口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒及药物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒及药物。口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒，至少包括一对特异性扩增甲基化ZIC1基因的引物，所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物（ZIC1MSP-F）具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；下游引物（ZIC1MSP-R）具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。所述的试剂盒包括RT-PCR、实时定量PCR、MSP法试剂盒。治疗口腔癌的药物，以ZIC1基因为靶点。所述的药物，为药剂学上可接受的任何一种剂型，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。本发明为口腔癌的诊断、预防或治疗提供了新的路径。
【专利说明】口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒及药物
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药生物【技术领域】，具体是口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒及药物。
【背景技术】
[0002]肿瘤的发生发展是个多步骤过程，涉及到癌基因的活化和抑癌基因的失活。通过检测这些发生改变的癌基因和抑癌基因，可以在分子水平上早期检测到肿瘤的发生，从而为及时的干预阻挡创造机会。随着对肿瘤研究的深入，目前肿瘤的诊断和临床治疗都已经开始在分子水平展开。通过PCR和蛋白组学等技术，开发新的肿瘤相关标记物，正在日益提高肿瘤的早期诊断水平。而早期诊断和早期治疗是提高肿瘤治愈率的关键。同时，由于抑癌基因一般在肿瘤细胞中异常失活，因此恢复抑癌基因的功能一直以来被认为是抑制肿瘤进展的有效方法。而且，抑癌基因本身在正常组织细胞中表达并发挥防治肿瘤发生的重要作用，因此，增加抑癌基因的功能对正常细胞没有明显毒副作用，是一种相对安全的肿瘤特异性治疗方法。目前，已经有以恢复抑癌基因为目的的肿瘤治疗手段应用于肿瘤的临床防治，例如P53腺病毒等。
[0003]随着分子生物学的进展，越来越多的抑癌基因被发现和鉴定，不仅拓展了我们对肿瘤发生的认识，也为肿瘤诊治手段的开发提供了更多的机会。人ZICl基因(Zinc fingerof the cerebeIlum)(Genbank N0.ΝΜ_001168378.I),其最终表达产生一种跨膜转运蛋白，可能是一个新的抑癌基因。 [0004]口腔癌是发生于口腔的常见恶性肿瘤，绝大多数为鳞状细胞癌，在临床中包括发生于舌、颊、口底、唇、牙龈等黏膜的癌瘤，浸润和转移出现较早，以淋巴道转移为主，一旦发生转移，生存率明显降低。口腔癌发生初期不易引起患者重视，最好的治疗方法是手术切除，但一般被确诊时往往已错过最佳手术期，即使此时可以手术，也会因为手术面积大而对口腔造成损害，不能回复正常形态与功能。因此，寻找有效的早期诊断及无创治疗方法是应对口腔癌的重要方向。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术的不足，本发明提供口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒及药物。
[0006]口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒，至少包括一对特异性扩增甲基化ZICl基因的引物，所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物(ZIC1 MSP-F)具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；下游引物(ZIC1 MSP-R)具有如SEQ ID Ν0:2所示的核苷酸序列。
[0007]所述的试剂盒，包括RT-PCR、实时定量PCR、MSP法试剂盒。
[0008]治疗口腔癌的药物，以ZICl基因为靶点。
[0009]所述的药物，为药剂学上可接受的任何一种剂型，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
