具有偶氮还原酶活性的微生物的体外检测的制作方法
【专利摘要】本发明涉及至少一种偶氮化合物用于检测样品中的至少一种微生物的用途。更准确地，本发明涉及用于检测生物样品中的具有偶氮还原酶活性的至少一种微生物的方法，包括在于下列中的步骤：将样品与包含至少一种偶氮化合物的反应培养基相接触；孵育所述反应培养基；和检测所述微生物的偶氮化合物还原，其表示所述至少一种微生物的存在。
【专利说明】具有偶氮还原酶活性的微生物的体外检测
[0001] 本发明涉及微生物领域。更具体地，其涉及检测样品中微生物的方法，包括检测所 述微生物对偶氮化合物的还原的步骤。
[0002] 通常，样品中微生物的检测包括将所述样品与反应培养基相接触并检测该反应培 养基中变化（其是微生物存在的标志）的步骤。因此实施的微生物检测方法优选地应基本 不依赖于在其中寻找到微生物的样品的性质，并应有高灵敏度。
[0003] 当反应培养基是固体时，方法包括直接观察细胞或观察菌落的形成。
[0004] 当需要将检测自动化时，复杂程度进一步增加。
[0005] 第一种方法包括通过比浊法或浊度检测，即通过显示反应培养基的不透明度来观 察反应培养基。
[0006] 其他方法，通过自动化或非自动化生物化学途径，利用比色法或荧光检测法的检 测。
[0007] 可以通过pH指示物的方式来检测样品与包含碳水化合物，如葡萄糖的试剂之间 的反应。
[0008] 如专利EP 0 424 293 B1所报道，可以检测样品与还原或氧化还原的发色或荧光 指示物之间的反应。
[0009] 可以使用发色或突光酶合成底物（综述见0代叩3 6七31.，2009;上]\1;[(^013；[01· Methods ;79 (2) :139-55)。这样的底物通常适合于特定的酶活性，并允许在临床、食品或环 境样品中的定向微生物检测。
[0010] 如专利EP 0 790 299 B1所报道，可以，特别是在反应培养基的容器是密封容器 时，显示pH或C02浓度的变化。
[0011] 根据该现有技术，目前的途径仍然在于寻找通用底物，和/或允许快速反应的底 物，和/或可以与复杂样品如食品基质一起使用的底物，和/或允许检测难以检测的微生物 的底物。在这方面，本发明涉及用于检测可存在于样品中的，具有偶氮还原酶活性的至少一 种微生物的新方法，包括在于下列中的步骤：
[0012] ?将样品与包含至少一种偶氮化合物的反应培养基相接触；
[0013] ?孵育所述反应培养基；和
[0014] ?检测所述至少一种微生物对偶氮化合物的还原，其表示所述微生物的存在。
[0015] 偶氮化合物是含一个或多个Rl-N = N-R2型"偶氮"键的分子。其原本已知是用于 纺织、塑料、化妆品和农产品工业中的染料。已经报道了微生物和哺乳动物酶系统降解偶氮 化合物（Xu et al;Anaerobe，16:114-119)。人结肠细菌种类中偶氮还原酶活性的存在甚 至已导致了含有带偶氮交联键的聚合物的前药的合成（Chourasia & Kain，2003 ;J. Pharm. Pharmacet. Sci :6(1) :33-66)。
[0016] 含偶氮键的化合物也被描述为"淬灭剂"，即如专利申请WO 2005/049 849中，其 改变培养基或荧光基团的荧光性质。其随后可以与生物分子如脂、核酸、肽、蛋白等结合。在 这方面，偶氮衍生物被用于制备用来序列特定检测的寡核苷酸：非杂交的寡核苷酸为非荧 光的；当其在其互补靶序列上杂交时，有荧光发射。
[0017] 本 申请人:在本文中描述了，在体外诊断方法中，和在微生物控制方法中，例如在农 产品，制药或化妆品工业或者在环境控制中，实施的偶氮化合物的新用途。
[0018] 为了帮助本发明理解的目的给出下面的定义。
[0019] 术语牛物样品意为用作分析的小部分或少量的分离的种类(species)。这可以是 得自抽取的生物液体的人或动物临床样品，或者得自任何类型食品的食品样品，药物或化 妆品产品，或者来自生产或处理食品或药物或化妆品产品的环境的样品。因此，这种样品可 以是液体或固体。以非限制的方式，可涉及全血、血清、血浆、尿或粪便的临床样品，收集自 鼻、喉、皮肤、伤口或脑脊液的样品，食品、水、饮料如奶、果汁、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱、奶 酪、鱼等的样品，得自于期望用于动物的饲料的样品，特别是如得自动物或植物粉料（meal) 的样品，或者表面或水控制样品。在食品来源样品的情况下，其也指食品基质。
