溶菌酶作为标签的用途

溶菌酶作为标签的用途
【专利摘要】本公开提供表达和纯化多肽和蛋白的方法。在本公开中，公开了溶菌酶作为融合伴侣的用途。此外，描述了经由溶菌酶特异性的抗体来分离溶菌酶标记的多肽和蛋白的纯化方法。更具体地，本公开提供通过使用溶菌酶作为标签来表达和纯化单体多肽和蛋白的方法。
【专利说明】溶菌酶作为标签的用途 【背景技术】
[〇〇〇1] 重组多肽和蛋白的表达和纯化是生物技术研究内的常规工序。通常，纯化工序 包括期望的多肽在原核细胞或真核细胞内的表达，之后是与宿主细胞的其他非蛋白类 (non-proteinacious)颗粒和蛋白类颗粒的分离。由此使用多种类型的层析法例如通过大 小、电荷或疏水性来纯化期望的分子。
[0002] -个进一步的具体策略是使用与目标多肽融合的标签。特定的标签可用于支持目 标多肽的折叠、可溶性、稳定性和表达，而其他标签主要用于纯化。因此，期望的多肽在原核 细胞或真核细胞中作为融合构建体被表达，且可以通过经由特异性抗原结合部分检测的融 合标签来进行纯化。这种类型的纯化策略被称为亲和层析。
[0003] 例如，用于科学界的一个纯化标签是His标签。因此，可以通过使用例如具有固定 化的对His标签具有强亲和性的镍或钴离子的纯化柱来分离与His标签融合的多肽。然后， 在包括咪唑的洗脱工序中从柱子中释放蛋白，其中咪唑与His标签竞争与镍或钴的结合。 进一步的实例是Flag标签和Strep标签，它们都融合到目标多肽上并分别对于各自的标签 特异性的抗原结合部分例如抗体或Streptactin充当抗原。例如，用于纯化（例如，分别经 由Flag标签、Strep标签或His标签）的这些结合部分（例如，抗体、streptactin或金属 离子）可以例如固定在固体基质上（例如，膜、珠）上。与用于特定标签的特异性结合部分 连接的那些固体基质可以用于容易地从作为裂解物或条件培养基的复杂样品中捕获带标 签的多肽。然而，作为短肽，Flag标签、Str印标签和His标签有时不易进入特定的多肽或 蛋白的3维结构内，因而不适合用于纯化。另外，经由Str印标签从哺乳动物细胞培养物上 清液进行的纯化由于大多数介质的高生物素浓度而受损。
[0004] 某些较大的球状标签可以支持难于表达的多肽作为蛋白的折叠、可溶性和表达。 开发的大多数可得的基因融合技术是在大肠杆菌中表达并从粗裂解物中纯化。这些融合蛋 白的实例是MBP (麦芽糖结合蛋白）、GST (谷胱甘肽-s-转移酶）和SUM0 (小的泛素修饰蛋 白；参见例如，W003/057174)。
[0005] SUM0-标签最初被设计用于原核表达（例如，SUMOpro?表达试剂盒，http: // www. lifesensors. com),然后被进一步研发用于哺乳动物表达（SUMOstar?表达试剂盒， http://www. lifesensors. com)。SUM0起伴侣（chaperon)和蛋白折叠引发剂的作用，以改 进目标蛋白的可溶性和表达水平。通过使用去SU0M酶（desumoylase)，可以去除融合到目 标蛋白的N端上的SUM0标签，导致蛋白的天然N端的产生。将SUM0标签融合到目标蛋白 的C端不能实现融合标签的去除。纯化与SUM0标签融合的目标蛋白并不利用SUM0标签， 但是需要应用纯化标签，如His标签。
[0006] 用于哺乳动物表达的可选途径是使用Fc标签，其包括人类IgGl的铰链区、CH2和 CH3结构域。Fc标签用于支持特定多肽的表达、折叠和分泌，同时也被用作其纯化的标签。 His标签和Flag标签是具有低分子量的短肽，且较好地适用于可溶性多肽和蛋白的表达， 而Fc标签是超过200个氨基酸的多肽，其支持特定的较不溶性的疏水性蛋白的表达。然 而，相对较大的Fc部分形成二硫键桥接的聚集体，引起分离的和纯化的目标蛋白的二聚体 或多聚体形式。
[0007] 其他常见替代者是GST (谷胱甘肽S-转移酶）和MBP (麦芽糖结合蛋白），其分别 结合谷胱甘肽和麦芽糖。两种标签都具有高分子量（>25kDa)且显著地提高目标多肽或蛋 白的可溶性和稳定性。然而，两种基因融合系统都不能用于进行分泌蛋白从条件哺乳动物 细胞培养上清液中的蛋白纯化，因为培养基的成分阻止融合标签与其结合伴侣（即谷胱甘 肽或麦芽糖）的结合。另外，两种融合标签都具有在哺乳类表达系统中聚集的倾向和也易 于形成内含体。
[0008] 因此，例如Fc标签不适合用于单体多肽和蛋白的表达和纯化，所有其它可用的标 签也具有特定的优点和缺点且不适合用于某些特定多肽或蛋白的表达和/或纯化。汇总言 之，表达和纯化的质量不仅取决于目标多肽或蛋白的性质，而且取决于所使用的各个标签。 因而，特定标签与特定的目标多肽或蛋白的组合对于最佳结果而言是重要的，但却难以预 测。因此，对于能够实现特定的挑战性的重组多肽和蛋白的表达和纯化或改善其质量的新 型便利标签有着无尽的需求。本申请中公开的方法提供了通过利用溶菌酶作为标签来表达 和纯化多肽或蛋白的有效途径。
