通过差异杂交进行的str基因分型的制作方法

通过差异杂交进行的str基因分型的制作方法
【专利摘要】在一种推导基因组样品中所选短串联重复序列(STR)中的重复单元数目的方法中，提供了由包含所选STR的基因组样品所生成的至少一条单链目标DNA、一个STR探针(P1,P1’)、一个参考探针(P2)和两个封闭物(B1,B2)，并进行了至少三个差异杂交实验，基于此确定了每个差异杂交实验中每条目标DNA链上结合的STR探针寡核苷酸(P1,P1’)的数目。所述方法还包括比较差异杂交实验中每条目标DNA链上结合的STR探针寡核苷酸(P1,P1’)的数目，用于推导单链目标DNA链上所选STR上的重复单元数目。还公开了用于通过差异杂交实施STR基因分型的试剂盒。
【专利说明】通过差异杂交进行的STR基因分型
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本国际专利申请要求2012年I月18日提交的美国专利申请号13/352742的权益，其通过引用全文纳入本文并用于所有目的。

【技术领域】
[0003]本发明涉及一种根据独立权利要求1的前序部分分析短串联重复序列的方法。John M.Butler的小型综述“人身份测试中使用的短串联重复序列输入技术”对技术的实际领域、商业试剂盒、DNA分离、已降解DNA所携带信息的恢复和短串联重复序列(STR，有时也被称作微卫星序列或简单序列重复(SSR))未来使用的前景做了简要概述(B1Techniques2007，卷 43 增刊，N0.4)。
[0004]相关现有技术
[0005]单个人类基因组短串联重复序列(STR)的分析常规用于例如人身份测试以及对其他生物(像植物和细胞)的测试。这类短串联重复序列是简单的序列基序，由最多数十个重复单元构成。人类基因组包含数以千计的这类STR，通常位于非编码区。由于STR是相对于其重复单元数量的多形体，可以根据每个等位基因和每个STR位点所含独特的重复单元个数区分人个体。因此，STR分析在人个体身份的鉴定(如法医学或亲子鉴定)中是特别有用的。
[0006]通常，STR分析首先涉及分离人个体的基因组DNA，随后进行聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤。此时，特异的、经选择的STR位点得到扩增，多重扩增(同时扩增多个STR位点)已在生物学实验室中常规使用。这使得单个测试中能够平行评估数个STR以实现高甄别率，同时只需使用少量DNA。这进而与法医学有特定的关联性，法医鉴定中通常只能获得少量DNA (大部分DNA可能被降解)。
[0007]根据分析目的的不同(如身份鉴定、亲子鉴定、人口分析)，可使用不同的STR。尤其是需要在不同实验室之间比较DNA序型时，STR分析的标准化是一个重要方面。例如，欧洲法医实验室使用了至少七种成熟的用于STR分析的国际刑警STR位点(参见Gill等，“The evolut1n of DNA databases - Recommendat1ns for new European STR loci，，(DNA
数据库的进化-关于新的欧洲STR位点的建议)，Forensic Science Internat1nal,
156 (2006)，242-244)。分析后STR位点的标准化使得不同实验室之间直接比较DNA序型成为可能。
[0008] 对所选基因片段进行扩增步骤后，可确定每个扩增后STR的长度。广泛使用例如毛细管电泳确定片段长度。此时，通过电泳分离并通过与标准化等位基因梯相比较的手段检测扩增后DNA产物。使用毛细管电泳进行的DNA长度确定的优势包括高度精确的测量大小(如小于I个核苷酸)，通过使一些扩增子比其他大但对所有扩增子标记相同荧光标签的手段按大小进行多元化(增加通量)。毛细管电泳所提供的优势是更容易解读混合物，因为分析员可同时得到强度和大小数据。然而，毛细管电泳需要使用大型仪器(例如ABI 3730遗传分析仪，应用生物系统公司(Applied B1systems))。这增加了该应用所承担的费用及其复杂程度。此外，相对长的样品运行时间延缓了样品通量，因而可能导致各实验室形成积压。毛细管电泳的其他优点包括可以利用基因组实验室中常规使用的、有大量安装基础的仪器，且相比于前一代的平板凝胶电泳，STR分析更容易自动化。由于毛细管电泳并不直接检测核苷酸序列，如果STR长度相同，则无法检测到因为序列替换导致的STR微异质性；从而可能丢失重要数据。而且毛细管电泳的装置精密、昂贵且对灰尘和移动敏感。检测窗(低端的噪音和高端的最高限度之间的信号)相对狭窄，为找到“最有效点”需使用耗材昂贵、费时且繁琐的定量PCR进行DNA定量并标准化。