[0010]本发明的有益效果:为口腔的有效早期诊断及无创治疗方法提供了新的路径，使以甲基化ZICl基因为基础的诊断试剂及药物可方便快捷的在分子水平上实现口腔肿瘤的检测及治疗，同时，以ZICl基因为靶点和核心的试剂盒及药物可望成为口腔癌肿瘤检测及靶向治疗的一种新手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是ZICl基因在口腔癌细胞中的表达(RT-PCI^i)结果琼脂糖凝胶电泳图；
图2是ZICl在去甲基化药物处理后口腔癌肿瘤细中的表达(RT-PCIUi)结果琼脂糖
凝胶电泳图；
图3是MSP法(甲基化特异PCR)检测口腔癌肿瘤细胞中ZICl基因启动子DNA的甲基化情况(M表示甲基化，U表示非甲基化)结果琼脂糖凝胶电泳图；
图4是MSP法(甲基化特异PCR)检测口腔癌肿瘤组织中ZICl基因启动子DNA的甲基化情况(M表示甲基化；U表示非甲基化)结果琼脂糖凝胶电泳图；
图5是细胞克隆形成实验检测ZICl基因表达对Kb细胞克隆能力的影响图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0013]在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
[0014]本发明所述的新抑癌基因ZICl基因在开发口腔癌肿瘤诊断、预防和治疗手段中的应用，可参考常规的药物配置方法和试剂开发。药物剂型和生物制剂为医学上认可的任何一种剂型，例如为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
[0015]实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0016]试验试剂:Highfidelity PFU DNA聚合酶，Trizol试剂，小牛血清(FBS),磷酸盐缓冲液(PBS)，RPM1-1640培养基，青霉素-链霉素(P/S)和0.25%(ff/V)胰蛋白酶/ImM EDTA (Trypsin-EDTA)购于 Invitrogen (USA)。GoTaq 聚合酶从 Promega (USA)购得。肿瘤细胞系(SACC83, Kb, CAL27, TCA8113, A3A6, hn30 和 A2D3)分别从日本的 RikenBioResource Center细胞库和美国的ATCC购买。逆转录反应(RT)使用High CapacitycDNA Reverse Transcription试剂盒(美国Applied Biosystem公司)。亚硫酸氰盐修饰试剂盒以及MSP所用DNA聚合酶购自美国Zymo公司。
[0017]实施例1 RT- PCR实验检测ZICl基因在口腔癌肿瘤细胞中的表达 1.细胞培养
所有细胞均采用RPM1-1640培养基，其中含100 U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素和10%FBS，于37°C 5% C02培养箱中进行培养。[0018]2.总RNA抽提试剂盒
细胞的总RNA是用Invitrogen公司的Trizol试剂按照生产厂商提供的方法分离提取。该试剂是基于酸性酚一步抽提法生产的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要进行无RNA酶处理，以保证实验中无RNA酶的环境。
[0019]3.总RNA的抽提
培养细胞至对数生长期，吸干培养液后，直接加入Iml Trizol，室温下静置5分钟，收集细胞到1.5ml离心管中。加入氯仿后，4°C离心分层；将上层水相转入新鲜1.5ml离心管，加入Iml异丙醇，4°C离心沉淀RNA ;用1.5ml75%乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA质量鉴定:紫外分光光度计测定260/280比值(确认比值均在1.7-2.0)。并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解。
[0020]4.cDNA 的合成
逆转录反应(RT)使用美国 Applied Biosystem 公司的 High Capacity cDNA ReverseTranscription试剂盒，每个反应使用2微克总RNA。加入2 X RT bufferlO微升和总RNAlO微升，反应总体积为20微升。使用ABI PCR仪进行逆转录反应，具体运行参数如下:25°C10分钟；37°C 120分钟；85°C 5分钟；冷却至4° C。-20° C保存备用。
[0021]5.PCR