【发明内容】

[0009] 本公开提供表达和纯化单体多肽和蛋白的方法。本公开能够对使用本领域已知的 其他标签不能表达和纯化的多肽和蛋白进行纯化。在本公开中，公开了溶菌酶作为融合伴 侣（fusion partner)的用途。此外，描述了经由溶菌酶-特异性抗体而分离溶菌酶标记的 多肽和蛋白的纯化方法。与现有技术的其他标签相比，使用溶菌酶作为标签结果可以实现 特定单体多肽和蛋白的表达或提高的多肽和蛋白表达率。通过使用溶菌酶作为融合伴侣， 可以避免不恰当的折叠、低溶解度和表达、活性损失以及分离多肽的聚集，它们会导致不想 要的和不期望的多聚体蛋白的形成。此外，使用溶菌酶的另一个优势在于其抗菌活性，这使 得可以减少或免除抗生素，这对于无菌条件下的细胞培养和蛋白表达过程通常是需要的。
[0010] 溶菌酶（EC 3. 2. 1. 17)也被称为胞壁酸酶（muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水 解酶，其具有大约14. 6kDa的分子量，并催化肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡糖胺 残基之间的以及壳糊精中N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1，4-β -键的水解。
[〇〇11] 溶菌酶一般由许多生物体如病毒、植物、昆虫、鸟类、爬行动物和哺乳动物产生作 为针对细菌的防御机制。该酶通过切割肽聚糖的糖苷键而引起细菌细胞壁的水解，所述肽 聚糖是细菌中的重要结构分子。在其细胞壁已由溶菌酶作用削弱后，细菌细胞因渗透压引 起裂解。
[0012] 溶菌酶已分类成五个不同的糖苷水解酶（GH)家族（Cazy，http://www. cazy. org):鸡蛋清溶菌酶（GH22)、鹅蛋清溶菌酶（GH23)、细菌噬菌体T4溶菌酶（GH24)、鞘氨醇 单胞菌属（Sphingomonas)鞭毛蛋白（GH73)和拟鞘孢属（Chalaropsis)溶菌酶（GH25)。已 发现溶菌酶家族GH25与其他溶菌酶家族在结构上无关。
[0013] 溶菌酶的用途已在动物饲料（参见例如W0 00/21381和W004/026334)、干酪 生产（参见例如 W0 05/080559)、食品保存（Hughey and Johnson(1987)Appl Environ Microbiol53:2165)、去污剂（参见例如US序列号07/428, 273和EP0425016)、口腔护理（参 见例如US序列号06/279, 536、W004/017988和W008/124764)、美容学和皮肤病学、避孕、泌 尿学和妇科学（参见例如WO 08/124764)中提出。鸡蛋清溶菌酶是市售的溶菌酶产品。也 已知从微生物分离但也有从哺乳动物来源分离的溶菌酶。然而还没有关于在哺乳动物细胞 培养中的重组溶菌酶表达或在细胞培养中与溶菌酶融合的肽或蛋白的表达的公开报道。
[0014] 美国序列号10/024, 597和W0 01/00855公开了与溶菌酶融合的小肽在转基因动 物乳液中的表达。因为溶菌酶是天然表达的乳蛋白，与溶菌酶融合的肽得以表达，并且可以 从乳液中主要呈酸性的蛋白中纯化基本的溶菌酶融合肽。然而，来自乳腺的细胞据记载不 能在细胞培养中产生乳蛋白，如溶菌酶（Streuli and Bissell(1990)The Journal of Cell Biology, Volume 110, April 1990 1405-1415)。此外，乳蛋白在转基因动物中的蛋白表达 对于细胞培养表达是不可预测的，且各自的发现不能被转移到细胞培养体系（参见例如， Furth 等人，（1991)，19Nucleic Acids Res. 6205 和 Whitelaw 等人，（1991) ;lTransgenic Res. 3)。
[0015] 在另一个申请中，Kobilka等人利用溶菌酶作为用于G-蛋白偶联受体（GPCR)的稳 定剂，以实现GPCR的结晶化。由此，将T4溶菌酶插入至在昆虫细胞内表达的各个GPCR中 的一个胞内环中（参见，W009/051769)。
[0016] 本公开提供用于宿主细胞内的分离的蛋白、肽和/或氨基酸的产生和纯化的方 法，其中所述蛋白、肽和/或氨基酸融合至溶菌酶，所述方法包括，
[0017] (a)在允许编码目标蛋白的基因的表达的条件下，培养所述宿主细胞，和
[0018] (b)分离所述蛋白、肽或氨基酸。
