具有微卫星区域的dna的检测方法

具有微卫星区域的dna的检测方法
【专利摘要】本发明的课题在于提供一种不产生非特异性反应产物的问题、能够以良好的精度检测具有微卫星区域的DNA的方法。本发明涉及“一种通过下述步骤来检测具有微卫星区域的DNA的方法：(1)使具有微卫星区域的DNA和不具有与该微卫星区域互补的碱基序列而与该微卫星区域的两侧的碱基序列杂交的探针接触，形成具有包含微卫星区域的环结构的所述DNA和所述探针的杂交体；(2)将所得到的杂交体分离出来；(3)对该杂交体进行检测”；以及“DNA和探针的杂交体，其是使具有微卫星区域的DNA和探针接触而具有包含微卫星区域的环结构的所述DNA和所述探针的杂交体，所述探针不具有与该微卫星区域互补的碱基序列而与该微卫星区域的两侧的碱基序列杂交”。
【专利说明】具有微卫星区域的DNA的检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用环杂交法来检测具有微卫星区域的DNA的方法以及通过环杂交 法得到的杂交体。

【背景技术】
[0002] 1?6碱基作为一个单位并重复而形成的重复序列被称为微卫星区域，已知其大 量存在于人的基因组序列等许多哺乳类动物中，在人基因组中存在3000处以上。该微卫星 区域显示出其重复次数（重复数）不同的多态性，因此已知作为各种基因解析的标记是有 用的。另外还已知，在微卫星区域位于基因的蛋白编码区域时，其重复数的差异会成为疾病 的原因，为了调查基因与疾病的相关关系，对微卫星区域进行了各种研究。
[0003] 具有这种微卫星区域的DNA的多态性解析方法中，通常通过在PCR扩增后利用变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳对其片段进行分离分析来进行解析。但是，在进行微 卫星DNA的多态性解析的情况下，需要利用30cm的毛细管进行电泳或利用40cm长的变性 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，因此存在价格昂贵、需要专业技术等问题。
[0004] 另一方面，作为变异基因的检测方法，已知下述环杂交法（LH法）：其在DNA片段 的PCR反应后的反应液中添加单链低聚DNA与目标DNA片段杂交，根据所得到的杂交体的 结构差异用电泳法进行分离，由此判断变异基因（专利文献1)。另外，还有利用该LH法进 行具有微卫星区域的UGT1A1的变异基因的检测（非专利文献1)。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1 :日本特开2007-61080 [0008] 非专利文献
[0009] 非专利文献 1 :Clinica Chimica Acta, 412, 1688-1672


