miR-218模拟物、其应用以及一种筛选能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的方法
【专利摘要】一种筛选能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的方法，步骤包括：利用定量PCR法检测待筛选药物对Bmi1转录水平的抑制作用；将待筛选药物转染胶质瘤细胞后利用Trizol法提取总RNA，消化DNA后，利用反转录试剂盒反转录成cDNA，定量PCR法检测Bmi1转录水平；利用划痕法对胶质瘤细胞的迁移进行检测；利用transwell法对胶质瘤细胞的侵袭进行检测。本发明工艺简单，成本低，能够有效的筛选出对胶质瘤细胞的迁移和侵袭活性具有抑制作用的药物。本发明还公开了一种RNA分子miR-218模拟物及其在抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物中的应用。
【专利说明】mi R-218模拟物、其应用以及一种筛选能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术的应用领域,特别涉及一种miRNA的应用。
【背景技术】
[0002]胶质瘤是临床上最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，约占所有原发性颅内肿瘤的45%左右。按胶质瘤的恶性程度分为I 一 IV级，级别愈高，其恶性程度愈大。在所有胶质瘤病人中，25%~50%的为II级；50%~75%的为III级；75%~100%为IV级。恶性度高者瘤内常有坏死与出血，血管丰富，血管外层及内皮细胞均有明显增生，除手术切除外，胶质瘤的药物疗效和放疗效果都不甚理想，因此胶质瘤是疗效最差的恶性肿瘤之一，据统计，胶质瘤病人的一年总生存率低于30%，级别高的病人中位生存期只有大概15个月。胶质瘤预后差的一个主要原因为胶质瘤的高度侵袭能力，恶性程度高的胶质瘤呈浸润性生长，肿瘤成份与正常脑组织的分界模糊，手术往往不能将肿瘤组织完整切除，术后胶质瘤的复发率较高。复发的胶质瘤中，超过90%起源于手术区的浸润瘤细胞或手术区边缘的癌细胞。理解胶质瘤的迁移机制，寻找和发现新的胶质瘤发生、发展和预后密切相关的基因和信号途径对于胶质瘤的分子干预具有重要的意义。
[0003]原癌基因Bmil (B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertionsitel)是在1991年首次被报道，属于多梳基因家族(Polycomb Group genes, PcG)成员，是与细胞周期转换和细胞增殖相关的重要转录抑制因子，直接参与细胞生长、增殖的调节，Bmil基因在多种恶性肿瘤如胶质瘤、肺癌、白血病、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等中大量表达，并且与这些肿瘤的侵袭、转移、预后密切相关。INK4a/ARF是Bmil基因调节细胞增殖和老化的靶点，在Bmil缺陷的小鼠成纤维细胞(MEF)和淋巴细胞中，INK4a/ARF表达水平明显升高，相反，Bmil过度表达的MEF细胞中INK4a/ARF蛋白下调，细胞可发生永生化，所以Bmil通过抑制INK4a/ARF基因的表达来维持细胞的自我更新。Bmil在人胶质瘤细胞中高表达，并且敲除Bmil的胶质瘤细胞在体成瘤能力减弱。
[0004]MicroRNA (miR,也称miRNA)是一类长度为20-25核苷酸的非编码的单链RNA，是由具有发夹结构的约70-90个核苷酸大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，通过与mRNA互补结合在转录后水平抑制靶基因的表达，参与调控心脏疾病、血管疾病、神经和肿瘤等多种疾病的发生和发展过程。肿瘤的侵袭性是区别恶性肿瘤和良性肿瘤的重要生物学特征，也是目前恶性 肿瘤难以治愈最终导致死亡的重要原因，因此研究肿瘤侵袭的调控机制一直是肿瘤领域的主要方向。但是肿瘤的侵袭是一个多基因参与的复杂调控过程，所以能够同时调控多个靶基因表达的mircoRNA自从发现之日起就成为了肿瘤发生和侵袭过程中研究热点。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的筛选方法，该方法工艺简单，成本低，应用该方法成功筛选并验证了 miR-218模拟物具有抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭的效果，从而达到抑制胶质瘤的目的。
[0006]本发明的第一方面，涉及一种RNA分子miR-218模拟物，其碱基序列包含miR-218核酸序列“茎-环”结构的发夹状结构，主序列如下:5’ -UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’ (SEQID N0.3)。