[〇〇19] 本公开也提供用于本文公开的方法中的宿主细胞和载体。本公开也提供用于本公 开的方法中的反应容器，如发酵罐。本公开也提供试剂盒，包括，
[0020] (a)根据本发明的载体，
[0021] (b)溶菌酶特异性抗体，和
[0022] (c)任选地，根据本文描述的方法使用所述载体和抗体的说明书。 【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1 :用于溶菌酶融合蛋白的表达的载体。将编码鸡溶菌酶的序列亚克隆到pMax 载体骨架中。
[0024] 图2A-C :编码包括鸡溶菌酶（下划线示出）的整个pMax表达构建体（SEQ ID NO: 15)的核苷酸序列。 【具体实施方式】
[0025] 在一个方面，本公开涉及用于增强目标多肽或蛋白的表达的方法，其通过将所述 目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白。
[0026] 在本公开的一个实施方式中，目标多肽或蛋白是单体的目标多肽或蛋白。在进一 步的实施方式中，目标多肽或蛋白具有生理学的单体组成。在另一个实施方式中，目标多肽 或蛋白具有生理学的单体组成且充当单体。在另一个实施方式中，目标蛋白是生理学上作 为单体表达的细胞表面受体。在进一步的实施方式中，目标蛋白是生理学上作为单体表达 的可溶性蛋白。
[0027] 在本公开的一个实施方式中，融合蛋白包括目标多肽或蛋白和溶菌酶，其中将溶 菌酶融合到目标多肽或蛋白的N端。在本公开的一个实施方式中，融合蛋白包括目标多肽 或蛋白和溶菌酶，其中将溶菌酶融合到目标多肽或蛋白的C端。
[0028] 在一个实施方式中，本公开涉及用于增强目标多肽或蛋白的表达的方法，其通过 将所述目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白，其中所述融合蛋白的产量至少2倍 地高于不包含溶菌酶的目标多肽或蛋白的产量。
[0029] 在一个实施方式中，本公开涉及用于增强目标多肽或蛋白的表达的方法，其通过 将所述目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白，其中包括目标多肽或蛋白和溶菌 酶的融合蛋白不形成任何聚集体或内含体。在本公开的进一步的实施方式中，少于50%、 40%,30%,25%,20%U5%U4%U3%U2%U1 %>10%>9%,8%,7%,6%,5%,4%, 3%、2%、1%的包括目标多肤或蛋白和溶囷酶的融合蛋白形成聚集体。
[0030] 在本公开的一个实施方式中，所述融合蛋白在宿主细胞内表达。在本公开的进一 步的实施方式中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在优选的实施方式中，宿主细胞 是真核细胞。在本公开的更优选的实施方式中，所述真核细胞选自CH0细胞、PER. C6细胞、 HKB11细胞和HEK293细胞。
[0031] 在本公开的一个实施方式中，用编码所述包括目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋 白的表达载体转染所述宿主细胞。
[0032] 在本公开的一个实施方式中，所述融合蛋白在宿主细胞中表达，其中与用于培养 没有与溶菌酶融合的所述目标蛋白或多肽的培养基相比，所述宿主细胞的培养需要少至 少50%的抗生素作为用于培养基的补充物。在本公开的优选的实施方式中，所述融合蛋白 在宿主细胞中表达，其中与用于培养没有与溶菌酶融合的所述目标蛋白或多肽的培养基相 t匕，所述宿主细胞的培养需要少至少50 %、60%、70 %、80%、90%、或95 %的抗生素作为用 于培养基的补充物。在本公开的更优选的实施方式中，所述融合蛋白在宿主细胞中表达，其 中用于培养所述宿主细胞的培养基没有抗生素。
[0033] 在本公开的一个实施方式中，在表达之后分离所述包括目标多肽或蛋白和溶菌酶 的融合蛋白。在本公开的进一步的实施方式中，从宿主细胞、培养基或两者分离所述融合蛋 白。
[〇〇34] 在本公开的一个实施方式中，利用溶菌酶特异性的抗体来分离所述融合蛋白。在 本公开的进一步的实施方式中，溶菌酶特异性抗体是分离的抗体。在本公开的优选的实施 方式中，溶菌酶特异性抗体是单克隆抗体。在本公开的优选的实施方式中，溶菌酶特异性抗 体包括序列 NSAAWS(SEQ ID N0:9)的 HCDR1 区、序列 RIYYRSKWYNDYAVSVKS(SEQ ID N0:10) 的 HCDR2 区、序列 LDHRYHEDTVYPGMDV(SEQ ID NO: 11)的 HCDR3 区、序列 S⑶NLPAYTVT(SEQ ID N0:12)的 LCDR1 区、序列 DDSDRPS(SEQ ID N0:13)的 LCDR2 区和序列 ASWDPSSGV(SEQ ID N0:14)的LCDR3区。在本公开的优选的实施方式中，溶菌酶特异性抗体是M0R03207。在本 公开的另一个实施方式中，溶菌酶特异性抗体结合至与M0R03207相同的表位。在本公开的 进一步的实施方式中，溶菌酶特异性抗体与M0R03207竞争。