【发明内容】

[0010] 发明要解决的课题
[0011] 由于不存在需要昂贵的设备和专业技术的问题，因此本发明人对非专利文献1中 记载的方法（现有的LH法）进行了研究。但是，在使用该现有的LH法时，本发明人发现大 量产生了目标杂交体以外的非特异性反应产物，因此会发生难以确定目标物的问题。即，在 现有的LH法中，以仅仅野生型DNA和变异型DNA的分离为目的，因此只要这些泳动带或泳 动峰与非特异性反应产物的泳动带或泳动峰偏离就不会有问题。但是，在由于微卫星区域 的重复数不同而对多态性进行分离的情况下，可知非特异性反应产物有时会妨碍目标物的 检测。根据这样的状况，本发明的目的在于，利用形成具有特定环结构的杂交体的LH法，提 供一种不发生上述那样的非特异性反应产物的问题、能够以良好的精度检测具有微卫星区 域的DNA的方法。
[0012] 用于解决课题的方案
[0013] 即，本发明人针对利用LH法对具有微卫星区域的DNA进行检测的方法进行了深 入研究，结果发现，在探针与目标DNA杂交时，通过以微卫星区域全部进入环结构内的方式 合成探针，由此几乎不产生非特异性反应产物，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下方 案：
[0014] "一种检测具有微卫星区域的DNA的方法，其通过下述步骤来检测：
[0015] (1)使具有微卫星区域的DNA和探针接触，形成所述DNA和所述探针的杂交体，所 述杂交体具有包含微卫星区域的环结构，所述探针不具有与该微卫星区域互补的碱基序列 而与该微卫星区域的两侧的碱基序列杂交；
[0016] (2)将所得到的杂交体分离出来；
[0017] (3)对该杂交体进行检测。"；以及
[0018] "DNA和探针的杂交体，其是使具有微卫星区域的DNA和探针接触而具有包含微卫 星区域的环结构的所述DNA和所述探针的杂交体，所述探针不具有与该微卫星区域互补的 碱基序列而与该微卫星区域的两侧的碱基序列杂交。"
[0019] 发明的效果
[0020] 根据本发明，能够简便且以良好的精度检测具有微卫星区域的DNA。
[0021] 另外，即使是具有重复数（反复数）不同的微卫星区域的DNA，也能够根据重复数 (反复数）的长度进行分离，并且几乎不产生在现有的LH法中大量产生的非特异性反应产 物，因此能够以高精度检测目标DNA而无检测错误。
[0022] 特别令发明人感到完全意外的是，发明人发现：如本发明这样以微卫星区域全部 进入环结构内的方式来合成探针时，几乎不生成非特异性反应产物并且能够利用重复数的 差异而对重复数不同的变异多态性进行检测。
[0023] S卩，以往检测有无一碱基置换是主要目的，按照置换碱基存在于环结构的开始 (立6上# >9 )部分的方式来设计探针。因此，在微卫星区域具有变异的情况下，按照微卫 星区域位于环结构的开始部分、即微卫星区域的一部分与探针结合、一部分形成环结构的 方式来设计探针。由此，预料之外的效果是，通过以微卫星区域全部进入环结构内的方式来 设计探针，几乎不生成非特异性反应产物并且能够利用重复数的差异而对重复数不同的变 异多态性进行检测。

【专利附图】

【附图说明】
[0024] 图1表示关于9种T0MM40基因的poly-T链长多态性利用电泳对由本发明的方法 得到的LH反应产物进行分离的结果。
[0025] 图2表示关于9种T0MM40基因的poly-T链长多态性利用电泳对由现有的LH法 得到的LH反应产物进行分离的结果。
[0026] 图3表示关于3种T0MM40基因的长链poly-T多态性利用电泳对由本发明的方法 得到的LH反应产物进行分离的结果（3-a)、和利用电泳对由现有的LH法得到的LH反应产 物进行分离的结果（3-b和3-c)。
[0027] 图4表示关于5种雄激素受体（AR)基因序列中的CAG重复多态性利用电泳对由 本发明的方法得到的LH反应产物进行分离的结果。
[0028] 图5表示关于8种雄激素受体（AR)基因序列中的CAG重复多态性利用电泳对由 现有的LH法得到的LH反应产物进行分离的结果。