[0007]本发明的第二方面，涉及根据本发明第一方面的RNA分子miR-218模拟物在抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物中的应用。
[0008]本发明的第三方面，涉及一种筛选能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的方法，其中所述药物为miRNA或其模拟物，步骤包括:
[0009](1)利用定量PCR法检测待筛选药物对Bmi 1转录水平的抑制作用；
[0010]将待筛选药物转染胶质瘤细胞后利用trizol法提取总RNA，消化DNA后，利用反转录试剂盒反转录成cDNA,定量PCR法检测Bmil转录水平。
[0011]扩增Bmil的引物如下:
[0012]Bmil 基因上游引物 Bmil-F:GCTTCAAGATGGCCGCTTG (SEQ ID N0.1)，
[0013]Bmil 基因下游引物 Bmil-R:TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC (SEQ ID N0.2)；[0014](2)利用划痕法对胶质瘤细胞的迁移进行检测；
[0015](3)利用transwell法对胶质瘤细胞的侵袭进行检测。
[0016]优选地，所述步骤(1)中定量PCR体系为:10μ 1的Premix Ex Taq (SYBR qPCR)(2X)，10ymol/L的Bmil上下游上下游引物各0.5μ 1，待检cDNA模板或阴性对照1μ 1，加灭菌去离子水补足体积至20 μ 1。
[0017]优选地，步骤(1)中PCR反应条件为:95°C预变性30s ;然后95。。15s，60°C 20s，72°C 20s，反应40个循环。
[0018]步骤(2)中采用“划痕法”对胶质瘤细胞的迁移进行检测的步骤为，用待筛选药物转染胶质瘤细胞48小时后换无血清的胶质瘤细胞培养液继续培养细胞12h对其进行饥饿干预。用灭菌枪头匀速匀力的向一个方向划单层胶质瘤细胞，每孔平行的划1次，形成1条无细胞划痕区。PBS清洗细胞2次，加入无血清的胶质瘤细胞培养液。在0小时，12小时和24小时显微镜下观察划痕两侧的距离变化并计算刺激前后划痕两侧的距离。
[0019]步骤(3)中，利用transwell法对胶质瘤细胞的侵袭进行检测的步骤为，待筛选药物转染胶质瘤细胞48小时后换无血清的胶质瘤细胞培养液稀释，种5X 105个细胞在transwell小室中，外面加入胶质瘤细胞培养液，培养48小时后，用棉签擦去上层未侵袭的细胞，用甲醇固定lOmin后空气中晾干，加入DAPI染核，在荧光显微镜下观察并拍照，随机数10个视野中的细胞数目，判断带筛选药物能否抑制胶质瘤细胞侵袭。
[0020]进一步地，上述筛选能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的方法，在步骤(1)之前还包括步骤:构建pmirGL0_Bmil3’ -UTR和pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut重组质粒，两种质粒分别与待筛选药物共转染工具细胞293T细胞株。
[0021]重组质粒pmirGL0-Bmil3’ -UTR的构建方法为:根据NCBI上Bmil的序列(BC011652.2)人工合成了含有miR-218结合位点的长度为390bp的3’_UTR序列，两端含有的酶切位点为Sac I, Xbal,利用这两位点连接入pmirGLODual-Luciferase miRNA TargetExpression Vector 载体(promega)。插入序列如下:[0022]>Bmil-wt
[0023]ACATTTCATTGTCCCCAGTCTGCAAAAGAAGCACAATTCTATTGCTTTGTCTTGCTTATAGTCATTAAATCATTACTTTTACATATATTGCTGTTACTTCTGCTTTCTTTAAAAATATAGTAAAGGATGTTTTATGAAGTCACAAGATACATATATTTTTATTTTGACCTAAATTTGTACAGTCCCATTGTAAGTGTTGTTTCTAATTATAGATGTAAAATGAAATTTCATTTGTAATTGGAAAAAATCCAATAAAAAGGATATTCATTTAGAAAATAGCTAAGATCTTTAATAAAAATTTGATATGAAAAGCACAATGTGCAGAAGTTATGGAAAACCTATAGAGGATTACAACAGGTAAACGTTAAAGAGAATACATTGCTGACTTAT (SEQ ID N0.4)