[0035] 在本公开的一个实施方式中，溶菌酶特异性抗体连接在支撑基质上。在本公开的 进一步的实施方式中，溶菌酶特异性抗体连接在选自琼脂糖、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、琼 脂糖/聚丙烯酰胺共聚物、葡聚糖、纤维素、聚丙烯、聚碳酸脂、硝化纤维、玻璃、纸和磁性粒 子的支撑基质上。在进一步的实施方式中，将支撑基质引入纯化柱中。在进一步的实施方 式中，将支撑基质引入至可分离的珠上。
[0036] 在本公开的一个方面，将目标多肽或蛋白融合至哺乳动物溶菌酶。在一个实施方 式中，哺乳动物溶菌酶选自人类、小鼠、大鼠、鸡、兔、山羊和灵长动物溶菌酶。在优选的实施 方式中，哺乳动物溶菌酶是鸡溶菌酶。
[0037] 在本公开的一个方面，将目标多肽或蛋白融合至溶菌酶或它的片段、类似物、同源 物、变体或衍生物。在一个实施方式中，溶菌酶或它的片段、类似物、同源物、变体或衍生物 来源于哺乳动物溶菌酶。在进一步的实施方式中，哺乳动物溶菌酶选自人类、小鼠、大鼠、 鸡、兔、山羊和灵长动物溶菌酶。在优选的实施方式中，哺乳动物溶菌酶是鸡溶菌酶。
[0038] 在一个实施方式中，融合蛋白包括目标多肽或蛋白，溶菌酶或它的片段、类似物、 同源物、变体或衍生物，以及蛋白酶切割位点。在优选的实施方式中，切割位点是FactorXa、 肠激酶（肠肽酶）、TEV-蛋白酶或HRV3C-蛋白酶（PreScission蛋白酶）。在优选的实施 方式中，蛋白酶切割位点可用于溶菌酶多肽结构域的去除。
[0039] 在一个方面，本公开涉及包括编码融合蛋白的表达载体以及溶菌酶特异性抗体的 试剂盒，其中所述融合蛋白包括目标多肽或蛋白和溶菌酶。在一个实施方式中，将所述溶菌 酶特异性抗体连接在支撑基质上。在优选的实施方式中，所述支撑基质是固体支撑基质。 在进一步的实施方式中，所述固体支撑基质选自琼脂糖、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、琼脂糖/ 聚丙烯酰胺共聚物、葡聚糖、纤维素、聚丙烯、聚碳酸脂、硝化纤维、玻璃、纸和磁性粒子。
[0040] 在一个方面，本公开涉及包括目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白，其中目标多 肽或蛋白的长度为至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、 至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸、至少110个氨基酸、至少120个氨 基酸、至少125个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少 300个氨基酸、至少400个氨基酸或至少500个氨基酸。
[0041] 在一个方面，本公开涉及用溶菌酶标记的多肽或蛋白。在一个实施方式中，用溶菌 酶标记的多肽或蛋白长为至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个 氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸、至少110个氨基酸、至少 120个氨基酸、至少125个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基 酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、或至少500个氨基酸。
[〇〇42] 在一个方面，本公开涉及用于增强单体的目标多肽或蛋白的表达的方法，其通过 将所述单体的目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白。
[0043] 在一个实施方式中，本公开涉及用于增强单体的目标多肽或蛋白的表达的方法， 其通过将所述单体的目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白，其中所述融合蛋白的 产量至少2倍高于、至少3倍高于、至少4倍高于、至少5倍高于、至少6倍高于、至少7倍 高于、至少7倍高于、至少8倍高于、至少10倍高于、至少15倍高于、至少20倍高于、至少 25倍高于、至少50倍高于或至少100倍高于不包括溶菌酶的单体目标多肽或蛋白的产量。
