一种具有偶氮还原能力的新菌种及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株Sinibacillussoli?CGMCC?No.1.12538及其在偶氮染料金橙I还原脱色中的应用。本发明从热带雨林的土壤中分离纯化得到一株Sinibacillussoli菌株GD05，其具有在厌氧条件下利用电子供体对偶氮染料金橙I进行还原脱色的作用，且脱色率可达到83%，是一种有效的处理偶氮染料废水的生物体系，在水环境修复方面具有广泛的应用前景。
【专利说明】一种具有偶氮还原能力的新菌种及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株新菌种及其在环境工程中的应用，具体涉及一株兼性厌氧菌GD05的分离鉴定，及其在偶氮染料还原脱色中的应用，属于微生物系统分类和环境生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]偶氮染料广泛应用于印染、食品、化妆品等行业，据估计，每年偶氮染料的产量为世界染料总产量的70%左右，是工业中染料用量最大的一类。废水中残存的染料组分即使浓度很低，排入水体也会影响光对水的透过性和水生生物的生长，破坏水体生态平衡。印染和染料废水色度大；有机物浓度高，组分复杂；难生物降解物质多；含有大量的无机盐、硫化物等，属于难处理的工业废水。多数染料为有毒难降解有机物，化学稳定性强，具有致癌、致畸、致突变的“三致”作用。目前处理染料废水的工艺主要利用物理/化学方法，如吸附、沉淀、化学氧化、光降解和膜过滤等。这些方法对染料废水的处理能力有限，能耗大、成本高，且容易造成二次污染。因此，开发一种更为有效的处理偶氮染料废水的生物体系引起人们的广泛兴趣。
[0003]近年来发展起来的微生物法处理印染废水不仅能有效的进行偶氮染料脱色处理而且成本低，受到广泛的关注。尽管好氧/厌氧条件下细菌对偶氮染料的还原脱色已有一定研究，然而，生物处理过程中大多数菌株的广谱性较差，环境适应性能力较弱，脱色速度不能满足实际废水处理的要求。
[0004]芽孢杆菌科是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧生活，主要分布于土壤、植物体表面及水体中。由于芽孢杆菌科的细菌对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品等有很强抗性，因而很多特殊功能的芽孢杆菌科菌株已应用于工业、农业、医学、军事和科学研究等领域。此外，大量研究表明，芽孢杆菌科的细菌是多种环境中的偶氮染料脱色优势细菌，因此，加强芽孢杆菌科新菌种的分离和保藏、发掘新的潜在的偶氮染料脱色菌种不仅对于微生物分类、鉴定工作具有积极意义，而且对于资源利用、水循环和生态修复有着重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一株新菌种:Sinibacillus soli gen.nov., sp.nov.⑶05。
[0006]本发明的另一个目的在于提供上述菌株在偶氮染料还原脱色中的应用。
[0007]本发明的再一个目的在于提供一种含有兼性厌氧菌Sinibacillus soli gen.nov.，sp.nov.⑶05的偶氮染料还原脱色生物制剂。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
申请人:将菌株保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏中心于2013年4月2日收到 申请人:提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CGMCC1.12538，建议的分类命名为Sinibacillus soli⑶05，已于2013年10月9日鉴定保藏的菌株是存活的。
[0009]本发明的有益效果是:
本发明的菌株Sinibacillus soli gen.nov.，sp.ηον.⑶05,在厌氧条件下可利用乙酸钠、乳酸钠、葡萄糖作为电子供体，对偶氮染料金橙I具有还原脱色作用，且脱色率可达到83%。本发明的菌株对染料废水的处理能力大、能耗小、成本低，不容易造成二次污染，不会破坏水体结构，是一种有效的处理偶氮染料废水的生物体系，在水环境修复方面具有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为负染色菌株⑶05细胞的扫描电镜图，A为单个⑶05细菌图，长有一些极性鞭毛，B为多个GD05细菌图，有呈笔直的长杆状，也有稍弯曲的长杆状，即有单个细菌单独生存，也有多个细菌首尾相连呈短链状生存；
图2基于16S rRNA基因序列相似度，采用Neighbor-joining法构建的菌株⑶05的系统发育树；
图3基于16S rRNA基因序列相似度，采用Minimum-evolution法构建的菌株⑶05的系统发育树；
图4菌株GD05极性脂肪酸的二维薄层色谱(TLC)图，A为磷钥酸盐显色检测图，B为钥蓝显色检测图，DPG表示双磷脂酰甘油，PG表示磷脂酰甘油，L表示未经鉴定的极性脂肪酸；图5菌株在GD05不同电子受体下厌氧还原金橙I的情况；
图6菌株GD05对不同初始浓度的金橙I的还原脱色能力。
【具体实施方式】
[0011]一、菌株⑶05的分离和富集