[0009]其他方法包括使用杂交技术以确定STR片段长度。例如，在文献W096/36731中，通过将目标DNA与一组独特的含已知长度串联重复序列的互补探针进行杂交以确定重复数目。如果使用所含重复序列多于目标DNA的探针进行杂交，会形成颈环结构，而使用相同重复数目的探针进行杂交时，不会形成颈环结构。随后使用各种探针的不同荧光标记确定长度，无需进行毛细电泳分离。这是一个多步骤过程，包括使用对S-S键特异的核酸酶进行消化和使用DNA聚合酶进行标记。该方法需要合成固相载体支撑的寡核苷酸阵列，因此无法在溶液中完成。
[0010]文献US 6，395，493 BI中公开了一种确定DNA长度多态性的方法，也涉及杂交反应。该文献描述了一种涉及使用硅微芯片的测定，所述硅微芯片由一组成阵列的电极组成，每个电极含有一条独特的“捕捉探针”，用于捕捉感兴趣的各个可能的STR位点上的各个可能的等位基因。例如，为确定TPOX位点(如6-13个重复)上存在可能的八个等位基因中的哪几个，需要八个不同的探针位点。扩增感兴趣的DNA样品，随后使其通过芯片。它会与带互补捕捉探针的电极进行杂交。“捕捉探针”通过结合重复区域和30-40碱基的旁侧区域进而捕捉经PCR扩增的STR等位基因。杂交后，通过简单的调节电场强度对每个电极施加“电子严格化”，未与探针完美匹配的样品会变性并与探针解离。
[0011 ] 除去未结合和变性的DNA后，一种“报告探针”混合物会通过芯片。所述“报告探针”包含1-3个重复单元，一些旁侧序列和一个荧光染料标记。该探针会与芯片上捕获的DNA中的STR等位基因杂交并在探针位点生成荧光信号，可通过对该信号的解读了解样品的基因型。即使没有进行基于分子大小的分离操作，这种读取也能够提供了一种与样品中存在的重复数目相匹配的基因型。
[0012]在文献US 6，395，493 BI所述的方法中，必须将捕捉探针阵列“印刷”(即固定)在反应容器的表面，DNA随后通过该阵列。由于该方法需要预先印刷或购买特殊的预印刷阵列，读取信号的强度受限于印刷在各电极上的捕捉寡核苷酸的数目。DNA样品的进一步扩增无法增加超过捕捉电极数量的信号。此外，所述方法需要特殊装置在清洗前使未匹配的杂交链变性。而本发明中的方法无需这类特殊装置(参见下文中本发明的优势)。
[0013]从文献US 2011/0003290 Al中已知一种使用熔解温度检测(例如目标多核苷酸中的STR位点上的)串联重复数目的方法。该方法中使用了荧光标记的探针寡核苷酸，包含一条至少5个与串联重复序列中的至少一个互补的核苷酸的序列。可选择探针寡核苷酸的长度使得当所选STR位点上存在不同数目的串联重复序列时，探针寡核苷酸所生成的杂交链的熔解温度不同。随后可通过熔解曲线分析确定串联重复序列的数目，其中通过在受控的温度变化下动态测量荧光以确定熔解温度。
[0014] 发明目的和概述
[0015]本发明的一个目的是提供一种推导核酸样品中串联重复数目的方法。
[0016]根据第一方面，根据本发明推导出了基因组样品中所选短串联重复序列(STR)上的重复单元数目，实现了所述发明目的。这里所公开的方法包括以下步骤:
[0017]a)提供至少:
[0018]al)从包含所选STR的基因组样品中生成的单链目标DNA ；
[0019]a2)带第一荧光标签的STR探针(Pl，P1’)，至少一个STR探针(Pl，P1’ )为寡核苷酸，包含与单链目标DNA上所选STR的确定数目的重复单元互补的序列；
[0020]a3)带第二荧光标签(与第一荧光标签不同)的参考探针(P2)，所述参考探针(P2)为寡核苷酸，包含与单链目标DNA上所选STR的5’或3’旁侧序列互补的序列；
[0021]a4)两个寡核苷酸封闭物(B1、B2)，其中第一封闭物(BI)包含与STR的5’旁侧区域序列以及与该5’旁侧区域序列相邻的STR重复单元中的至少一个互补的序列，并且其中第二封闭物(B2)包含与STR的3’旁侧区域序列以及与该3’旁侧区域序列相邻的STR重复单元中的至少一个互补的序列；
[0022]b)进行至少以下三个差异杂交实验，每个实验中将一定量的单链目标DNA与以下物质混合:
[0023]bl)所述至少一个STR探针(Ρ1，Ρ1)和所述参考探针(Ρ2)，并允许在第一个差异杂交实验中与单链目标DNA杂交；