[0044] 在一个实施方式中，本公开涉及用于增强单体的目标多肽或蛋白的表达的方法， 其通过将所述单体的目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白，其中包括单体的目标 多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白不形成任何聚集体或内含体。在本公开的进一步的实施方 式中，少于 50%、40%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、 6%、5%、4%、3%、2%、1%的包括单体的目标多肤或蛋白和溶囷酶的融合蛋白形成聚合 物。
[0045] 在本公开的一个实施方式中，用编码所述包括单体的目标多肽或蛋白和溶菌酶的 融合蛋白的表达载体转染所述宿主细胞。
[0046] 在本公开的一个实施方式中，融合蛋白包括单体的目标多肽或蛋白和溶菌酶，其 中将溶菌酶融合到单体的目标多肽或蛋白的N端。在本公开的一个实施方式中，融合蛋 白包括单体的目标多肽或蛋白和溶菌酶，其中将溶菌酶融合到单体的目标多肽或蛋白的C 端。
[0047] 在本公开的一个实施方式中，在表达之后分离所述包括单体的目标多肽或蛋白和 溶菌酶的融合蛋白。在本公开的进一步的实施方式中，从宿主细胞、培养基或两者分离所述 融合蛋白。
[〇〇48] 在一个方面，本公开涉及用于融合蛋白的产生的方法，所述方法包括以下步骤，
[0049] (a)在宿主细胞中表达所述融合蛋白，和
[0050] (b)分离所述融合蛋白，
[0051] 其中所述融合蛋白的一个多肽结构域是溶菌酶。
[0052] 在本公开的一个实施方式中，从宿主细胞分离融合蛋白。在进一步的实施方式中， 从培养基分离融合蛋白。在优选的实施方式中，从宿主细胞和培养基分离融合蛋白。
[0053] 在一个方面，本公开涉及用于融合蛋白的产生的方法，所述方法包括以下步骤，
[0054] (a)在宿主细胞中表达所述融合蛋白，和
[0055] (b)从宿主细胞和培养基分离所述融合蛋白，
[0056] 其中所述融合蛋白的一个多肽结构域是溶菌酶，其中在步骤（a)中所述融合蛋白 的产量至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍高于不包括溶菌酶 多肽结构域的蛋白的产量。
[0057] 在一个方面，本公开涉及用于融合蛋白的产生的方法，所述方法包括以下步骤，
[0058] (a)在宿主细胞中表达所述融合蛋白，和
[0059] (b)从宿主细胞和培养基分离所述融合蛋白，
[0060] 其中所述融合蛋白的一个多肽结构域是溶菌酶，其中在步骤（a)中表达的融合蛋 白不形成任何聚集体或内含体。
[0061] 在本公开的一个实施方式中，少于 50%、40%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、 12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的分离的融合蛋白形成聚集体。 [〇〇62] 在一个方面，本公开涉及用于分离的目标多肽或蛋白的产生的方法，所述方法包 括以下步骤，
[0063] (a)在宿王细胞中表达融合蛋白，其中所述融合蛋白包括所述目标多肤或蛋白和 溶菌酶，和
[0064] (b)分离所述融合蛋白。
[0065] 在本公开的一个实施方式中，从宿主细胞分离融合蛋白。在进一步的实施方式中， 从培养基分离融合蛋白。在优选的实施方式中，从宿主细胞和培养基分离融合蛋白。
[〇〇66] 在一个方面，本公开涉及用于分离的单体多肽或蛋白的产生的方法。在一个方面， 本公开涉及用于分离的单体的目标多肽或蛋白的产生的方法。在优选的实施方式中，多肽 或蛋白具有生理学上的单体组成。在优选的实施方式中，目标蛋白具有生理学上的单体组 成。在优选的实施方式中，目标蛋白是生理学上作为单体表达的细胞表面受体。在优选的 实施方式中，目标蛋白是生理学上作为单体表达的可溶性蛋白。
[0067] 在一个方面，本公开涉及用于分离的单体的目标多肽或蛋白的产生的方法，所述 方法包括以下步骤，
[0068] (a)在宿主细胞中表达融合蛋白，其中所述融合蛋白包括所述单体的目标多肽或 蛋白和溶菌酶，和
[〇〇69] (b)从宿主细胞和培养基分离所述融合蛋白。
[0070] 在本公开的一个实施方式中，在步骤（a)中所述融合蛋白的产量至少2倍、3倍、4 倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍高于不包括溶菌酶的单体的目标多肽或蛋 白的产量。