[0020] 该样品可以以非修饰的形式使用，或者根据本领域技术人员已知的方法，在分析 之前可以经过富集、稀释、提取、浓缩或纯化类型的制备。
[0021] 为了本发明的目的，术语"微生物"函盖细菌、酵母、霉菌，以及更广泛的，通常 为单细胞的，肉眼不可见，并可以在实验室中扩增和操作的生物。可以涉及的革兰氏 阴性菌包括下列属的细菌：假单胞菌属（Pseudomenas)、埃希氏菌属（Escherichia)、 沙门氏菌属（Salmonella)、志贺氏菌属（Shigella)、肠杆菌属（Enterobacter)、克 雷伯菌属（Klebsiella)、沙雷氏菌属（Serratia)、变形杆菌属（Proteus)、弯曲菌属 (Campylobacter)、嗜血杆菌属（Haemophilus)、摩氏菌属（Morganella)、弧菌属（Vibrio)、 耶尔森菌属（Yersinia)、不动杆菌属（Acinetobacter)、布拉汉氏菌属（Branhamella)、 奈瑟氏菌属（Neisseria)、布克氏菌属（Burkholderia)、朽 1檬酸菌属（Citrobacter)、哈夫 尼菌属（Hafnia)、爱德华氏菌属（Edwardsiella)、气单胞菌属（Aeromonas)、莫拉氏菌属 (Moraxella)、巴斯德氏菌属（Pasteurella)、普罗威登斯菌属（Providencia)、放线菌属 (Actinobacillus)、产喊杆菌属（Alcaligenes)、博德特氏菌属（Bordetella)、西地西菌属 (Cedecea)、欧文氏菌属（Erwinia)、泛生菌属（Pantoea)、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia)、寡 养单胞菌属（Stenotrophomonas)、黄单胞菌属（Xanthomonas)和军团菌属（Legionella)。
[0022] 可以涉及的革兰氏阳性菌包括下列属的细菌：气球菌属（Aerococcus)、肠球菌属 (Enterococcus)、链球菌属（Streptococcus)、葡萄球菌属（Staphylococcus)、芽抱杆菌属 (Bacillus)、乳杆菌属（Lactobacillus)、李斯特菌属（Listeria)、梭菌属（Clostridium)、 加德纳氏菌属（Gardneralla)、考克氏菌属（Kocuria)、乳球菌属（Lactococcus)、明串珠菌 属（Leuconostoc)、微球菌属（Micrococcus)、Falkamia、孪生球菌属（Gemella)、小球菌属 (Pediococcus)、分支杆菌属（Mycobacterium)和棒状杆菌属（Corynebacterium)。
[0023] 可以涉及的酵母包括下列属的酵母：假丝酵母属（Candida)、隐球酵母属 (Cryptococcus)、酵母属（Saccharomyces)和毛抱子菌属（Trichosporon)。
[0024] 可以涉及的霉菌包括下列属的霉菌：曲霉菌属（Aspergi 1 lus)、镰孢霉属 (Fusarium)、地霉菌属（Geotrichum)和青霉菌属（Penicillium)。
[0025] 术语反应培养基意为包含微生物代谢和/或生长表现所需的所有成分的培养基。 反应培养基可以是固体，半固体或液体。术语"固体培养基"意为，例如，胶凝固体。琼脂是 微生物学中培养微生物用的常规凝胶剂，但也可以使用明胶、琼脂糖或其他天然或人工凝 胶剂。某些制备品是市售的，例如Columbia琼脂、胰酶大豆琼脂、Mac Conkey琼脂、Mueller Hinton琼脂，或者，更广泛地，在Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中描述 的那些。
[0026] 反应培养基可以包括组合的一种或多种成分，如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核 苷酸、矿物质、维生素等。培养基也可以包含染料。作为指导，可以涉及的染料包括埃文斯 蓝、中性红、羊血、马血、遮光剂如氧化钛、硝基苯胺、孔雀石绿、亮绿、一种或多种代谢指示 齐U，一种或多种代谢调节剂等。
[0027] 反应培养基可以是显示培养基或者培养和显示培养基。在第一种情况下，微生物 的培养不是必需的或者在接种前进行，而在第二种情况下，检测和/或表征培养基也组成 了培养用培养基。