[0024]b2)所述至少一个STR探针(Pl，P1’)、所述参考探针(P2)和所述至少两个封闭物(B1,B2)之一，并允许在第二个差异杂交实验中与单链目标DNA杂交；以及
[0025]b3)所述至少一个STR探针(Ρ1，Ρ1 )、所述参考探针(Ρ2)和所述两个封闭物(BI, Β2)，并允许在第三个差异杂交实验中与单链目标DNA杂交；
[0026]c)测量每个差异杂交实验中连接到所选STR的重复单元上的所述至少一个STR探针(Ρ1，Ρ1 )所提供的荧光强度；
[0027]d)测量每个差异杂交实验中连接到单链目标DNA的旁侧序列之一上的所述参考探针(P2)所提供的荧光强度；
[0028]e)将每个差异杂交实验中步骤c)中测量的所述至少一个STR探针(Pl，P1’ )的荧光强度与步骤d)中测量的所述参考探针(P2)的荧光强度相关联，从而确定各差异杂交实验中每个目标DNA链上结合的STR探针寡核苷酸(Ρ1，Ρ1)的数目，以及
[0029]f)比较差异杂交实验中每个目标DNA链上结合的STR探针寡核苷酸(ΡΙ,Ρ1)的数目，用于推导单链目标DNA链上所选STR中重复单元的数目。
[0030]根据第二个方面，通过提出使用本文所公开的差异杂交进行STR基因分型的试剂盒，实现了所述发明目的。
[0031 ] 本文还公开了本发明的其他特征和优选实施方式。
[0032]本发明所述方法的优势包括:
[0033].可使用标准荧光酶标仪代替大型毛细管电泳装置完成重复数目的评估。常规的法医或诊断实验室通常已有这类荧光酶标仪，而甚至更重要的是:这种标准荧光酶标仪的价格仅是毛细管电泳装置的约10% (后者约为200，000美元)。
[0034].能够减少分析时间，比毛细管电泳更快地拿到第一手结果。
[0035].本发明所述方法比常规的分析方法简单，因为该方法不使用酶促反应。
[0036].所述方法是序列特异的(与大小相对)，所以可通过加入额外的探针检测微变体。
[0037].本方法对输入的DNA较不敏感，因为相比于例如毛细管电泳装置所用的检测器和数据分析算法，简单荧光测量(如使用标准荧光酶标仪)的信号动态范围更宽。毛细管电泳分析前需要进行额外的DNA定量步骤以确保信号峰具有高于背景噪音的足够强度，同时也不能过强而超过线性检测范围；应用本发明所述方法进行直接荧光读取时，该“信号窗”通常宽得多。
[0038].本方法更快(不包括样品制备所需时间，如纯化和扩增)，因为其基于反应容器中的直接荧光测量，这是一种即时分析而无需涉及冗长的动力学测量或毛细管电泳。因此，举例来说，一名用户可以在单个384孔酶标板上测量7个不同样品或在1536孔板上测量29个样品上的13个CODIS位点。可在常规酶标仪上在不到一两分钟内完成对这类平板的测量。高通量毛细管电泳装置每次运行能够处理至多16个样品，每次运行时间为1-2小时。
[0039].相比于已知的涉及使用S— S键特异的核酸酶消化和使用DNA聚合酶标记的多步骤方法，本发明所述方法更为简单，仅需进行一些平行杂交实验。
[0040].已知的多步骤方法需要合成固相载体支撑的寡核苷酸阵列或在反应容器表面“印刷”这种捕捉探针阵列，随后使DNA通过该阵列。与之相反，本发明可将DNA结合到任何表面，随后使探针通过DNA;杂交在溶液中完成，无需预印刷或购买专门的预印刷阵列。
[0041].已知的多步骤方法需要能够进行精确温控的特殊装置，用于在清洗前使未匹配的杂交链变性。本发明所述方法无需这种专门的装置。实际上，可将本方法设计为使用淬火探针化学反应(如从分子信标或荧光共振能量转移(FRET)处获得)的同质测定。

【专利附图】

【附图说明】
[0042]借助于附图，说明了本发明的方法和试剂盒的优选实施方式，同时不缩小本发明的范围。附图包括:
[0043] 图1 一种包含多种寡核苷酸用于通过差异杂交进行人CSFlPO STR基因型分析的典型试剂盒的示意性概略图；
[0044]图2-11 —些本发明的方法和试剂盒理论上可能获得的杂交结果的示意图，其中包括:
[0045]图2 —组A CSFlPO目标DNA，带有2个四核苷酸重复，无封闭寡核苷酸和旁侧寡核苷酸，且不存在与STR探针的杂交；
[0046]图3 —组B CSFlPO目标DNA，带有4个四核苷酸重复，I个封闭寡核苷酸，且不存在与STR探针的杂交；
[0047]图4 一组C CSFlPO目标DNA，带有7个四核苷酸重复，I个封闭寡核苷酸，并与I个STR探针杂交；