【具体实施方式】
[0029] 「具有本发明的微下.星区域的DNA1
[0030] 本发明的微卫星区域表示由通常1?6碱基、优选1?3碱基作为一个单位并重 复而形成的重复碱基序列所构成的区域。重复碱基序列中的作为重复基准的一个单位的序 列（下文中简记为单位序列）的重复数（反复数）通常为2?100、优选为5?100、更优 选为5?50。但是，在重复碱基序列的单位序列为1碱基的情况下，其重复数至少为3以 上。这是因为，本发明的杂交体中的环结构有时也会仅由微卫星区域构成，因此若不至少为 3碱基以上则无法形成环结构。作为该微卫星区域的碱基数，通常为3?600碱基、优选为 5?600碱基、更优选为5?300碱基。作为上述微卫星区域的具体序列，在重复碱基序列 的单位序列为1碱基的情况下，可以举出P〇lyT、P〇lyA等；在为2碱基的情况下，可以举出 由CA重复构成的序列等；在为3碱基的情况下，可以举出由CAG、CTG、CGG的重复构成的序 列等。
[0031] 作为具有本发明的微卫星区域的DNA(下文中有时简记为本发明的DNA)，只要是 具有上述微卫星区域、且该微卫星区域前后的通常5?1000碱基、优选5?500碱基、更优 选5?100碱基的碱基序列为已知的单链DNA，则可以为任意的DNA。其中，微卫星区域更 优选微卫星区域的单位序列的重复数不同的DNA(多态性DNA)。作为具体的DNA，可以举出 由动物、微生物、细菌、植物等生物分离的基因组DNA片段；能够由病毒分离的DNA片段；和 以mRNA为模板而合成的cDNA片段等，其中，作为优选的例子可以举出来自人细胞的癌基 因。另外，上述DNA的链长（作为检测对象的链长）通常为13?2000碱基、优选为13? 1000碱基、更优选为13?200碱基。需要说明的是，如后所述本发明的探针是以特定的微 卫星区域作为检测对象所制作的，因此本发明的DNA可以具有作为检测对象的微卫星区域 以外的1个以上的微卫星区域（第二微卫星区域），作为第二微卫星区域，优选其单位序列 与作为检测对象的微卫星区域的单位序列不同。
[0032] 对于上述DNA，优选尽可能纯化，除去DNA片段以外的多余成分。具体来说，优选根 据例如使用二氧化娃载体的Boom法（Boom et al. J. Clin. Microbiol. 28:495-503 (1990))、 使用碘化钠溶液的方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76-2, p615-619 (1979))等常规方法进 行纯化。另外，也可以使用通过本身公知的聚合酶链反应（PCR反应）、例如Nucleic Acids Research, 1991，Vol. 19, 3749、BioTechniques, 1994, Vol. 16, 1134-1137 中记载的方法将目 标DNA扩增而成的物质。
[0033] 本发明的DNA形成双链的情况下，利用通常该领域中进行的加热处理（90°C? 100°C )或碱处理（基于氢氧化钠等的处理）等将双链DNA单链化而得到本发明的DNA即 可。
[0034] 「本发明的探针1
[0035] 本发明的探针与上述本发明的DNA杂交而形成具有环结构的杂交体，不具有与作 为检测对象的微卫星区域互补的碱基序列。即，其是不与作为检测对象的微卫星区域结合、 而与微卫星区域的两侧的碱基序列结合的碱基序列。例如，可以举出从本发明的DNA中除 去了微卫星区域后的序列的互补链、从具有本发明的微卫星区域的DNA中除去了微卫星区 域和其前后1?10碱基后的序列的互补链等。更具体来说，本发明的探针可以举出下述序 列：按照从微卫星区域的3'端起相邻1?11碱基的碱基的互补碱基和从微卫星区域的5' 端起相邻1?11碱基的碱基的互补碱基结合的方式，使从微卫星区域的3'端起向着具有 微卫星区域的DNA的3'端方向以相邻1?11碱基的碱基起始的通常5?1000碱基、优选 5?200碱基、更优选5?100碱基的碱基序列的互补链；与从微卫星区域的5'端起向着 具有微卫星区域的DNA的5'端方向以相邻1?11碱基的碱基起始的通常5?1000碱基、 优选5?200碱基、更优选5?100碱基的碱基序列的互补链结合而成的序列。这样的探 针在与本发明的DNA杂交时，形成具有环结构的杂交体。该情况下，本发明的环结构仅由微 卫星区域构成，或者由微卫星区域和其两侧或一侧的1?10碱基的碱基构成。