[0071] 在本公开的一个实施方式中，在步骤（a)中表达的融合蛋白不形成任何聚集体 或内含体。在本公开的优选的实施方式中，少于50%、40%、30%、25%、20%、15%、14%、 13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的分离的融合蛋白形成聚 集体。
[0072] 在本公开的一个实施方式中，溶菌酶是标签。在进一步的实施方式中，溶菌酶是表 达或纯化标签。在优选的实施方式中，溶菌酶是表达和纯化标签。
[0073] 在一个方面，本公开涉及溶菌酶作为标签用于目标多肽或蛋白的产生的用途，其 特征在于，表达与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白以及分离所述与溶菌酶融合的目标多肽或 蛋白。
[0074] 在一个方面，本公开涉及溶菌酶作为标签用于目标多肽或蛋白的产生的用途，其 特征在于，在宿主细胞中表达与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白以及从宿主细胞和培养基分 离所述与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白。
[0075] 在一个方面，本公开涉及溶菌酶作为标签用于目标多肽或蛋白的产生的用途，其 特征在于，在宿主细胞中表达与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白以及从宿主细胞和培养基分 离所述与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白，其中使用溶菌酶特异性抗体来分离所述与溶菌酶 融合的目标多肽或蛋白。
[0076] 在本公开的一个实施方式中，所述与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白的产量至少2 倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍高于不包括溶菌酶多肽结构域的 目标多肽或蛋白的产量。
[0077]
[0078] 术语"多肽"在本文中以本领域技术人员所理解的最广泛的含义使用。多肽包括 至少两个由肽键连接的氨基酸。通常，多肽包括超过30个的氨基酸。
[0079] 术语"蛋白"在本文中也以本领域技术人员所理解的最广泛的含义使用。蛋白包 括一个或多个多肽，其中至少部分多肽具有或能够通过在它的多肽链内和/或在其之间形 成二级、三级或四级结构而获得明确的三维结构排列。蛋白可以是单体的（由一个多肽链 组成）或多聚体的（由两个或更多个多肽链组成）。
[0080] 本文使用的术语"宿主细胞"可以是在外源多肽或蛋白的产生中通常使用的许多 细胞中的任一种，包括真核和原核宿主细胞。本发明的优选的宿主细胞是真核宿主细胞， 如真菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。最优选的是哺乳动物宿主 细胞。在更进一步优选的实施方式中，所述哺乳动物宿主细胞选自CHO细胞（细胞培养 物保藏中心（European Collection of Cell Culture) ;ECACC#85050302)、PER. C6 细胞 (Crucell，Leiden, The Netherlands)、HKB11 细胞（Bayer Healthcare，Berkley/CA，USA) 和HEK293细胞（美国模式培养物收藏所；订单号.CRL-1573)。
[0081] 本文使用的术语"允许[多肽]的表达的条件"是指引起给定多肽的表达的条件。 对宿主细胞条件的有目的的选择能够实现本发明多肽表达的打开（或关闭）。通常，通过向 宿主细胞的生长培养基中添加化学化合物或自然出现的化合物一"诱导物"，带来这样的 条件改变。诱导物的性质取决于所使用的具体启动子而改变。可引起多肽表达的其他条件 变化是增加温度或增加对光线或UV的暴露程度。
[〇〇82] 本文使用的术语"溶菌酶"包含所有天然出现的溶菌酶，如鸡蛋清溶菌酶、合成的 溶菌酶和重组溶菌酶例如人类重组溶菌酶、以及溶菌酶盐。在优选的实施方式中，溶菌酶是 鸡溶菌酶（SEQ ID N0:1)。在一个实施方式中，术语"溶菌酶"是指来自微生物如藻类、古细 菌、细菌、酵母、丝状真菌或原生动物的溶菌酶。在一个实施方式中，术语"溶菌酶"是指来 自哺乳动物、鸟、爬行动物和两栖动物的溶菌酶。在一个实施方式中，术语"溶菌酶"是指小 鼠（SEQIDN0:2)、兔（SEQIDN0:3)、山羊（SEQIDN0:4)、人类（SEQIDN0:5)、牛（SEQ ID N0:6)、大鼠 （SEQ ID N0:7)或猕猴（SEQ ID N0:8)溶菌酶。在优选的实施方式中，本公 开中所使用的溶菌酶与天然出现的生物体所表达的溶菌酶的氨基酸序列共享至少65%、至 少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少 98%、至少99 %或100%的同一性。