细胞ZICl的表达水平通过常规PCR法来检测，使用美国Promega公司的GoTaq聚合酶。反应总体积为20微升:采用I微升cDNA模板，加入2 XPCR bufferlO微升，高纯去离子水9微升。反应参数如下:95°C预变性2分钟；35个循环设置如下，95°C变性30秒；55°C退火30秒，72° C延伸30秒；最后72° C延伸1`0分钟。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物(结果见图1)。
[0022]PCR使用所有引物均在Invitrogen公司合成。具体序列如下:
ZICl 的 RT-PCR 引物:
ZICl-F:上游引物为 5' -AAACTGGTTAACCACATCCGC-3' (SEQ ID NO:1)；
ZICl-R:下游引物为 5' -CTCAAACTCGCACTTGAAGG-3' (SEQ ID N0:2),
GAPDH 的 RT-PCR 引物:
GAPDH-F:5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3' (SEQ ID NO:3);
GAPDH-R:5/ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' (SEQ ID NO:4)。
[0023]6.结果分析
如图1所示，与正常细胞(A3-A6)相比，ZICl基因在口腔癌肿瘤细胞中的表达明显下降。
[0024]实施例2 RT-PCR实验检测ZICl基因在去甲基化药物处理后肿瘤细胞中的表达 1.细胞培养
所有细胞均采用RPM1-1640培养基，其中含100 U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素和10%FBS，于37°C 5% C02培养箱中进行培养。去甲基化药物的使用是参照常规的Aza(5-氮杂-2’ -脱氧胞喃唳核苷)应用流程:IOmM的Aza处理肿瘤细胞,连续3天,每天更换培养液。同等量DMSO处理3天后的细胞用来作为对照。
[0025]2.总RNA抽提试剂盒 参照实施例1。[0026]3.总RNA的抽提 参照实施例1。
[0027]4.cDNA 的合成 参照实施例1。
[0028]5.实时定量PCR 参照实施例1。
[0029]7.结果分析
结果如图2所示，肿瘤细胞去甲基化后，ZICl基因表达显著升高，表明ZICl基因表达受到DNA甲基化调控。
[0030]实施例3 MSP法检测口腔癌肿瘤细胞中ZICl基因的DNA甲基化 1.细胞培养
参照实施例1。
[0031]2.DNA 抽提
将匀浆器等在200°C干烤4小时，去除RNA酶，冷却；将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzoI试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4° C离心分层；将中层固相转入一新鲜离心管中，加
0.3ml无水乙醇(按照Iml Trizol计算)，混匀后室温静置3分钟，4° C不超过2000g离心沉淀DNA ;收集上清，用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠(Iml每Iml Trizol)洗涤DNA沉淀；室温静置30分钟，4°C不超过2000g离心沉淀DNA ;收集上清重复一次；用75%乙醇洗涤DNA沉淀，每用Iml Trizol加入1.5_2ml75%乙醇，室温静置10-20分钟，4° C不超过2000g离心沉淀DNA ;风干后用8mM NaOH溶解沉淀。抽提的DNA质量鉴定:紫外分光光度计测定260/280nm比值，比值均在1.8左右。
[0032]3.亚硫酸氰盐修饰
基因组DNA的亚硫酸庆盐修饰是用ZYMO公司DNA Modification Kit按照生产商提供的操作步骤进行。重亚硫酸氢盐能使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，从而反映出单个胞嘧啶的甲基化状态。具体步骤如下:取130 μ I CT转化试剂到20 μ I基因组DNA溶液中，然后将混合液98°C孵育10分钟，64°C孵育2.5小时，4°C孵育20小时；将此150 μ 混合液及600 μ I M-结合缓冲液加到Zymo-Spin?IC柱中，全速离心30秒，弃去滤出液体，加100μ I M-洗涤液至过滤柱中洗柱；洗柱后往过滤柱中加入200 μ I M-Desulphonation缓冲液,室温放置15分钟,全速离心后,用M-WashBuffer洗柱两次；最后用10 μ I M-洗脱液溶解吸附柱上的DNA，离心收集修饰后DNA。