[0028] 反应培养基可以包含一种或多种选择性试剂。术语"选择性试剂"意为能够防止 或减缓非目标微生物的微生物生长的任何化合物。非限制地，〇. 〇lmg/L到5g/L之间的浓度 特别适用于本发明。
[0029] 可以涉及的选择试剂包括抗生素、抗真菌剂、胆汁盐、结晶紫、碱性品红、亮绿等。 术语"抗生素"意为能够防止或减缓细菌生长的任何化合物。其主要属于β丙氨酸、糖肽、 氨基糖苷、多肽、磺酰胺或喹诺酮类。
[0030] 术语"抗真菌剂"意为能够防止或减缓酵母或霉菌生长的任何化合物。作为指导， 特别可以涉及两性霉素 Β、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑或放线菌酮。
[0031] 术语"偶氮化合物"意为包含至少一个偶氮基团，即至少一个R「N = N-R2型键的 任何分子。
[0032] 术语"偶氮还原酵"意为无论其结构及其分类，能还原偶氮官能的任何酶。
[0033] 术语"还原"意为实际上偶氮双键（-N = N-)的还原。该还原可以是全部的并导致 两个胺残基（-NH2)的形成，但其也可以是部分的并导致部分还原键的形成，例如-NH-NH-。 [0034] 术语"底物或发色底物"意为能通过可直接或间接检测信号的方式来检测酶或代 谢活性的化合物。优选地，所述酶或代谢活性是微生物的酶或代谢活性。术语"发色底物" 意为能够通过光学信号的变化，如吸收和/或荧光变化的方式来检测酶或代谢活性的化 合物。对于直接检测，该底物可以连接到充当突光或有色标记物的部分（Orenga et al.， J. Microbiol. Methods ;79 (2) :139-55)。对于间接检测，根据本发明的反应培养基可以另 外包含pH指示剂，其对底物消耗引起并显示目标微生物代谢的pH变化敏感。所述pH指示 剂可以是发色基团或荧光基团。可涉及的发色基团的例子包括溴甲酚紫、溴百里酚蓝、中性 红、苯胺蓝和溴甲酚蓝。荧光基团包括，例如，4-甲基伞形酮、羟基香豆素衍生物、荧光素衍 生物或试卤灵衍生物。
[0035] 作为指导，发色底物靶向的酶活性可以属于水解酶类，优选地糖苷酶（osidase)、 酯酶、或肽酶类。优选地，发色底物靶向的酶活性选自：葡糖醛酸苷糖酶、葡萄糖苷酶、半乳 糖苷酶、酯酶、硫酸酯酶和脱氨酶。不必说，根据本发明的方法中使用的偶氮化合物相应为 检测偶氮还原酶活性的底物。
[0036] 术语"孵育"意为达到或保持在适合的温度，通常在20到50°C之间并优选在30到 40°C之间，5分钟到48小时之间，优选地4到24小时之间并更优选地16至24小时之间。
[0037] 术语"检测"意为以肉眼或使用光学仪器辨识目标细菌生长和/或活性的存在。有 利地，当使用的培养基包括发色底物时，检测也可以允许表征目标微生物。
[0038] 术语"淬灭剂"意为降低指定物质荧光强度的成分。淬灭剂可以被定义为通过吸 收激发或发射的能量的灭绝物（extincteur)。淬灭可随之被定义为激发或发射波长的灭 绝或抑制，或者是通过分子上基团的替换，所述替换诱导电子激发能力的改变。术语"基团" 意为含氣的、轻基、疏基、基于碳的，甲基、丙基、丁基、苯基等基团或残基。
[0039] 本发明涉及检测生物样品中至少一种具有偶氮还原酶活性的微生物的方法，包括 在于下列中的步骤：
[0040] a)将样品与包含至少一种偶氮化合物的反应培养基相接触；
[0041] b)孵育所述反应培养基；和
[0042] c)检测所述微生物的偶氮化合物还原，其表示所述至少一种微生物的存在。
[0043] 有利地，步骤c)也允许微生物计数。
[0044] 有利地，根据本发明的方法允许表征（或鉴定）至少一类微生物。也就是说，其使 得可以检测并确定哪类微生物被检测到。
[0045] 大多数偶氮化合物在氧化条件下显色而在还原条件下无色。偶氮化合物的还原可 以导致荧光化合物的形成。因此，优选地，通过测量吸收或荧光的变化来检测偶氮化合物的 还原。优选地，通过着色的消失和/或荧光的出现来检测偶氮化合物的还原。
[0046] 根据本发明，孵育步骤可以有氧或无氧地，也就是说在存在或不存氧气的情况下 进行。具体地，根据本发明检测到的微生物活性与微生物的有氧和/或无氧呼吸代谢关联。 因此大多数微生物具有此类活性。
[0047] 根据特定的实施方式，根据本发明的方法中使用的偶氮化合物可以与荧光基团偶 联，荧光基团的发射波长或激发波长被偶氮化合物的着色所淬灭。
[0048] 根据本发明另一特定实施方式，根据本发明的方法中使用的偶氮化合物可以淬灭 另一种分子的荧光。
[0049] 总结起来，可以：