[〇〇83] 本文将术语"变体"定义为在一个或多个（数个）特定位置包括一个或多个（数 个）氨基酸残基的改变（如取代、插入和/或缺失）的多肽。可以通过人为干预通过修饰 编码亲本溶菌酶的多核苷酸序列而获得改变的多肽（变体）。亲本溶菌酶可以由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、 SEQ ID NO:8或与这些序列中的一个具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的序列编 码。变体多肽序列优选是在自然中未发现的序列。本发明涉及包括改变的溶菌酶变体，改 变优选是以在一个或多个（数个）位置上的取代和/或插入和/或缺失的形式。
[〇〇84] 本文使用的术语"分离的"是指从来源例如表达它的宿主细胞分离的多肽或蛋白 或其变体。优选地，如通过SDS-PAGE确定的，多肽为至少40%纯，如至少60%纯、至少80% 纯、至少90%纯或至少95%纯。
[0085] 术语"融合蛋白"是指具有至少两个通常不存在于单个天然多肽中的多肽结构域 的单个多肽链。因而，如本文使用的，天然出现的蛋白不是"融合蛋白"。优选地，目标多肽 通过肽键与至少一个多肽结构域融合，融合蛋白也可以在来自不同蛋白的氨基酸部分之间 包含氨基酸连接区。融合到目标多肽的多肽结构域可以增强目标多肽的可溶性和/或表 达，并且还可以提供纯化标签，以允许从宿主细胞或培养上清或两者中纯化重组融合蛋白。 融合到目标多肽的多肽结构域可以融合到目标多肽的N端或C端。
[〇〇86] 术语"重组"是指例如通过化学合成或通过基因工程技术对氨基酸或核酸的分离 片段的操作而得到的两个另外分开的序列片段的人工组合。
[〇〇87] 本文使用的术语"表达"是指功能性末端产物例如mRNA或蛋白（前体或成熟的） 的产生。
[0088] 术语"载体"意在指代能够运载与之连接的另一个多核苷酸的多核苷酸分子。一种 类型的载体是"质粒"，其是指其中可以插入有另外的DNA片段的环状双链DNA环。此外，目 标基因的编码序列可通过细胞转录机制从某些载体转录并进一步被翻译成目标蛋白。此处 将这样的载体称为"表达载体"。通常，重组DNA技术中利用的表达载体经常采取质粒的形 式。在本说明书中，"质粒"和"载体"可互换地使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然 而，本公开意在包括其他形式的这样的表达载体，如病毒载体（例如，复制缺陷型逆转录病 毒、腺病毒和腺病毒相关的病毒），它们起到等同的功能。
[〇〇89] 本文使用的术语"单体的"及其语法上的等同物是指由单个多肽链组成的多肽或 蛋白。本发明的单体多肽或蛋白与另一个多肽或蛋白既不共价地相连或结合或也不非共价 地相连或结合。
[0090] 本文使用术语"标签"，其是指可以连接到第二多肽上的肽或多肽序列。优选地，标 签是纯化标签或表达标签，或两者。
[0091] 本文使用的术语"纯化标签"是指适于多肽的纯化或鉴定的任何肽序列。纯化标 签特异性地结合到对纯化标签具有亲和性的另一个部分上。这些特异性地与纯化标签结合 的部分通常连接到基质或树脂如琼脂糖小球上。特异性地与纯化标签结合的部分包括抗 体、其他蛋白（例如，蛋白A或链霉亲和素）、镍或钴离子或者树脂、生物素、直链淀粉、麦芽 糖和环糊精。示例性的纯化标签包含组氨酸（HIS)标签（如六聚组氨酸肽），其将结合到 金属离子如镍或钴离子上。其他示例性的纯化标签是myc标签（EQKLISEEDL)、Strep标签 (WSHPQFEK)、Flag 标签（DYKDDDDK)和 V5 标签（GKPIPNPLLGLDST)。术语"纯化标签"还包 括"表位标签"，即，由抗体特异性识别的肽序列。示例性的表位标签包括FLAG标签，其由单 克隆抗-FLAG抗体特异性地识别。由抗-FLAG抗体识别的肽序列由序列DYKDDDDK或其大 体相同的变体组成。术语"纯化标签"还包括纯化标签的大体上相同的变体。本文使用的 "大体上相同的变体"是指与原始的纯化标签相比有改变（例如，通过氨基酸替换、缺失或插 入）、但是其保留了纯化标签的与特异性识别纯化标签的部分特异性地结合的特性的纯化 标签的衍生物或片段。