[0033]4.MSP
ZICl基因启动子超甲基化的检测用MSP方法检测，使用美国Zymo公司的GoTaq聚合酶。反应总体积为20微升:以I μ I亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板，上下游特异性引物各I μ I, 2X Zymo Taq premixed 10 μ I,高纯去离子水7 μ I。反应参数如下:95°C预变性5分钟；40个循环设置如下，95° C变性30秒；62°C退火30秒，72° C延伸30秒；最后72° C延伸10分钟。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0034]PCR使用所有引物均在Invitrogen公司合成。具体序列如下:
ZICl MSP:MSP-F (甲基化特异性上游引物):5' -GGATTTTTTGTTTCGTAATC-3' (SEQ ID N0:5), MSP-R (甲基化特异性下游引物):5' -CCCGTTAACCACGTTAAACG-3' (SEQ ID N0:6), ZICl USP:
USP-F(非甲基化特异性上游引物):5' -GGGATTTTTTGTTTTGTAATT-3' (SEQ ID N0:7), USP-R (非甲基化特异性下游引物):5' -CCCATTAACCACATTAAACA-3' (SEQ ID N0:8)。
[0035]5.结果分析
ZICl基因在肿瘤细胞中因高度甲基化而表达下降(图3，M代表高甲基化；U代表低甲基化)。
[0036]如图3 所示，SACC83, KB, CAL27, TCA8113, A3A6 等 ZICl 基因的 mRNA 水平下调的细胞中ZICl基因的启动子明显被甲基化，而ZICl基因在正常口腔细胞中没有检测到明显的启动子甲基化。
[0037]实施例4 MSP法检测口腔癌肿瘤组织中ZICl基因的DNA甲基化 1.组织分离
所有标本均经病理确认。手术切除标本一经离体，迅速切取肿瘤病灶及癌旁组织，放入液氮中保存。
[0038]2.DNA 抽提 参照实施例3。
[0039]3.亚硫酸氰盐修饰 参照实施例3。
`[0040]4.MSP
参照实施例3。
[0041]5.结果分析
结果如图4所示，ZICl基因在肿瘤组织中高度甲基化，而在正常组织中甲基化程度明显降低。
[0042]实施例5 ZICl cDNA的克隆和表达载体的构建
1.克隆专用cDNA的合成
逆转录反应(RT)使用美国 Invitrogen 公司的 SuperScipt III First SynthesisSystem for RT-PCR试剂盒，每个反应使用2微克总RNA。反应总体积为20微升:10 X RTbuffer 2 微升，总 RNA 5 微升，01igodT20 引物 I 微升，IOmM dNTPl 微升，25mM MgCl2 4 微升,0.1M DTT I微升，RNaseOUT I微升,SuperScript III逆转录酶I微升，高纯去离子水4微升。使用ABI PCR仪进行逆转录反应，具体运行参数如下:25°C 10分钟；37°C 120分钟；85° C 5分钟；冷却至4° C。-20° C保存备用。50° C 50分钟，85° C 5分钟，冷却至4° C后加入RNaseH，37°C孵育20分钟。-20° C保存备用。
[0043]2.ZICl cDNA 的克隆
全长ZICl基因的开放阅读框采用RT-PCR的方法从正常胃组织的总RNA中扩增获得，其中聚合酶连反应(PCR)使用美国Invitrogen公司的highfidelity PFU DNA聚合酶。反应总体积为50微升:5XPCR缓冲液10微升，IOmMdNTP I微升，引物各I微升，PFU酶0.4微升，cDNA模板5微升，高纯去离子水32.6微升。PCR反应参数如下:96° C预变性4分钟；反应37个循环:95°C变性30秒；58° C退火30秒；72° C延伸I分钟。[0044]运用TOPO技术，连接到TOPO PCR Blunt载体(美国Invitrogen公司)。具体步骤如下:取新鲜PCR产物2微升，加入TOPO载体I微升，试剂盒中氯化钠溶液I微升，高纯无离子水2微升。室温下孵育10分钟后。
[0045]开始细菌转化:将TOPO反应产物加入冰浴融化的感受态细菌中，冰浴孵育半小时，42° C热休克90秒，加入试剂盒中SOB培养液I毫升，37° C低速培养I小时，再将细菌培养液接种在含青霉素培养LB板中继续常规培养过夜。第二天，挑取克隆培养，经测序选择正确克隆。
[0046]3.ZICl的克隆引物