[0024]重组质粒pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut的构建方法为:根据NCBI上Bmil的序列(BC011652.2)人工合成了含有miR-218结合位点突变的长度为390bp的3‘_UTR序列，具体突变是将pmirGL0-Bmil3’-UTR中的两处长度为8bp的序列:AAGCACAA替换为TTTGTGTT。两端含有的酶切位点为Sac I, Xbal,利用这两位点连接入pmirGLO Dual-Luciferase miRNATarget Expression Vector 载体(promega)。插入序列如下:
[0025]>Bmil_mut
[0026]ACATTTCATTGTCCCCAGTCTGCAAAAGTTTGTGTTTTCTATTGCTTTGTCTTGCTTATAGTCATTAAATCATTACTTTTACATATATTGCTGTTACTTCTGCTTTCTTTAAAAATATAGTAAAGGATGTTTTATGAAGTCACAAGATACATATATTTTTATTTTGACCTAAATTTGTACAGTCCCATTGTAAGTGTTGTTTCTAATTATAGATGTAAAATGAAATTTCATTTGTAATTGGAAAAAATCCAATAAAAAGGATATTCATTTAGAAAATAGCTAAGATCTTTAATAAAAATTTGATATGAATTTGTGTTTGTGCAGAAGTTATGGAAAACCTATAGAGGATTACAACAGGTAAACGTTAAAGAGAATACATTGCTGACTTAT (SEQ ID N0.5)
[0027]重组质粒图谱如图1所示。
[0028] 进一步地，上述筛选能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的方法，在步骤(1)之后，还包括步骤:利用Western blot法检测待筛选药物对Bmil蛋白表达的抑制作用。具体步骤为:
[0029]按每孔50 μ g蛋白上样量等量上样。以400mA恒压转膜lOOrnin。将膜放入放入1%酪蛋白/TBS中于室温下振荡封闭lh。加入TBST稀释后的Bmil抗体(Cell SignalingTechnology)或对照 a-tubulin(Santa Cruz Biotechnology)抗体一抗(Bmil 抗体按 2:1000稀释，抗a-tubulin抗体按1:2000稀释)，4°C振荡孵育过夜。吸净一抗，TBST漂洗膜10minX3 ;加入稀释后的二抗(均为1:4000稀释)，水平摇床室温孵育lh。吸净二抗，TBST漂洗膜，10minX4，混合ECL (A:B=100:1液)，充分覆盖湿润NC膜表面，静置lmin ;于暗室中用保鲜膜将NC膜封好，将X光片平放于NC膜上显影并记录数据。
[0030]有益效果
[0031]本发明工艺简单，成本低，能够有效筛选出可以抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭活性的药物，同时为胶质瘤的防治提供有效干预靶点。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为重组质粒图谱；
[0033]图2为计算机软件分析显示Bmil的3’非翻译区存在两个miR-218的作用靶点；
[0034]图3显示了 miR-218模拟物能够抑制携带Bmil靶序列荧光素酶的相对活性；
[0035]图4显示了 miR-218模拟物能够抑制Bmil在转录水平的表达；[0036]图5显示了 miR-218模拟物能够抑制Bmil在蛋白质水平的表达；
[0037]图6显示了 miR-218模拟物有效减少胶质瘤细胞的迁移；
[0038]图7显示了 miR-218模拟物有效减少胶质瘤细胞的侵袭。
[0039]本发明中所述生化试剂及生物材料均可从市售渠道获得，比如工具细胞293T细胞株可以通过上海拜力生物科技有限公司购买获得，胶质瘤细胞(U251)购自中国科学院细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，Bmil抗体购自Cell SignalingTechnology)公司。
【具体实施方式】
[0040]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0041]实施例1
[0042]1.miR-218靶基因的筛选
[0043]运用PicTar、TargetScan等软件检索miR-218可能的祀基因，发现Bmil基因的3’非翻译区(3’ UTR)含有2个miR-218的靶位点(附图2)。因此miR-218类似序列可能具有抑制原癌基因Bmil表达的功能。
[0044]2.报告基因验证Bmil是miR-218的靶基因
[0045]构建pmirGL0_Bmil3’ -UTR 和 pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut 重组质粒
