新型偶氮化合物及其利用、以及其制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型偶氮化合物、含有上述偶氮化合物的新型猝灭剂、上述猝灭 剂的利用以及上述偶氮化合物的制造方法。
【背景技术】
[0002] 关于荧光共振能量转移（FRET)的猝灭现象是指，从因光而处于受激能级状态的 作为报告体（reporter)的能量给体中，能量转移到位于近距离的作为猝灭剂的能量受 体的现象(J.R.Lakowicz,Principlesoffluorescencespectroscopy, 1999,Kluwer Academic/PlenumPublishers，NewYork)。此时，能量转移效率与报告体和猝灭剂之间的 距离密切关联，转移效率与报告体和猝灭剂之间距离的6次方成反比例关系。因此，此两者 之间的距离相隔一定距离以上时，不会发生荧光共振能量转移（FRET)猝灭现象。
[0003] 作为荧光共振能量转移猝灭现象的一例，将TAMRA荧光物质作为能量受体使用 时，即，作为猝灭剂使用时，来自能量给体的发光能量能够在能量受体的吸光区域内进行吸 收。所吸收的能量转变成受激能级状态，并在能量受体的发光区域内发光。
[0004] 如上所述的猝灭现象在由偶氮化合物构成的猝灭剂的情况下，其能量转移过程也 相同。但是，在作为能量受体的猝灭剂中不会发生发光现象。该转移过程中的偶氮化合物 等猝灭剂代替发光以热或其他作用方式释放能量，其在该方面上与前述物质有所不同。将 上述偶氮化合物等猝灭剂称为暗猝灭剂Oarkquencher)。
[0005] 暗猝灭剂在转移能量时不以光的形式释放能量，而是以热的形式释放能量，因此， 其是不带有荧光的染料。显示荧光的猝灭剂在分析时，猝灭剂与报告体的荧光光谱重叠，从 而增加了背景噪音。但是，暗猝灭剂没有荧光光谱而不存在噪音问题，因此对于上述的增 加背景噪音的缺点提供了解决方案。另外，暗猝灭剂还可以提供同时使用两个以上的报告 体-猝灭剂的探针的优点。
[0006] 作为具有暗猝灭剂的结构的代表性化合物，典型的有BHQ猝灭剂衍生物的BHQ1、 BHQ2以及BHQ3(W02001/086001A1)。这些猝灭剂由作为电子给体物质的二烷基苯胺和具有 电子受体性质的芳香族物质之间的重氮键构成，大约在500~700nm的波长区域中吸收荧 光。但是，具有盐结构的猝灭剂的情况下，低聚物合成和提纯过程时表现出不稳定的状态， BHQ3为其一例。
[0007] 此外，可例举：BBQ猝灭剂（W02006/084067A2)和作为醌类猝灭剂的爱荷华黑猝灭 剂（Iowablack猝灭剂）（US7504495B2)。但是，这些猝灭剂相比于上述BHQ猝灭剂波长吸 收能力差。
[0008] 一方面，猝灭剂与荧光物质相结合而主要在化学或者生物学领域中使用。为了检 测所需的分子、蛋白质或核酸，使能够与其互补性结合的分子、猝灭剂以及荧光物质相结合 而测定荧光的发光程度，由此能够判断出目标物质的存在。其对化学以及生物学领域的进 一步发展起到了重要作用。生物学领域中最有效应用荧光共振能量转移理论的是，即时聚 合酶链锁反应（RealTimePolymeraseChaineRaction，RT-PCR)中探针的使用。探针用 于碱基序列等特定部位的检测，最近在即时聚合酶链锁反应（RT-PCR)中频繁使用。
[0009] 探针的种类有TaqMan探针和分子信标（MolecularBeacon)探针等。TaqMan探 针是，一侧端部上附着有报告体（能量给体），相反侧端部上附着有猝灭剂的探针。进行聚 合酶链锁反应时，报告体脱离猝灭剂影响的同时显现出报告体本身的荧光。荧光的量随着 聚合酶链锁反应更多实施，成比例地增加。通过定量化该荧光的量而用作间接的测定手段。 分子信标探针以发夹形状由茎和环构成。随着聚合酶链锁反应的进行，特定部位上附着有 分子信标探针时，结构分解，并且脱离猝灭剂的影响范围而发出荧光。