[0050] ?检测偶氮化合物着色的消失；
[0051] ?检测还原产物的自然荧光；或者
[0052] ?检测与偶氮化合物相偶联的荧光基团或者对应于不同分子的荧光基团，淬灭现 象的消失导致的荧光出现。
[0053] 在优选的荧光基团中，以非限制的方式，可以涉及香豆素，其中有AMC(7_氨 基-4-甲基香豆素）、4-MU(4-甲基-伞形酮）、荧光素衍生物等。
[0054] 荧光基团和偶氮化合物之间的偶联可以是分子内偶联或分子间偶联。术语"分子 内偶联"意为荧光基团共价连接到偶氮化合物。例如，偶氮化合物可以与荧光基团偶联，所 述荧光基团能够在氧化的偶氮化合物的吸收波长下被激发或者发射。显色的氧化偶氮化合 物随后掩盖了荧光。还原之后，化合物脱色并由分子内淬灭现象消失而显示荧光。
[0055] 术语"分子间偶联"意为荧光基团和偶氮化合物为两个不同的化学分子。偶氮化 合物的还原引起了由分子间淬灭现象消失而导致的可能荧光出现。
[0056] 有利地，根据本发明的方法中使用的反应培养基也包含能检测酶活性的至少第二 底物。优选地，所述底物是发色底物，即所述底物的代谢产生着色或荧光。优选地，所述酶 活性不同于偶氮还原酶活性。
[0057] 根据本发明的方法特别适用于食品类型的样品。目前，通过市售试剂盒的方式检 测总菌群使用三种荧光底物并允许在48小时内读取结果。缺点在于某些食品基质与该试 剂盒有交叉反应。也就是说，与食品自身相关的非特异酶反应导致假阳性结果。以偶氮化 合物进行的测试显示，在检测总菌群的该测试中有最大量假阳性结果的食品基质，在使用 偶氮化合物时没有任何背景噪声。
[0058] 因此，有利地，根据本发明的方法可以在固体容器，如微孔板、微量管、微坩埚、毛 细管、或多孔卡如Vitek?卡或Tempo?卡中进行。优选地，反应卡是\Trtek?卡或 TemP〇? 卡。
[0059] 最后，本发明也涉及至少一种偶氮化合物用于检测包含在样品中的至少一种微生 物的用途。
[0060] 下面展开的实施例是为了帮助理解本发明。其是为了说明的目的给出，而不应限 制本发明的范围。
[0061] 实施例1
[0062] 代表10种微生物的10个菌株对具有"偶氮"官能的化合物在35°C 24小时间的还 原测试。
[0063] 在微量滴定板中测试表II所列物种，每个物种由一个菌株代表，对表I中所列底 物的"偶氮"官能的还原。
[0064] 表 I
[0065]
【权利要求】
1. 检测生物样品中至少一种具有偶氮还原酶活性的微生物的方法，包括下列中的步 骤： a) 将所述样品与包含至少一种偶氮化合物的反应培养基相接触； b) 孵育所述反应培养基；和 c) 检测所述微生物对偶氮化合物的还原，其表示所述至少一种微生物的存在。
2. 根据权利要求1的方法，其中步骤c)也能够计数。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中步骤c)能够表征至少一类微生物。
4. 根据权利要求1到3之一的方法，其中通过测量吸光度或荧光的变化来检测所述偶 氮化合物的还原。
5. 根据权利要求4的方法，其中步骤c)对应于检测着色的消失。
6. 根据权利要求4的方法，其中步骤c)对应于检测荧光的出现。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述偶氮化合物的还原导致分子内淬灭的抑制。
8. 根据权利要求6的方法，其中所述偶氮化合物的还原导致分子间淬灭的抑制。
9. 根据权利要求1到8之一的方法，其中所述培养基包含能检测酶反应的至少第二底 物。
10. 根据权利要求9的方法，其中所述第二底物为发色底物，其代谢产生着色或荧光。
11. 根据权利要求1到10之一的方法，其中所述反应培养基是固体或液体培养基。
12. 根据权利要求1到11之一的方法，特征在于其在卡式容器中进行。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述反应卡是Vitek?或Tempo?卡。
14. 根据权利要求1到13之一的方法，其中所述样品是食品基质。
15. 至少一种偶氮化合物用于检测样品中的至少一种微生物的用途。
【文档编号】C12Q1/04GK104114712SQ201380006119
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年1月18日 优先权日:2012年1月19日
【发明者】A·詹姆斯, C·罗歇-达伯特, C·梅西耶, S·奥伦加 申请人:生物梅里埃公司