一种深红紫链霉菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种深红紫链霉菌（Streptomycesviolaceorubidus）JG-1CGMCCNo.7921及其应用。通过从吉尔吉斯斯坦贾拉拉巴州Kyzyl-Suu(N41°18’25.12E72°57’46.15)野生核桃林中取样，分离、筛选、生理生化鉴定，确定该菌种本发明提供的深红紫链霉菌（Streptomycesviolaceorubidus）JG-1CGMCCNo.7921具有蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶阴性，α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶阳性，可广泛用于α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶生产领域。
【专利说明】一种深红紫链霉菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物菌种及其应用领域，具体的说，本发明涉及一种深红紫链霉菌及其应用的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]放线菌类群是十分重要的高G+C含量的革兰阳性细菌，它们的培养形态与细菌有本质区别，大多数产生菌丝结构，包括培养基中的基质菌丝和培养基表面的气生菌丝及孢子丝。迄今已发表145个属，约2000个种，其中链霉菌属中约500个种。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等各种酶制剂、维生素(B12)和有机酸等。此外，放线菌还可用于留体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。
[0003]放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等各种酶制剂、维生素和有机酸等。此外，放线菌还可用于留体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。
[0004]而链霉菌分类属于细菌界、厚壁菌门、放射细菌纲、放射细菌亚纲、放线菌目、链霉菌亚目、链霉菌科中惟一的一个特大属，是放线菌的典型代表。链霉菌属
是至今放线菌中种类最多，数量最大的一个属，已知种达500多个，广泛分布于自然界。广泛分布于含水量较低、通气良好、有机质丰富和微碱性的土壤中，在淡水、海水及其淤泥中也有分布。少数种类是人体和动植物的病原菌。有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化为营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。孢子丝再形成分生孢子。孢子丝和孢子的形态、颜色因种而异，是分种的主要识别性状之一。已报道的有千余种，主要分布于土壤中。已知放线菌所产抗生素的90%由本属产生。菌丝纤细、无隔、多核、分枝，革兰氏阳性，菌丝体发达，分化成基内菌丝和气生菌丝，后者成熟后发育成孢子丝，其形态多样(直、波曲、螺旋、轮生)，可裂生大量分生孢子进行散播、繁殖。菌落小而致密、干而不透明，幼时表面光滑、边缘整齐、颜色单调、不易挑起，继而发展成绒毛状、表面起粉、色泽丰富，正反面颜色往往不同。各个种都能利用葡萄糖。有较强的淀粉和蛋白质水解能力(尤其是角蛋白)。链霉菌是一类具有重要药用价值的微生物，早期发现的抗生素绝大多数是由该属的菌种产生，如抗细菌抗生素链霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素、四环素、新生霉素等，抗真菌抗生素灰黄霉素以及抗肿瘤抗生素柔红霉素、丝裂霉素、平阳霉素等。70年代后，随着疾病相关分子靶标的不断揭示和筛选新模型的不断建立，从链霉菌的代谢产物中又发现了大量传统抗生素以外的药理活性物质，如酶抑制剂，免疫调节剂、受体拮抗剂等。深红紫链霉菌属于放线菌纲放线菌目链霉菌科链霉菌属，孢子球形、卵圆形。目前未见有关深红紫链霉菌及其应用的详细报道。
【发明内容】
[0005]针对目前国内外现有技术中，未见专门针对深红紫链霉菌LSti^ptomycesviolaceorubidus^研究及应用趋向研究现状,本发明旨在提供一种深红紫链霉菌及其应用，所述的深红紫链霉菌通过代谢表达，蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶阴性，α -淀粉酶、酯酶、脂肪酶阳性，深红紫链霉菌广泛用于α -淀粉酶、酯酶、脂肪酶生产领域，这些特性明显区别于已公开报道的其他紫色链霉菌有效种，具有广泛的应用价值。
[0006]本发明采用的主要技术方案:
本发明从吉尔吉斯斯坦共和国贾拉拉巴德州Kyzyl-Suu(N 41° 18’ 25.12 E72° 57’46.15)野生核桃林土样中取样，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为JG-1的菌株,参照《放线菌系统学-方法、原理与实践》所用的方法进行鉴定，对JG-1菌株进行形态学，生理生化鉴定，命名为深红紫链霉菌iStreptomyces vi olaceorubi dus )。该菌株于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101，保藏日期是2013年07月15日，保藏号是CGMCC N0.7921 ;该菌革兰氏阳性，菌落中等大小，呈灰黄色变浅黄色，扁平，在分离培养基淀粉琼脂培养基上有气生菌丝，显微镜下观察基内菌丝有断裂，无横隔；该菌在蔗糖硝酸盐琼脂上气生菌丝少，白色至灰色；基生菌丝无色；该菌在葡萄糖天冬素琼脂上无气生菌丝，基生菌丝灰色至浅微粉色；该菌在淀粉琼脂上气生菌丝为灰黄变浅黄，基生菌丝为浅橙色，在无机盐淀粉琼脂上气生菌丝差；基生菌丝反面在灰黄色至黄褐色，无可溶色素，在燕麦粉琼脂上气生菌丝灰色，基生菌丝无色或灰黄色，该菌在牛奶内不生长，纤维素上不生长，不产生类黑色素、酪氨酸酶和H2S,利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-棉子糖以及乳糖、D-海藻糖、水杨苷；不利用D-果糖、蔗糖、L-鼠李糖。
[0007]本发明通过总DNA的提取、16S rRNA基因的PCR扩增和测序，根据测序结果，用Blast搜索软件从GenBank、EMBL等数据库中调出相似性较高的相关放线菌菌株的16SrRNA基因序列，用CLUSTAL X进行多序列比对，并采用Saitou和Nei的邻接法Joining)用MEGA 5.0软件进行系统进化树的构建和同源性比较。经测定，深红紫链霉菌(S trep tomyces vi olaceorubi dus ) JG-1 CGMCC N0.7921 的 16s rRNA 基因序列为 1436bp。
[0008]通过上述结果及16S rRNA同源分析、系统发育分析结果，将纯化的菌株深红紫链霉菌(trep tomyces vi olaceorubi dus )进行系统进化树的构建及多样性分析,菌种编号为JG-1与深红紫链霉菌vi olaceorubi dus )同源性最高,将菌种编号为JG-1菌株鉴定为深红紫链霉菌iStreptomyces vi olaceorubi dus ) ?
[0009]本发明进而提供深红紫链霉菌violaceorubi dus ) JG-1 CGMCCN0.7921的分离和培养方法。
[0010]1.分离培养基采用:一是淀粉琼脂培养基:可溶性淀粉20g，氯化纳0.5g,硝酸钾lg，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.01g,定容至1L，pH 7.0-7.2，121° C灭菌20分钟；二是甘油天门冬素琼脂:L-天门冬氨酸Ig，甘油IOg , K2HPO4 Ig，微量元素溶液Iml，琼脂20.0g，定容至lL，pH 7.2，121° C灭菌20分钟。微量元素溶液=FeSO4.7H20 0.lg, MnCl2.4H20 0.lg, ZnSO4.7H20 0.1g,定容至 1L。
[0011]2.分离和筛选条件:
(I)样品采集:土壤样品采自吉尔吉斯斯坦贾拉拉巴德州Kyzyl-Suu (N 41° 18’25.12E 72° 57’ 46.15)野生核桃林，于林地周边随机选取5处深度为3 cm-20cm的土壤样品，混匀后装入无菌容器内，车载冰箱运至实验室，4° C保存备用。
[0012](2)菌种筛选，纯化及生理生化特性
依据梯度稀释法，称取IOg 土壤样品于90mL无菌生理盐水中，30° C活化30min后进行梯度稀释，选取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4稀释液分别涂布于分离培养基淀粉琼脂培养基和甘油天门冬素琼脂培养基平板，每个处理3个重复，置30° C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。
[0013]经培养筛选确定的深红紫链霉菌violaceorubi dus ) JG-1 CGMCCN0.7921在葡萄糖天冬素琼脂上无气生菌丝，基生菌丝灰色至浅微粉色，在淀粉琼脂上气生菌丝为灰黄变浅黄，基生菌丝为浅橙色，在无机盐淀粉琼脂上气生菌丝差；基生菌丝反面在灰黄色至黄褐色，无可溶色素，在燕麦粉琼脂上气生菌丝灰色系列；基生菌丝无色或灰黄色；该菌牛奶内不生长，纤维素上不生长，不产生类黑色素、酪氨酸酶和H2S,利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-棉子糖以及乳糖、D-海藻糖、水杨苷；不利用D-果糖、蔗糖、L-鼠李糖。具有α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶活性。
[0014]同时，本发明提供的 深红紫链霉菌violaceorubi dus ) JG-1 CGMCCN0.7921具有蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶阴性，α _淀粉酶、酯酶、脂肪酶阳性，可广泛用于α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶生产领域，该菌种生长迅速、发酵周期短的特点，在酶制剂产业方面具有广泛的应用前景。
[0015]通过实施本发明具体的技术指标，实现本
【发明内容】
，可以达到以下有益效果:本发明提供的深红紫链霉菌violaceorubidus^) JG-1 CGMCC N0.7921