ZICl-cF: 5' -GGAGTCAACGGATTTGGT-3' (SEQ ID NO:5)
ZICl-cR: 5' -GTGATGGGATTTCCATTGAT-3' (SEQ ID NO:6)
4.ZICl表达载体的构建
抽提正确克隆的质粒，用EcoR I酶切后，经1%琼脂糖电泳分离回收目的片段，连入线性化的pcDNA3.1。连接反应如下:载体I微升，回收插入子5微升，连接酶缓冲液2微升，T4 DNA连接酶I微升(Roche Applied Science公司产品)。16°C连接过夜。过夜连接产物参照步骤2中的细菌转化程序进行转化和细菌接种。挑取克隆培养，经酶切(图5)和测序双鉴定后，保存正确克隆，使用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒抽提质粒，用于基因转染。
[0047]5.结果分析
ZICl基因的哺乳动物细胞表达载体构建成功。
[0048]实施例6细胞克隆形 成实验检测ZICl基因抑癌能力
1.细胞培养
参照实施例1。
[0049]2.G418筛选浓度测定
Kb 培养与 24 孔培养板，G418 分别用 100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。
[0050]3.转染
以pcDNA3.1为载体，进行ZICl基因转染。转染实验前天接种细胞，以6孔培养皿(35mm)每孔2mL培养基I X IO5浓度。转染时更换2mL培养基，之后，准备D0SPER/DNA混合物，溶液 A:用 HBS 稀释 DNA (pcDNA3、重组 pcDNA3)各 1.5 μ g 到总体积 50 μ L (30 μ g/mL)；溶液B:用HBS稀释6 μ L脂质体到终溶剂50 μ L( 120 μ g/mL)。混合溶液a和B，轻柔混合后室温孵育20min，以便脂质体/DNA混合物形成。100 μ L脂质体/DNA混合物逐滴加入培养基中，边加边轻摇培养板。以pcDNA3.1空载体作为对照。
[0051]4.G418 筛选
转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。在G418筛选浓度下持续培养14天。形成的克隆先用甲醇固定，然后用龙胆紫染色，拍照。
[0052]5.结果分析
如图5所示，转染ZICl基因表达载体以恢复ZICl基因在口腔癌肿瘤细胞中表达后，肿瘤细胞的集落形成能力受到明显抑制。对照组是空载体(PCDNA3.1)。
[0053]结论:ZICl基因在口腔癌肿瘤细胞和肿瘤组织中特异性低表达，而且同启动子区DNA高甲基化相关；逆转该基因的DNA甲基化，可以恢复ZICl基因在肿瘤细胞中的表达；肿瘤组织中可检测到ZICl基因的DNA甲基化；通过克隆ZICl cDNA，构建ZICl基因的哺乳动物表达载体，发现恢复ZICl基因在口腔癌肿瘤细胞中的表达，可以抑制肿瘤细胞的生长。以上结果表明:ZIC1基因及其甲基化是口腔癌发生的关键原因。检测ZICl基因的表达可以用于口腔癌肿瘤的诊断。而恢复ZICl基因的抑癌功能可以达到治疗口腔癌的目的。因此，ZICl基因及其甲基化在肿瘤的诊断、预防以及治疗中均有一定的应用价值。
[0054] 尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构 成对本发明的限制。
【权利要求】
1.一种口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒，其特征在于，至少包括一对特异性扩增甲基化ZICl基因的引物，所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物(ZIC1MSP-F)具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；下游引物(ZIC1 MSP-R)具有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括RT-PCR、实时定量PCR、MSP法试剂盒。
3.一种治疗口腔癌的药物，其特征在于，以ZICl基因为靶点。
4.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，为药剂学上可接受的任何一种剂型，包括粉剂、注射 液、胶囊、片剂或口服液。
【文档编号】C12Q1/68GK103695556SQ201310748398
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】金洪传, 王娴, 许首芳 申请人:杭州博谱医药科技有限公司