[0010] 基于荧光共振能量转移理论的猝灭现象能够说明猝灭剂在探针内与报告体进行 的能量转移。因此，探针中报告体和猝灭剂的关系对探针性能起到重要作用。当猝灭剂对 连接于探针的报告体的各种波长区域进行吸收时，可使用的荧光物质不存在任何限制，能 够制作出检测更加容易且优异的探针。即，猝灭剂吸收波长的范围变宽时，可制作出猝灭剂 与各种荧光染料进行连接的探针。
[0011] 基于此，本发明人等为了开发出效率更加优异的猝灭剂进行悉心研宄的结果，发 现：具有新型偶氮化合物的猝灭剂作为猝灭剂具有优异的性质，以此完成了本发明。
【发明内容】
[0012] 发明要解决的课题
[0013] 本发明的目的在于，提供一种新型偶氮化合物以及含有上述偶氮化合物的新型猝 灭剂。
[0014] 本发明的另一目的在于，提供一种含有上述猝灭剂的寡核苷酸。
[0015] 本发明的又一目的在于，提供一种新型偶氮化合物以及上述偶氮化合物的制造方 法。
[0016] 解决课题所用的方法
[0017] 为了达成上述目的，本发明提供一种含有以下述化学式1表示的化合物的猝灭 剂。
[0018] [化学式1]
[0019] A-N=N-A2-N=N-A3
[0020] 上述化学式1中，
[0021] A1具有下述化学式2或者化学式3的结构；
[0022] A2为取代或未取代的C6-C12的亚芳基（arylenegroup)、或者取代或未取代的 Oi_C12 的杂亚芳基（heteroarylenegroup);
[0023] A3为取代或未取代的C6-C30的芳基、或者取代或未取代的C3-C30的杂芳基。
[0024] [化学式2]
【主权项】
1. 一种猝灭剂，其含有以下述化学式1表示的化合物， 化学式1: A:-N=N-A2-N=N-A3 上述化学式1中， A1具有下述化学式2或者化学式3的结构； A2为取代或未取代的C6-C12的亚芳基，或者，取代或未取代的C4-C12的杂亚芳基； A3为取代或未取代的C6-C30的芳基，或者，取代或未取代的C3-C30的杂芳基，
上述化学式2中， Z1至Z4为相互独立的CR1或者氮； R1为氢、卤素、C1-C10的烷氧基、硝基、氰基或者磺酰基； X1为CH2、NH、硫或者氧； X2为CH或者氮， 上述化学式3中，
Z5至Z9为相互独立的CR2或者氮； R2为氢、羟基、C1-C10的烷氧基、NR9R1Q、C1-C10的烷基、C1-C10的羧基或者卤素； R9以及R1(1为相互独立的氢或者C1-C10的烷基。
2. 如权利要求1所述的猝灭剂，其中，A2含有具有下述化学式4的结构的化合物，
上述化学式4中， Z1Q至Z13为相互独立的CR3或者氮； R3为氢、羟基、C1-C10的烷氧基、NRnR12、C1-C10的烷基、C1-C10的羧基、C6-C30的芳 氧基或者卤素； R11以及R12为相互独立的氢或者C1-C10的烷基。
3. 如权利要求1或2所述的猝灭剂，其中，A3含有具有下述化学式5的结构的化合物， 上述化学式5中，
Z14至Z17为相互独立的CR4或者氮； R4为氢、羟基、C1-C10的烷氧基、NR13R14、C1-C10的烷基、C1-C10的羧基或者卤素； R13以及R14为相互独立的氢或者C1-C10的烷基； Z18为CH或者氮； L1以及L2为相互独立的氢、C1-C30的烷基、C6-C30的芳基、羟基取代的C1-C30的烷基、C6-C30的芳基取代的C1-C30的烷基、C1-C30的羧基、C1-C30的羰氧基取代的C1-C30的烷 基或者C3-C30的杂芳基。
4. 如权利要求3所述的猝灭剂，其中，上述猝灭剂含有选自于下述化学式6或者化学式 7的化合物， 上述化学式中，