[0046]构建方法:人工合成了含有miR-218结合位点的Bmi 13 ’ -UTR的长度为390bp的序列，通过限制性内切酶Sac I, Xbal连接入相同酶切的pmirGLO Dual-LuciferasemiRNA Target Expression Vector 载体中即获得 pmirGL0_Bmil3’ -UTR 载体。将pmirGL0-Bmil3’ -UTR两处长度为8bp的序列:AAGCACAA替换为TTTGTGTT就构建成pmirGL0_Bmil3，-UTR - mut 载体。
[0047]pmirGL0-Bmil3’ -UTR载体中将含有可以与miR-218结合的位点Bmil3’ -UTR序列与萤火虫荧光素酶基因融合，使转录出来的萤火虫荧光素酶3’ -UTR含有miR-218的结合位点，这样在和miR-218共转染的时候，miR-218将会通过与结合位点的结合在转录后水平抑制萤火虫荧光素酶的表达。在pmirGL0-Bmil3’ -UTR - mut载体中miR-218结合位点被突变掉，所以与miR-218共转染的时候不会影响萤火虫荧光素酶的表达。载体中海参荧光素酶作为内参，测定萤火虫荧光素酶与海参荧光素酶的活性比值就可以确定系统中萤火虫荧光素酶的含量，进而判断出预测的miR-218结合位点是否真的和miR-218结合。具体方法:将 pmirG LO 空载体,pmirGL0-Bmil3’ -UTR 载体与 pmirGL0_Bmil3’ -UTR - mut 分别与miR-218模拟物共转染工具细胞293T，转染24h后用专用裂解液裂解细胞，每孔100 μ 1，打均匀，充分裂解后样品备用。采用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒，在1.5ml离心管中加入LARII50 μ 1和裂解液5 μ 1混匀，酶标仪检测萤火虫荧光素酶；加入50 μ 1 Stop&Glo溶液灭活萤火虫荧光素酶，酶标仪检测海参荧光素酶，计算萤火虫荧光素酶与海参荧光素酶的比值。结果显示，转染miR-218的模拟物后荧光素的表达下降了约50%左右，而突变与miR-218的模拟物结合位点以后萤火虫荧光素酶的表达恢复(见附图3)，证明Bmil是miR-218的直接靶基因。
[0048]3.利用定量PCR法和Western blot法检测miR-218模拟物对Bmil转录水平和蛋白表达的抑制作用
[0049]miR-218模拟物或miR-对照转染胶质瘤细胞72小时后利用trizol法提取总RNA，消化DNA后，利用反转录试剂盒反转录成cDNA ;定量PCR体系为:10 μ 1的Premix Ex Taq(SYBR qPCR) (2X )，10 μ mol/L的Bmil上下游引物各0.5 μ 1，待检cDNA模板或阴性对照1 μ 1，加灭菌去离子水补足体积至20 μ KPCR反应条件为:95°C预变性30s ;然后95°C 15s,60°C 20s,72°C 20s，反应40个循环。发现增加了 miR-218模拟物在胶质瘤细胞的表达量后，Bmil转录水平的表达量明显下降。
[0050]miR-218模拟物或miR-对照转染胶质瘤细胞72小时后，收集细胞蛋白样品进行电泳。电泳时，按每孔50 μ g蛋白上样量等量上样。以400mA恒压转膜lOOmin。将膜放入放入1%酪蛋白/TBS中于室温下振荡封闭lh。加入TBST稀释后的Bmil抗体(Cell SignalingTechnology)或对照 a-tubulin(Santa Cruz Biotechnology)抗体一抗(Bmil 抗体按 2:1000稀释，抗α-tubulin抗体按1:2000稀释)，4°C振荡孵育过夜。吸净一抗，TBST漂洗膜10minX3 ;加入稀释后的二抗(均为1:4000稀释)，水平摇床室温孵育lh。吸净二抗，TBST漂洗膜，10minX4，混合ECL (A:B=100:1液)，充分覆盖湿润NC膜表面，静置lmin ;于暗室中用保鲜膜将NC膜封好，将X光片平放于NC膜上显影并记录数据。结果可见，增加了miR-218模拟物在胶质瘤细胞的表达量后，Bmil蛋白的表达量明显下降。(见附图5) [0051]4.胶质瘤细胞的迁移实验
[0052]采用“划痕法”对胶质瘤细胞的迁移活性进行研究。miR-218模拟物或miR-对照转染胶质瘤细胞48小时后换无血清的胶质瘤细胞培养液继续培养细胞12h对其进行饥饿干预。此时细胞应布满培养板底，形成单层细胞。用200 μ 1灭菌枪头匀速匀力的向一个方向划单层胶质瘤细胞，每孔平行的划1次，形成1条无细胞划痕区。PBS清洗细胞2次，加入无血清的胶质瘤细胞培养。在显微镜下用记号笔在培养板底部为细胞划痕边缘做记号并拍摄照片。在0小时，12小时和24小时镜下观察划痕两侧的距离变化并拍照。用Image-proplus6.0软件计算刺激前后划痕两侧的距离。结果发现，转染miR-对照的胶质瘤细胞迁移活性大大增加，划痕愈合为12小时是25.1%, 24小时为43.2%。而运用miR-218模拟物增加胶质瘤细胞miR-218的表达量能够明显抑制胶质瘤细胞向划痕区的迁移，划痕愈合率为12小时是19.2%24小时为34.2%(见附图6)。