I)将IOg取自广东省徐闻县热带雨林的土壤样品加入IOOmL0.85% (g/mL)NaCl溶液，搅拌30min后，进行梯度稀释，涂布于TSA (pH7.2)培养基上，分别在50°C、60°C、70°C条件下进行培养。
[0012]2) 5天后，挑取单菌落，并涂布于新的TSA (pH7.2)培养基上，分别置于原来的温度下继续培养，进一步分离和纯化菌体。
[0013]所述TSA培养基的组成是:胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，D (+)-葡萄糖 2.5g，NaC15.0g/L, Κ2ΗΡ042.5g，琼脂粉 20g/L, pH 调节至 7.2。
[0014]3)重复步聚2)，直到获得单克隆菌落，其中分离和富集得到的菌株⑶05在50°C和60°C下能生存。
[0015]二、菌株⑶05的形态特征
O菌体形态特性
菌株⑶05为革兰氏阳性菌，产球形或椭圆形端生芽孢；透射电子显微镜结果(图1)显不菌体呈直长杆状或稍弯曲长杆状，宽约0.3~0.4 μ m,长约1.4~2.9 μ m,有极性鞭毛用于运动，(如图1A所示)；菌体即可以单独存在，又可以与其他菌体首尾相连呈短链状存在(如图1B所示)。[0016]2)菌落形态特性
菌株⑶05在50°C条件下，TSA上培养48h后，菌落直径约2mm，菌落呈圆形、稍微隆起、边缘整齐、表面光滑。
[0017]三、菌株⑶05的分子分类地位
提取发明菌株⑶05的总DNA。以提取的DNA为模板，以通用引物27F和1492R扩增细菌的16S rRNA基因，将PCR扩增产物回收纯化后进行测序，所得序列(1489bp)通? BLAST (http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi) _ I:匕又寸工t匕又寸，结 ^
显示，与菌株⑶05同源性相近的菌株都属于芽孢杆菌科，分别是Ornithinibacilluscontaminans (相似性 94.9%), Ornithinibacillus bavariensis (相似性 94.5%)和Virgibacillus kekensis (相似性 93.9%)。Ornithinibacillus 属和 Virgibacillus 属的其他菌株及OceanobaciIIus属的所有菌株与菌株⑶05的16SrRNA序列的相似性分别在93.9~93.6%,93.7~91.5%和93.6~91.6%范围内。上述比对结果显示新分离出的菌株GD05与所有芽孢杆菌科成员的相似性不超过95%。
[0018]通过 EzTaxon server2.I 网站的在线比对工具(http: //eztaxon~e.ezbiocloud.net/;Kim et al.，2012)进行序列相似性计算。将菌株⑶05及其相近菌株的16S rRNA序列通过CLUSTALX.1.8进行多序列比对分析后，米用Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis (Mega, Version2.1)软件作系统发育分析，分别采用Neighbor-joining和Minimum-evolution方法构建系统进化树,进化树用1200次重复取样的bootstrap方法验证。Neighbor-joining 和 Minimum-evolution 构建方法中的 bootstrap 值分别为 74% 和75%，进一步确证了这两种新分离菌株在系统发育中的位置，两种方法构建的进化树均显示了菌株GD05属于芽孢杆菌科，且代表分类学上的新属。
[0019]基于上述16S rRNA序列的相似性和进化树数据，与新分离菌株⑶05亲缘最近的三个属分别为 Ornithinibacillus 属、Virgibacillus 属和 Oceanobacillus 属，分别米用它们的模式种菌株 Ornithinibacillus bavariensis DSM156811"、Virgibacilluspantothenticus Dsicel^pioceanobacillus iheyensis DSM143711"作为对照，研究新分离菌株⑶05的相关特性。
[0020]四、菌株⑶05的生理生化分析
为了进一步了解菌株GD05，根据标准程序测试该菌株相关生理生化特征。
[0021]首先,表1列举了菌株⑶05与亲缘关系最近三个属的模式株Ornithinibacillusbavariensis DSM156811"、Virgibacillus pantothenticus DSM26T 和 Oceanobacillusiheyensis DSM14371T之间具有差异的表形特征、 生理和生化特征。
[0022]表1菌株⑶05与近缘属的模式株间的差异特征
【权利要求】
1.一种兼性厌氧菌gen.nov.，sp.nov.GD05，保藏在普通微生物菌种保藏中心，其保藏号为CGMCC 1.12538。
2.根据权利要求1所述兼性厌氧菌如&77心soligen.nov.，sp.nov.(iD05在偶氮染料还原脱色中的应用。
3.—种偶氮染料还原脱色生物制剂，其特征在于:所述制剂中含有权利要求1所述的兼性厌氧菌 Sinibacillus soli gen.nov.，sp.nov.GD05。
【文档编号】C12R1/01GK103667113SQ201310567428
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】杨贵芹, 周顺桂, 庄莉 申请人:广东省生态环境与土壤研究所