[0048]图5 —组G CSFlPO目标DNA，带有12个四核苷酸重复，I个封闭寡核苷酸，并与2个STR探针杂交；
[0049]图6 —组J CSFlPO目标DNA，带有16个四核苷酸重复，I个封闭寡核苷酸，并与3个STR探针杂交；
[0050]图7 —组J CSFlPO目标DNA，带有16个四核苷酸重复，2个旁侧寡核苷酸，并与4个STR探针杂交；
[0051]图8 —组J CSFlPO目标DNA，带有16个四核苷酸重复，2个封闭寡核苷酸，并与2个STR探针杂交；
[0052]图9 一组J CSFlPO目标DNA，带有16个四核苷酸重复，I个旁侧寡核苷酸和I个封闭寡核苷酸，并与3个STR探针杂交；以及
[0053]图10 —组J CSFlPO目标DNA，带有16个四核苷酸重复，I个封闭寡核苷酸和I个旁侧寡核苷酸，并与3个STR探针杂交；
[0054]图11含有位于带16个四核苷酸重复的一组J CSFlPO目标DNA中的STR片段上的非STR岛序列的目标DNA ;带有I个封闭寡核苷酸和I个旁侧寡核苷酸，与3个STR探针杂交；并与插入探针预测杂交，插入探针上含有与该岛序列互补的核苷酸序列；
[0055]图12该图显示了使用FAM标记的16-聚体探针(5’_AGAT)4与一系列化学合成的含2-16个ATCT重复的单链DNA杂交所获得的实验结果与理论预期的结合，其中包括:
[0056]图12A目标DNA的组A和B ;
[0057]图12B目标DNA的组C、D、E和F ;以及
[0058]图12C 目标 DNA 的组 G、H、I 和 J ;
[0059]图13显示S TR测定中等位基因对所获得结果的表格。

【具体实施方式】
[0060]本发明涉及所选STR位点上重复序列数目的检测。根据本发明，重复单元的数目与平行杂交实验的信号强度相关。鉴于此，与重复序列结合的带标记的重复特异性探针数目与存在的重复单元数目正相关。通过比较结合的重复探针信号与重复区域外参考探针按化学计量结合所产生的信号，能够确定每个分子上所结合的重复探针数目并降低所述方法对于所用DNA量的敏感程度。通过在数个平行实验中进行杂交测量(其中平行实验中已知数量的可用重复被封闭而无法进行杂交)，就可以推导出存在的重复序列数目。或者，可以将所述数个实验的信号反应与已知重复数目的模型系统中通过经验得到的结果相比较，以获得高可信度的结果。
[0061]STR位点的选择:
[0062]本发明所述方法对于鉴定人个体特别有用。但是，STR分析不限于人基因组DNA，也可用于例如动物、植物或微生物的分析。举例来说，本文应提及STR分析用于食品认证或哺乳动物和真核细胞系的质量控制。
[0063]对于身份鉴定而言，建议采用各执法机构广泛接受的STR位点。主要的两组位点是13个FBI (美国联邦调查局)CODIS位点和10个FSS (联合王国法医科学服务中心)SGM和SGM plus位点。John M.Butler在《STR标记的法医DNA分型、生物学、技术和遗传》(“Forensic DNA Typing,B1logy, Technology, and Genetics of STR Markers”)一书中描述了非人类DNA测试和微生物法医学(埃尔斯威尔学术出版社(Elsevier Academic Press),第二版，2005 ;参见第11章，299 一 330页)。那本书中描述了猫和狗的STR(和引用来源)以及植物STR(如印度大麻(Cannabis Sativa))，书中指出，“正如人类的STR那样，大麻的STR标记具有高度多态性，基因组的独特位点的特异性，且能够解码混合物。一个六核苷酸重复标记在108个经测试的大麻样品中存在范围在3-40个之间的重复单元，且扩增该位点的引物在其他20种经测试的植物中并未生成交叉反应的扩增子(Hsieh等，2003)”。对于微生物法医学，迈出的第一步与生物恐怖主义有关，包括炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)的基因组测序和HIV病毒毒株的系统发生分析。
[0064]在STR系统的多种类型中，四核苷酸重复(核心重复中含有4个重复单元)较二或三核苷酸(2个或3个重复单元)更普遍地应用于基因分型。五和六核苷酸(5个或6个重复单元)重复在人类基因组中较不常见，但也有一些实验室对此进行检测(参见Butler2005,89页，第3段)。本发明所述方法并不受重复单元中核苷酸的特定数目的限制。
[0065]PCR:
[0066]使用STR系统时PCR扩增步骤是必需的，因为基因组DNA过于复杂，难以进行杂交测定。可以使用多重PCR，同时处理确定数目的STR位点或STR位点组合。实际上没有STR的最大或最小数目，优选根据经验判断可能的任意数目。学术和商业实验室已鉴定到了许多STR标记，用于疾病和基因位置研究。例如，位于威斯康星州马什菲尔德(Marshfield)的马什菲尔德医学研究基金会(Marshfield Medical Research Foundat1n, http://research,marshfieldclinic.0rg/genetics)已经收集了含有分散在23对人类染色体上的超过8000个STR的基因分型数据(参见Butler 2005,86页)。存在许多商业试剂盒，能够完成适当的多重扩增，例如来自应用生物系统公司(Applied B1systems)、普洛麦格(Promega)和凯杰公司(Qiagen)的试剂盒。但也可使用其他适用于扩增基因组DNA样品中特定序列的方法(如链置换扩增法)从基因组样品中扩增一个或多个所选STR位点。
[0067]所用寡核苷酸:
[0068]需使用不同寡核苷酸的组合根据本发明对基因组样品中一个或多个所选STR进行分析，所述寡核苷酸为单个STR位点特别设计并用于至少三个不同的杂交实验。根据本发明，这类寡核苷酸是:
[0069]-对STR重复序列特异的一个或多个STR探针Pl、P1’，
[0070]- 用于标准化的参考探针P2，
[0071]-两个或更多个封闭物B1、B2以及，
[0072]-两个或更多个旁侧物F1、F2。
[0073]在各杂交实验中，参考探针P2与至少一个STR探针ΡΙ,Ρ1'共同使用以进行标准化，用于确定每个目标分子上所结合的STR探针寡核苷酸Ρ1，Ρ1'的数目。此外，可在不同杂交实验中结合STR和参考探针，例如带有封闭物BI，Β2中的一个或多个和/或旁侧物Fl，F2中的一个或多个。当根据本发明在一个杂交实验中以混合物的形式使用不同寡核苷酸时，根据其熔解温度(Tm)确定优选寡核苷酸，使得杂交温度(即进行杂交实验的温度)下所有所用寡核苷酸的结合均可能发生。相应地，实验的杂交温度应低于所用寡核苷酸的Tm(详细描述请参见下文)。
[0074]通过差异杂交进行人类CSFlPO STR基因分型的策略:
[0075]CSFlPO是一种短串联重复序列(STR)，已知由位于人类第5号染色体上独特位置上的5-16个连续的5’ -ATCT-3’四聚体重复组成。为区分重复数目、推导乃至确定重复单元数目，使用了一种本发明所述全新的杂交方法。所述方法中，为进行演示，将一条FAM标记的16-聚体探针(5’ -AGAT-3’ )4与一系列含2_16个5’ -ATCT-3’重复的化学合成单链DNA杂交。所述这些5’ -ATCT-3’重复中的每条序列均被嵌入一条5’末端生物素化的更长的不相关序列中(参见图1)。在图1中，为进行说明，每个案例中均将单链目标DNA上STR的四核苷酸重复序列表示为一个盒子，而将单链目标DNA上的16个这类四核苷酸5’ -ATCT - 3’重复序列表示为编号1-16的盒子。将单链目标DNA的5’端标记为B*，表示生物素化。正如生物化学中核酸操纵领域所共知的，这种生物素化能够使目标DNA分子与包被有亲和素的磁珠结合。从5’端至STR起始的DNA片段被称作5’旁侧区域，从STR的3’端到DNA3’端的DNA片段被称作3’旁侧区域。
[0076]图1显示了一种包含多种寡核苷酸用于通过差异杂交完成人CSFlPO STR基因型分析的试剂盒的概略图。该试剂盒至少包括一个用于与目标STR杂交的STR探针Pl以及用于鉴定相关单链目标DNA并用于标准化STR探针信号的参考探针P2。该方法中，STR探针Pl优选含有四核苷酸5’ - AGAT - 3’的四个重复,并在3’端用第一突光标签标记(本例中为FAM)。FAM(应用生物系统公司(AppliedB1systems Inc.))是一种荧光素衍生物，也是一种咕吨突光染料。参考探针P2的构造优选为25-聚体,与图1所示目标DNA的区域(如3’旁侧区域)互补。或者，可将参考探针P2构造成与所选STR的5’旁侧区域互补。还优选用第二荧光标签标记参考探针P2。所述第二荧光标签与STR探针上的第一荧光标签不同，在本例中为花青染料(如Cy5)。