[〇〇92] 本文使用的术语"表达标签"是指可连接到第二多肽上并且认为其能支持重组目 标多肽的可溶性、稳定性和/或表达的任何肽或多肽。示例性的表达标签包含Fc标签和 SUM0标签。原则上，可将任何肽、多肽或蛋白用作表达标签。
[〇〇93] 本文使用的术语"抗体"包含完整的抗体以及它的任何片段或单链。天然出现的 "抗体"是包括通过二硫键相互连接的至少两个重（H)链和两个轻（L)链的蛋白。在优选的 实施方式中，本申请中公开的抗体是"单克隆抗体"。本文使用的术语"单克隆抗体"是指具 有单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物表现出独特的结合位点，其对特定的 表位具有独特的结合特异性和亲和性。
[0094] 本文使用的术语"转染"是指通常用于将外源DNA导入到原核或真核宿主细胞内 的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖转染等等。可以通过本领域技术人员 知晓的任何常规方式对宿主细胞"转染"本发明的载体。例如，转染可以是瞬时转染。因此， 在本发明的某些实施方式中，经由瞬时转染将编码包括目标多肽或蛋白和溶菌酶的所述融 合蛋白的所述基因导入所述真核宿主细胞。
[0095] 如下计算整个说明书和所附的权利要求中使用的术语"％同一性"。利用 CLUSTAL W 算法(Thompson, J. D. , Higgins, D. G. and Gibson, T. J. , Nucleic Acids Research, 22:4673-4680 (1994))，将查询序列与目标序列比对。在对应于最短的比对序列 的窗口上进行比较。比较各个位置上的氨基酸残基，将查询序列中与目标序列具有相同对 应关系的位置的百分比报道为％同一性。
【权利要求】
1. 一种用于产生分离的单体多肽或蛋白的方法，所述方法包括以下步骤， (a) 在宿主细胞中将所述单体多肽或蛋白作为融合蛋白表达，其中所述融合蛋白包括 所述单体多肽或蛋白和溶菌酶，以及 (b) 分离所述融合蛋白。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的产量与不包括溶菌酶的单体多肽 或蛋白相比至少2倍高于其产量。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中少于15%的所述包括单体多肽或蛋白和溶菌酶的 融合蛋白形成聚集体。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细 胞。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用编码所述包括单体多肽或蛋白和溶 菌酶的融合蛋白的表达载体转染所述宿主细胞。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单体多肽或蛋白的长度为至少 100个氨基酸。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白分离自所述宿主细胞、 培养基或两者。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中使用溶菌酶特异性抗体分离所述融合蛋白。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶菌酶是哺乳动物溶菌酶。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶菌酶是溶菌酶的片段、类似 物、同源物、变体或衍生物。
11. 一种试剂盒，其包括编码融合蛋白的表达载体和溶菌酶特异性抗体，所述融合蛋白 包括多肽或蛋白和溶菌酶。
12. 根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述溶菌酶特异性抗体连接在支撑基质上。
13. 根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述支撑基质选自琼脂糖、琼脂糖凝胶、聚丙 烯酰胺、琼脂糖/聚丙烯酰胺共聚物、葡聚糖、纤维素、聚丙烯、聚碳酸脂、硝化纤维、玻璃、 纸和磁性粒子。
【文档编号】C12N15/62GK104066745SQ201380006389
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年1月23日 优先权日:2012年1月23日
【发明者】S·黑特尔, S·耶格, D·道贝特 申请人:莫佛塞斯公司