具有蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶阴性，α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶阳性，可广泛用于α -淀粉酶、酯酶、脂肪酶工农业生产生产领域，可见，深红紫链霉菌violaceorubidus) JG-1 CGMCC N0.7921在酶制剂产业方面具有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1 所不为深红紫链霉菌(Sirepio焊Ce1Svi olaceorubi dus ) JG-1 CGMCC N0.7921系统发育树状图。
[0017]图2 所不为深红紫链霉菌(Sirepio焊Ce1Svi olaceorubi dus ) JG-1 CGMCC N0.7921菌种的菌体图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例进一步阐明本发明，当然，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明要求保护的范围。
[0019]本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备:培养基选用:可溶性淀粉 20g，NaCl 0.5g, KNO3 Ig，K2HPO4.3H20 0.5g，MgSO4.7H200.5g，FeS04.7H20 0.01g，琼脂 15_20g，水 1000ml，ρΗ7.0-7.2。
[0020]主要仪器与试剂:MSSPX-250型生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，Sff-CJ-1FB型单人双面净化工作台，E360K离心机，恒温摇床HWY-1OOt5PCR仪Eppendorf No:5345,电泳仪 Bio-Rad Mode 200/2.0，凝胶成像仪 United-Bio, GK-330C plus, PCR 预混液{TaKaRa
，其余试剂均为分析纯。超声波破碎仪为美国Sonics, VC 130。
[0021]本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0022]实施例一:深红紫链霉菌(Sirepio焊Ce1Svi olaceorubi dus ) JG-1 CGMCC N0.7921的分离、筛选
1.分离
本发明所述的深红紫链霉菌JG-1分离于吉尔吉斯斯坦贾拉拉巴德州Kyzyl-Suu(N41° 18’25.12E72。57’46.15)野生核桃林土壤样品，于林地周边随机选取5处深度为3cm-20cm的土壤样品，混匀后装入无菌容器内，车载冰箱运至实验室，采用平板稀释涂布法，分离获得一株链霉菌JG-1。
[0023]分离步骤:依据梯度稀释法，称取IOg 土壤样品于90mL无菌生理盐水中，30° C活化30min后进行梯度稀释，选取10_2、10_3、10_4稀释液分别涂布于淀粉琼脂培养基和甘油天门冬素琼脂培养基的平板，每个处理3个重复，置30° C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于新的分离培养基淀粉琼脂培养基和甘油天门冬素琼脂培养基，直至无杂菌落。将`纯化后的菌株一部分采用冻干物安瓿管、甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存于4° C直接用于后续研究。
[0024]2.培养条件
培养基:淀粉琼脂培养基采用为，可溶性淀粉20g，氯化纳0.5g，硝酸钾lg，磷酸氢二钾
0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，定容至lL，pH 7.0-7.2,121° C灭菌20分钟。
[0025]NaCl生长耐受范围:0.5-5%,最适生长NaCl 2-4% ；KC1生长耐受范围:0.5-6%,最适生长KCl 2-4%; MgCl2生长耐受范围:0.5-4%，最适生长MgCl2 1-2% ;最适生长pH:7.0 ；最适生长温度:30°C。根据本发明提供的深红紫链霉菌vi olaceorubi dus )CGMCC N0.7921特性确定其具体的生长因子，把菌株JG-1接种培养。结果见表1。
[0026]表1温度、pH、盐、抗生素对菌株JG-1生长的影响
温度rc)41525303235生长情况-++++++++++++温度rc)384550生长情况+++-pHI23456生长情况----+++pH78910生长情况++++--NaCl浓度0%1%2%3%4%5%生长情况+++++++++++++NaCl浓度6%7%8%9%10%生长情况
【权利要求】
1.一种深红紫链霉菌violaceorubidus)JG-1，其特征在于，所述的深红紫链霉菌印toJG-1 保藏编号为 CGMCC N0.7921。
2.如权利要求1所述的深红紫链霉菌violaceorubidus)JG-1 CGMCCN0.7921在α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶生产中应用。
【文档编号】C12R1/465GK103555636SQ201310566781
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】包慧芳, 侯敏, 王宁, 古丽尼莎沙依木, 王炜 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所