性片段
[0077]感受态细胞体积 60uL120uL
[0078]DNAIngIng[0079]电击条件0.2cm电转杯0.1cm电转杯
[0080]电压:2.5KV电压:2.5KV
[0081]电阻:200Ω电击时间:65ms
[0082]电击时间:4.6-4.9ms
[0083]9、电击后立即加入SOC培养基400ul混匀，转入1.5mLEP管。
[0084]10、46t:—*6min。
[0085]11、30°C摇床培养1.5~2小时，结束后离心浓缩菌体至100_200ul，涂布在卡那霉素(12.5 μ g/ml) LB平板上，30°C培养24小时以上长出转化子。
[0086]实施例5:重组谷氨酸棒杆菌发酵产丁二酸。
[0087]本实施例说明异源表达转氢酶基因的谷氨酸棒杆菌重组菌Corynebacteriumglutamicum resl67 Λ ldh-pntAB 与原始菌株Corynebacterium glutamicum resl67 Δ Idh两者发酵过程中产丁二酸能力的比较。
[0088](I)菌种活化:划线_80°C冻存管保藏的谷氨酸棒杆菌重组菌Corynebacteriumglutamicum resl67 Λ ldh-pntAB 与原始菌株Corynebacterium glutamicum resl67 Δ Idh的菌液到含有氯霉素的平板，分别挑取平板上长出的单菌落到5ml含有氯霉素的LB培养基的细胞瓶中。
`[0089]其中，所述的含有氯霉素平板的配方为:LB+Cm(氯霉素，100mg/mL)+l.5%的琼脂
[0090](2)种子培养:按照体积比4%的接种量接入种子培养基中，好氧培养菌体至OD=0.8-1.0时加入0.8mM的IPTG进行诱导。
[0091](3)厌氧发酵培养产丁二酸:采用厌氧血清瓶培养，将好氧阶段的菌体转入厌氧培养基中，厌氧培养条件:30°C，150rpm，18h。其中厌氧发酵培养基=KH2PO40.5g/L, K2HPO40.5g/L, MgSO4.7Η200.5g/L, MnSO4.Η204.2mg/L, FeSO4.7H206mg/L,生物素 0.2mg/L,维生素BI0.2mg/L,无水碳酸钠300mmol/L,葡萄糖400g/L0.8mM的IPTG。
[0092](4)液相测定丁二酸产量，结果显示，异源表达转氢酶基因的谷氨酸棒杆菌重组菌株 Corynebacterium glutamicum resl67 Δ ldh_pntAB 相 t匕于原$台菌株 Corynebacteriumglutamicum resl67 Δ ldh, 丁二酸产量提高38%, 丁二酸转化率提高20%。
[0093]实施例6:重组谷氨酸棒杆菌与原始菌株转氢酶浓度测定。
[0094]本实施例说明异源表达转氢酶基因的谷氨酸棒杆菌重组菌Corynebacteriumglutamicum resl67 Λ ldh-pntAB 与原始菌株Corynebacterium glutamicum resl67 Δ ldh两者发酵体系内辅酶浓度的变化。
[0095]同实施例5培养条件，培养转氢酶重组菌株和原始菌株厌氧发酵，对重组菌株和原始菌株厌氧初始和厌氧结束时间点进行取样用于辅酶浓度的测定。具体操作参照苏州科铭生物技术公司的辅酶含量测定试剂盒说明书，依据公式:
[0096]细菌或细胞中NAD+含量计算
[0097]NAD+ (μπιο?/g prot)=(测定管 OD 值-0.091)*3.55/样品蛋白浓度(g/L)细菌或细胞中NADH含量计算
[0098]NADH ( μ mol/g prot)=(测定管 OD 值 _0.091)*4.27/样品蛋白浓度(g/L)细菌或细胞中NADP+含量计算
[0099]NADP+ ( μ mol/g prot)=(测定管 OD 值-0.047) *37.6/样品蛋白浓度(g/L)细菌或细胞中NADPH含量计算
[0100]NADPH ( μ mol/g prot)=(测定管 OD 值-0.047)*85.5/样品蛋白浓度(g/L)公式中测定管OD值采用酶标仪测定得到，样品蛋白浓度采用考马斯亮蓝测蛋白方法。
[0101]通过辅酶浓度的测定，重组菌株相比于原始菌株辅酶变化，NADH/NAD+的值由1.5增加到2.14，NADPH/NADP+的值由1.77减少到1，表明在重组菌株中，转氢酶催化着NADPH向生成NADH的方向进行，能够为合成丁二酸提供更多的NADH。
[0102]实施例7:转氢酶基因对以不同碳源为培养基产丁二酸的影响。
[0103]本实例说明在以不同的PTS糖作为碳源的培养基中，转氢酶基因的存在对目的产物丁二酸的合成影响是不一样的。同实例5的培养条件，培养转氢酶重组菌株和原始菌株厌氧发酵，对重组菌株和原始菌株厌氧初始和厌氧结束时间点进行取样用于丁二酸测定和耗糖情况的测定。