[0077]通常，可在STR探针Pl和参考探针P2上使用任何能够区分两种探针的可区分标签。所述标签可以是如前文所述的荧光染料；但也可使用如US 5，654，419中所公开的供体-受体荧光对(如FAM-3-TAM或FAM-3-R0X或FAM-4-R0X)(罗丹明衍生物TAM和ROX是应用生物系统公司(AppliedB1systems Inc.)的染料)。即使可能存在一些突光标签的替代品，仍优选使用荧光，这是因为其能够提供多种颜色，快速且灵敏。尽管如此，仍可以使用任何种类的能够连接到寡核苷酸(如引物)上且能够进行多重化的可测量标签，即放射性、发光、发色、带标记的珠子等。
[0078]优选地，所述试剂盒还包括至少两个封闭物(封闭寡核苷酸)BI，B2，用于与目标STR的一个片段和相关单链目标DNA的一个片段杂交。优选地，如图1所示，封闭物(封闭寡核苷酸)BI连接STR的5’端与DNA的5’旁侧区域，并且封闭物(封闭寡核苷酸)B2连接STR的3’端与DNA的3’旁侧区域。该方法特别优选使用25-聚体且与图1所示目标DNA的区域互补的封闭寡核苷酸BI，B2。
[0079]优选地，所述试剂盒还包括至少一个旁侧物(旁侧寡核苷酸)F1，F2，用于与目标STR相邻的相关单链目标DNA的一个片段杂交。优选地，如图1所示，旁侧物(旁侧寡核苷酸)Fl与STR的5’端的5’旁侧区域向单链目标DNA的5’端的方向杂交；旁侧物(旁侧寡核苷酸)F2与STR的3’端的3’旁侧区域杂交向单链目标DNA的3’端的方向杂交；该方法特别优选使用25-聚体且与图1所示目标DNA的区域互补的旁侧寡核苷酸F1，F2。
[0080]重要的是，旁侧物Fl，F2在CSFlPO重复序列的邻近区域迅速完成杂交，同时各封闭寡核苷酸BI，B2与CSFlPO序列的12个核苷酸(3个重复)和5’或3’旁侧目标序列的13个核苷酸进行杂交。还需要着重注意的是，在目标DNA的同一 5’或3’旁侧区域上只能杂交一个封闭寡核苷酸BI，B2或一个旁侧寡核苷酸F1，F2 ;因此，在一个特定(平行)实验中能够使用两个封闭寡核苷酸(即BI和B2)、两个旁侧寡核苷酸(即Fl和F2)或一个封闭寡核苷酸加一个旁侧寡核苷酸(即B1+F2或F1+B2)。
[0081]优选以下试剂盒，所述试剂盒在每个案例中包含一组不同的寡核苷酸用于杂交实验:
[0082]a) STR探针Pl和参考探针P2 (也被称为“XX” )；
[0083]bI) STR探针Pl，参考探针P2，带有封闭物BI (也被称为“BX”)；
[0084]b2) STR探针Pl，参考探针P2，带有封闭物B2 (也被称为“BX” )；
[0085]b3) STR探针Pl，参考探针P2，带有封闭物BI和B2 (也被称为“BB” )；
[0086]cl) STR探针Pl，参考探针P2，带有旁侧物Fl (也被称为“FX”)；
[0087]c2) STR探针Pl，参考探针P2，带有旁侧物F2 (也被称为“XF” )；
[0088]c3) STR探针Pl，参考探针P2，带有封闭物Fl和F2 (也被称为“FF” )；
[0089]d) STR探针Pl，参考探针P2，带有封闭物BI和封闭物F2 (也被称为“BF” )；
[0090]e) STR探针Pl，参考探针P2，带有封闭物B2和封闭物Fl (也被称为“FB” )。
[0091]这些封闭寡核苷酸B1，B2和旁侧寡核苷酸F1，F2的多种组合存在时16-聚体CSFlPO特异性STR探针Pl的杂交程度取决于目标DNA中存在的四核苷酸重复序列的实际数目，理论上可将目标DNA按期望杂交模式分成A-J 10个不同的组，用于对STR及其四核苷酸重复进行基因分型(参见表1)。
[0092]

【权利要求】
1.一种推导基因组样品中所选短串联重复序列(STR)中重复单元数目的方法，所述方法包括以下步骤: a)提供至少: al)从包含所选STR的基因组样品中生成的单链目标DNA ； a2)带第一荧光标签的STR探针(Ρ1，Ρ1' )，至少一个STR探针(Pl，Ρ1’ )为包含与所述单链目标DNA上所选STR上确定数目的重复单元互补的序列的寡核苷酸； a3)带第二荧光标签的参考探针(P2)，所述第二荧光标签与所述第一荧光标签不同，所述参考探针(P2)为包含与所述单链目标DNA上所选STR的5’或3’旁侧序列互补的序列的寡核苷酸； a4)两个封闭物(BI，B2)，其为寡核苷酸，其特征在于，第一封闭物(BI)包含与所述STR的5’旁侧区域内序列以及与所述5’旁侧区域相邻的至少一个STR重复单元互补的序列，第二封闭物(B2)包含与所述STR的3’旁侧区域内序列以及与所述3’旁侧区域相邻的至少一个STR重复单元互补的序列； b)进行至少以下三个差异杂交实验，各实验中将一定量的所述单链目标DNA与以下物质混合: bl)所述至少一个STR探针(Ρ1，Ρ1')和所述参考探针(Ρ2)，在第一差异杂交实验中与所述单链目标DNA杂交 ； b2)所述至少一个STR探针(Ρ1，Ρ1' )、所述参考探针(Ρ2)和所述至少两个封闭物(Β1,Β2)其中之一，在第二差异杂交实验中与所述单链目标DNA杂交；以及 b3)所述至少一个STR探针(Pl，P1’)、所述参考探针(P2)和所述两个封闭物(B1，B2)，在第三差异杂交实验中与所述单链目标DNA杂交； c)测量各差异杂交实验中结合到所选STR的重复单元上的所述至少一个STR探针(Ρ1，Ρ1' )所提供的荧光强度； d)测量各差异杂交实验中结合到所述单链目标DNA的旁侧序列之一上的所述参考探针(P2)所提供的荧光强度； e)对每个差异杂交实验，将步骤c)中测得的所述至少一个STR探针(Ρ1，Ρ1')的荧光强度与步骤d)中测得的所述参考探针(P2)的荧光强度相关联，从而确定各差异杂交实验中每个目标DNA链上所结合的STR探针寡核苷酸(Ρ1，Ρ1' )的数目，以及 f)比较各差异杂交实验中每个目标DNA链上所结合的STR探针寡核苷酸(ΡΙ,Ρ1')的数目，用于推导所述单链目标DNA链上所选STR中重复单元的数目。
2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于，在步骤a4)中，还包括第三封闭物(B3)，所述第三封闭物(B3)是寡核苷酸，所述第三封闭物包含与所述STR的5’旁侧区域内序列和所述5’旁侧区域相邻的一定数目的STR重复单元互补的序列，所述数目与所述第一封闭物(BI)中的重复单元的数目不同， 且其特征在于，所述方法包含步骤b4)，其中将一定量的所述单链目标DNA与所述至少一个STR探针(Ρ1，Ρ1' )、所述参考探针(Ρ2)和所述第三封闭物(Β3)混合，在差异杂交实验中与所述单链目标DNA杂交。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤a4)中，还包括第四封闭物(B4)，所述第四封闭物(B4)是寡核苷酸，所述第四封闭物包含与所述STR的3’旁侧区域内序列和所述3’旁侧区域相邻的一定数目的STR重复单元互补的序列，所述数目与所述第二封闭物(B2)中的重复单元的数目不同， 所述方法包含步骤b5)，其中将一定量的所述单链目标DNA与所述至少一个STR探针(Pl，P1’)、所述参考探针(P2)和所述第四封闭物(B4)混合，在差异杂交实验中与所述单链目标DNA杂交。
4.如权利要求1所述的方法， 其特征在于，在步骤a4)中，包括至少第三和第四封闭物(B3，B4)，所述第三和第四封闭物为寡核苷酸，所述第三封闭物(B3)包含与所述STR的5’旁侧区域内序列和所述5’旁侧区域相邻的一定数目的STR重复单元互补的序列，所述数目与所述第一封闭物(BI)中的重复单元的数目不同，所述第四封闭物(B4)包含与所述STR的3’旁侧区域内序列和所述3’旁侧区域相邻的一定数目的STR重复单元互补的序列，所述数目与所述第二封闭物(B2)中的重复单元的数目不同， 所述方法包含以下步骤: b4)将一定量的所述单链目标DNA与所述至少一个STR探针(Pl, P1’)、所述参考探针(P2)和所述第三封闭物(B3)混合，在第四差异杂交实验中与所述单链目标DNA进行杂交； b5)将一定量的所述单链目标DNA与所述至少一个STR探针(Pl, P1’)、所述参考探针(P2)和所述第四封闭物(B4)混合，在第五差异杂交实验中与所述单链目标DNA进行杂交；以及 b6)将一定量的所述单链目标DNA与所述至少一个STR探针(Pl, P1’)、所述参考探针(P2)和所述第三和第四封闭物(B3，B4)混合，在第六差异杂交实验中与所述单链目标DNA进行杂交。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法还包含以下步骤: 提供带第三荧光标签的至少一个插入探针(P3)，所述插入探针(P3)是寡核苷酸且包含与所述单链目标DNA上所选STR的重复序列内的非重复核苷酸序列互补的序列； 在另外的不同差异杂交实验或在步骤bl)的杂交实验中使用所述至少一个插入探针(P3)，用于确定所述单链目标DNA上所选STR的重复序列内的重复核苷酸序列是否存在。