[0053]5.胶质瘤细胞的侵袭实验
[0054]利用transwell法对胶质瘤的侵袭活性进行研究。miR-218模拟物或miR-对照转染胶质瘤细胞48小时后换无血清的胶质瘤细胞培养液稀释，种5X 105个细胞在transwell小室中，外面加入胶质瘤细胞培养液，培养48小时后，用棉签擦去上层未侵袭的细胞，用100%甲醇固定lOmin后空气中晾干，加入DAPI染核，在荧光显微镜下观察并拍照，随机数10个视野中的细胞数目，发现运用miR-218模拟物增加胶质瘤细胞miR-218的表达量能够明显抑制胶质瘤细胞侵袭(见附图7)。
[0055]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本【技术领域】中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【权利要求】
1.一种RNA分子miR-218模拟物，其碱基序列包含如下序列:5，-U腳GCUUGAUCUAACCA腳-3'
2.如权利要求1所述的RNA分子miR-218模拟物在抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物中的应用。
3.一种筛选能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的方法，其中所述药物为miRNA或其模拟物，步骤包括:(1)利用定量PCR法检测待筛选药物对Bmil转录水平的抑制作用；将待筛选药物转染胶质瘤细胞后利用Trizol法提取总RNA，消化DNA后，利用反转录试剂盒反转录成cDNA，定量PCR法检测Bmil转录水平。扩增Bmil的引物如下:Bmil 基因上游引物 Bmil-F:GCTTCAAGATGGCCGCTTG,Bmil 基因下游引物 Bmil-R:TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC ；(2)利用划痕法对胶质瘤细胞的迁移进行检测；(3)利用transwell法对胶质瘤细胞的侵袭进行检测。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(1)中的定量PCR体系为:10μ1的PremixEx Taq (2X )，10 μ mol/L的Bmil上下游引物各0.5 μ 1，待检cDNA模板或阴性对照1 μ 1，加灭菌去离子水补足体积至20 μ 1。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述步骤(1)中的PCR反应条件为:95°C预变性30s ;然后 95°C 15s，60°C 20s，7`2°C 20s，反应 40 个循环。
6.如权利要求3所述的方法，其中，步骤(2)中采用“划痕法”对胶质瘤细胞的迁移进行检测的步骤为，用待筛选药物转染胶质瘤细胞48小时后换无血清的胶质瘤细胞培养液继续培养细胞12h对其进行饥饿干预。用灭菌枪头匀速匀力的向一个方向划单层胶质瘤细胞,每孔平行的划1次，形成1条无细胞划痕区。PBS清洗细胞2次，加入无血清的胶质瘤细胞培养液。在0小时，12小时和24小时显微镜下观察划痕两侧的距离变化并计算刺激前后划痕两侧的距离。
7.如权利要求3所述的方法，其中，步骤(3)中，利用transwell法对胶质瘤细胞的侵袭进行检测的步骤为，待筛选药物转染胶质瘤细胞48小时后换无血清的胶质瘤细胞培养液稀释，种5X105个细胞在transwell小室中，外面加入胶质瘤细胞培养液，培养48小时后，用棉签擦去上层未侵袭的细胞，用甲醇固定lOmin后空气中晾干，加入DAPI染核，在荧光显微镜下观察并拍照，随机数10个视野中的细胞数目，判断带筛选药物能否抑制胶质瘤细胞侵袭。
8.如权利要求3所述的方法，其中，在步骤(1)之前还包括步骤:构建pmirGL0_Bmil3’ -UTR和pmirGL0-Bmil3’ -UTR-mut重组质粒，两种质粒分别与待筛选药物共转染工具细胞293T细胞株。
9.如权利要求3所述的方法,其中，在步骤(1)之后,还包括步骤:利用Westernblot法检测待筛选药物对Bmil蛋白表达的抑制作用。
【文档编号】C12Q1/68GK103740809SQ201310567075
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】金卫林, 高兴春, 涂艳阳, 崔大祥 申请人:上海交通大学