[0104]培养基中分别以葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖为碳源对转氢酶重组菌株和原始菌株进行培养，测定结果是以葡萄糖，蔗糖为碳源，转氢酶重组菌株生产丁二酸的转化率比原始菌株高，且以葡萄糖为碳源的效果比以蔗糖为碳源更显著。以果糖和木糖为碳源，转氢酶基因的存在对丁二酸转化率没有明显影响。
[0105] 出现此结果的原因与PTS糖进入细胞内的代谢路径有关，转氢酶基因的功能是将磷酸戊糖途径中过剩的NADPH转化为用作丁二酸还原力的NADH。从上述四种糖代谢路径分析，葡萄糖进入胞内通过磷酸戊糖途径的代谢流大于蔗糖进入胞内通过磷酸戊糖途径的代谢流，所以转氢酶基因的存在对以葡萄糖为碳源合成丁二酸的影响比以蔗糖为碳源合成丁二酸的影响大。果糖进入细胞主要通过糖酵解途径，通过磷酸戊糖途径的代谢流很少，所以转氢酶的存在对以果糖为碳源产丁二酸的影响不大。木糖进入细胞通过异源表达的xylA, xylB基因代谢为D-XyluloSe-5P，进入磷酸戊糖途径的非氧化阶段，磷酸戊糖代谢的氧化阶段是产生NADPH的主要过程，而非氧化阶段不产生NADPH，所以转氢酶基因的存在对以木糖为碳源合成丁二酸没有影响。所以转氢酶基因的存在对那些主要通过磷酸戊糖代谢产生过剩的NADPH的PTS糖有显著提高目的物质的作用。
[0106]实验证明，在本身没有转氢酶基因的谷氨酸棒杆菌中异源表达来自大肠杆菌中的转氢酶基因，重组菌株厌氧产丁二酸的转化率相比于对照菌株有所提高，达到预期的目的。通过发酵体系内NADH、NAD+、NADPH、NADP+浓度及比例的变化，证实来自大肠杆菌中的转氢酶基因可以将谷氨酸棒杆菌内过剩的NADPH转化为NADH，从而参与代谢途径更多的氧化还原反应，为谷氨酸棒杆菌厌氧产丁二酸提供充足的还原力，最终提高厌氧产物丁二酸的产量和转化率。异源表达转氢酶基因用于两阶段发酵产目的物质的成功实例还未见报道，此方法可以为提高目的物质的产量和转化率提供解决方法。
[0107]以上显示和描述了本方面的基本原理和主要特征，以及本方明的优点。本方面的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例的描述只是为了说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化及改进，这些变化和改进都要求落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【权利要求】
1.一种提高厌氧发酵目标产物转化率的方法，它包括在培养基中培养工业微生物，通过厌氧发酵合成目标产物，再从所述的培养基中收集目标产物的步骤，其特征在于，通过在无转氢酶基因功能的工业微生物中异源表达转氢酶基因，提高还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸产率，从而提高目标产物的转化率。
2.根据权利要求1所述的提高厌氧发酵目标产物转化率的方法，其特征在于，所述的工业微生物为棒状杆菌或球菌。
3.根据权利要求2所述的提高厌氧发酵目标产物转化率的方法，其特征在于，所述的工业微生物为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、烷嗜热厌氧杆菌、梭状芽孢杆菌或乳酸球菌。
4.根据权利要求3所述的提高厌氧发酵目标产物转化率的方法，其特征在于，所述的工业微生物为谷氨酸棒杆菌。
5.根据权利要求1所述的提高厌氧发酵目标产物转化率的方法，其特征在于，所述的目标产物为有机酸、醇类物质或还原性气体。
6.根据权利要求5所述的提高厌氧发酵目标产物转化率的方法，其特征在于，所述的目标产物为丁二酸、丙酮酸、乳酸、丁酸、木糖醇、1，3-丙二醇或氢气。
7.根据权利要求6所述的提高厌氧发酵目标产物转化率的方法，其特征在于，所述的目标产物为丁二酸
8.根据权利要求1所述的提高厌氧发酵目标产物转化率的方法，其特征在于，所述的转氢酶基因来源于大肠杆菌。
9.根据权利要求8所述的提高厌氧发酵目标产物转化率的方法，其特征在于，所述的转氢酶基因为膜结合转氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
【文档编号】C12P7/52GK103710396SQ201310745214
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】蔡恒, 周志惠, 汪晨 申请人:南京工业大学