Z18为CH或者氮； L1以及L2为相互独立的氢、C1-C30的烷基、C6-C30的芳基、羟基取代的C1-C30的烷基、C6-C30的芳基取代的C1-C30的烷基、C1-C30的羧基、C1-C30的羰氧基取代的C1-C30的烷 基或者C3-C30的杂芳基； R15至R18为相互独立的H、C1-C10的烷氧基或者C1-C10的烷基。
5. 如权利要求3所述的猝灭剂，其中，上述猝灭剂含有选自于下述化学式8至化学式 12的化合物，
6. 如权利要求3所述的猝灭剂，其中，还含有通过连接子与上述L1或者L2进行连接的 载体， 还含有由DMT即由4,4' -二甲氧基三苯基或者其类似物进行保护的羟基。
7. 如权利要求6所述的猝灭剂，其中，上述猝灭剂含有选自于以下述化学式13至化学 式17表示的化合物中的任意一个，
上述化学式12至化学式15中，Y为载体。
8. -种寡核苷酸，其含有权利要求1~7中任一项所述的猝灭剂。
9. 如权利要求8所述的寡核苷酸，其中，上述寡核苷酸含有探针。
10. -种核酸检测用组合物，其含有权利要求8所述的寡核苷酸。
11. 如权利要求9所述的寡核苷酸，其中，上述探针含有作为报告体的荧光物质。
12. 如权利要求11所述的寡核苷酸，其中，上述焚光物质是选自于由焚光物质系列或 者荧光物质系列衍生物所组成的组中的一个以上，所述荧光物质系列包括香豆素、荧光素、 罗丹明、氟硼荧和菁。
13. -种新型偶氮化合物，其选自于下述化学式6或者化学式7， 上述化学式中，
Z18为CH或者氮； L1以及L2为相互独立的氢、C1-C30的烷基、C6-C30的芳基、羟基取代的C1-C30的烷基、C6-C30的芳基取代的C1-C30的烷基、C1-C30的羧基、C1-C30的羰氧基取代的C1-C30的烷 基或者C3-C30的杂芳基； R15至R18为相互独立的H、C1-C10的烷氧基或者C1-C10的烷基。
14. 一种偶氮化合物的制造方法，是权利要求11的化学式6表示的偶氮化合物的制造 方法，包括： 使下述化学式6a的苯胺和化学式6b进行偶氮偶合反应而获得化学式6c的化合物的 步骤；以及 获得上述化学式6c的化合物的步骤之后，使该化学式6c和下述化学式6d进行偶氮偶 合反应而获得化学式6的化合物的步骤，
上述化学式中， Z18为CH或者氮； L1以及L2为相互独立的氢、C1-C30的烷基、C6-C30的芳基、羟基取代的C1-C30的烷基、C6-C30的芳基取代的C1-C30的烷基，C1-C30的羧基、C1-C30的羰氧基取代的C1-C30的烷 基或者C3-C30的杂芳基； R15至R18为相互独立的H、C1-C10的烷氧基或者C1-C10的烷基。
15. -种偶氮化合物的制造方法，是权利要求11所述的化学式7表示的偶氮化合物的 制造方法，包括： 在权利要求12中获得上述化学式6c的化合物的步骤之后，使该化学式6c和下述化学 式7a进行偶氮偶合反应而获得化学式7的化合物的步骤，
上述化学式中， Z18为CH或者氮； L1以及L2为相互独立的氢、C1-C30的烷基、C6-C30的芳基、羟基取代的C1-C30的烷基、C6-C30的芳基取代的C1-C30的烷基、C1-C30的羧基、C1-C30的羰氧基取代的C1-C30的烷 基或者C3-C30的杂芳基； R15至R18为相互独立的H、C1-C10的烷氧基或者C1-C10的烷基。
【专利摘要】本发明提供一种对受激能级状态下表现出发光现象的物质具有猝灭能力的新型偶氮化合物、含有新型偶氮化合物的猝灭剂、该猝灭剂的利用以及偶氮化合物的制造方法。本发明的猝灭剂在波长的吸收区域中显示出优异的特性。
【IPC分类】C09K3-00, C09K11-06, C07D213-72
【公开号】CN104703971
【申请号】CN201380051698
【发明人】金淳基, 权泰宇, 崔正荣
【申请人】株式会社百奥尼
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年8月2日
【公告号】EP2881385A1