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a2)中包括两个STR探针(P1，Ρ )，各自的序列分别与所述单链目标DNA上所选STR的不同、确定数目的重复单元互补，在步骤bl)-b3)中使用所述第一 STR探针(P1)，进一步的杂交实验则使用所述第二STR探针(Ρ )而非所述第一 STR探针(P1)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，所述方法还包含以下步骤: 提供一组旁侧物(Fl，F2)，其为寡核苷酸，第一旁侧物Fl包含与所述STR的5’旁侧区域内序列互补的序列，第二旁侧物F2包含与所述STR的3’旁侧区域内序列互补的序列； 在那些不使用或只使用一个封闭物(B1，B2)的差异杂交实验中使用所述旁侧物(F1，F2)中的至少一个与所述单链目标DNA上所选STR上未被封闭物(BI，B2)覆盖的5’或3’旁侧区域杂交。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法还包含以下步骤:提供了一组聚合酶链式反应(PCR)寡核苷酸，用于对带有所述短STR序列的所选基因组样品进行PCR扩增，用所述PCR寡核苷酸组进行PCR以扩增步骤al)中提供的带有所选STR序列的基因组样品，对扩增后的双链样品DNA进行变性以生成单链DNA，选择并分离单链目标DNA用于所述差异杂交实验。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤al)中提供的所述基因组样品为人类基因组样品。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述参考探针(P2)在寡核苷酸的3’端用Cy5标记。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个STR探针(Pl)在寡核苷酸的3’端用FAM标记。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个STR探针(Ρ1，Ρ1')由所选STR的互补序列组成。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述参考探针(Ρ2)包含与所述目标DNA的5’或3’旁侧序列互补的序列，所述旁侧序列不含所选STR的序列。
14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述参考探针(Ρ2)包含与所述目标DNA的5’或3’旁侧序列互补的序列，所述旁侧序列不含所选STR的序列且不含所述旁侧寡核苷酸(F1，F2)的序列。
15.一种用于实施权利要求1所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含: ?所述至少一个STR探针(P1，Ρ1' ); ?所述参考探针(P2)，以及 ?所述至少两个封闭物(BI，B2)。
16.一种用于实施权利要求4所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含: ?所述至少一个STR探针(P1，Ρ1' ); ?所述参考探针(P2)，以及 ?所述至少四个封闭物(BI，B2)。
17.如权利要求15或16中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含: ?至少两个旁侧物(Fl，F2)，其为寡核苷酸，其特征在于，第一旁侧物Fl包含与所述STR的5’旁侧区域内序列互补的序列，且其特征在于，第二旁侧物F2包含与所述STR的3’旁侧区域内序列互补的序列。
18.如权利要求15至17中任一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包含: ?带第三荧光标签的至少一个插入探针(P3)，所述至少一个插入探针(P3)是寡核苷酸，包含与所述单链目标DNA上所选STR的重复序列内的非重复核苷酸序列互补的序列。
【文档编号】C12Q1/68GK104053790SQ201380005829
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年1月18日 优先权日:2012年1月18日
【发明者】J·马莫, M·N·费格林, H·盖普 申请人:泰肯贸易股份公司