[0036] 本发明的探针优选下述序列：按照从微卫星区域的3'端起相邻1碱基的碱基的互 补碱基和从微卫星区域的5'端起相邻1碱基的碱基的互补碱基结合的方式，使从微卫星区 域的3'端起向着具有微卫星区域的DNA的3'端方向以相邻1碱基的碱基起始的通常5? 1000碱基、优选5?200碱基、更优选5?100碱基的碱基序列的互补链；与从微卫星区域 的5'端起向着具有微卫星区域的DNA的5'端方向以相邻1碱基的碱基起始的通常5? 1000碱基、优选5?200碱基、更优选5?100碱基的碱基序列的互补链结合而成的序列。 该情况下，本发明的环结构仅由微卫星区域构成。
[0037] 需要说明的是，对于本发明的探针，在本发明的检测方法中如后述那样杂交体具 有突出末端的情况下，优选进行平滑末端化处理，因此不需要与由本发明的DNA的碱基序 列除去了微卫星区域或微卫星区域和与其相邻的1?20碱基的碱基而成的全部碱基序列 结合。
[0038] 本发明的探针的链长通常为10?2000碱基、优选为10?1000碱基、更优选为 10?200碱基。
[0039] 通过使用上述探针与上述本发明的DNA杂交，能够形成在本发明的DNA上具有由 微卫星区域、或者微卫星区域和与其3'端或/和5'端相邻的一侧或两侧的1?10碱基的 碱基序列构成的环结构的杂交体。
[0040] 另外，本发明的DNA具有第二微卫星区域的情况下，本发明的探针在杂交体形成 时可以与该第二微卫星区域形成双链，也可以使该第二微卫星区域为环结构。但是，该第 二微卫星区域的任一单位序列与作为检测对象的微卫星区域的单位序列相同时，本发明的 探针优选使该第二微卫星区域为环结构。这是因为能够避免以下现象发生的可能性：发生 与和设计探针的重复序列不同的重复序列结合等的结合错误，产生复数个非特异性反应产 物。由该第二微卫星区域形成的环结构也优选包含全部第二微卫星区域，但若探针中不存 在与作为检测对象的微卫星区域相同的单位序列的互补链（互补碱基），则也可以仅包含 微卫星区域的一部分。在使用这样的探针时，所得到的杂交体形成复数个环结构。
[0041] 「本发明的杂夺体1
[0042] 本发明的杂交体是使本发明的DNA与本发明的探针结合（杂交）而得到的，如上 述那样在本发明的DNA上形成环结构，并且该环结构包含全部微卫星区域。即，该杂交体由 2处双链碱基部分和被它们夹持的（存在于它们之间的）单链碱基部分的环结构构成。需 要说明的是，该杂交体可以具有突出末端，但由于有可能会对分离造成影响，因此优选不具 有突出末端。在被2处双链碱基部分夹持的部位，具有环结构的碱基链的相反侧的碱基链 可以具有1?2碱基的单链碱基。另外，该杂交体也可以在具有环结构的碱基序列的相反 侧进一步形成其他环结构，在杂交体的两侧具有环结构。此外，本发明的DNA具有第二微 卫星区域、其中的至少一个单位序列与作为检测对象的微卫星区域的单位序列相同的情况 下，优选在本发明的DNA上进一步形成由第二微卫星区域的全部或一部分形成的环结构。
[0043] 上述环结构由在基因组DNA上制作的不与探针杂交的（不形成碱基对的）单链碱 基链构成，在杂交体中形成环状的二次结构（立体结构）。该环结构通常由3?600碱基、 优选5?600碱基、更优选5?300碱基构成。
[0044] 上述2处双链碱基部分各自独立地由通常5?1000碱基对、优选5?500碱基对、 更优选5?100碱基对构成。需要说明的是，该双链碱基可以根据探针的种类和后述的LH 法的方式而具有突出末端。
[0045] 如上所述，本发明的杂交体在环结构中包含全部微卫星区域，因此在检测微卫星 区域不同的DNA多态性时，若使用相同的探针来形成杂交体，则所形成的环结构的形状、大 小、电荷等不同。因此，根据分子量的差异、分子结构的差异或/和电荷的差异等将包含微 卫星区域不同的DNA的杂交体分离，从而能够以良好的精度对它们进行分离识别。现有的 LH法中的杂交体也形成了环结构，但不是全部微卫星区域包含在环结构内，因此会产生目 标杂交体以外的杂交体（非特异性反应产物），这些非特异性反应产物会阻碍目标杂交体 的检测。虽然产生该非特异性反应产物的理由不确定，但可以认为：以探针与微卫星区域的 一部分结合的方式包含与微卫星区域的一部分互补的序列，因此在形成杂交体时，该探针 的互补序列与在微卫星区域存在复数个的重复序列结合，其结果，形成具有不同环结构的 各种杂交体（非特异性反应产物）。即，可以推测：探针中的重复序列的互补序列和与所设 定的重复序列不同的重复序列结合，由此产生各种非特异性反应产物。
[0046] 下面示出使用本发明的探针形成杂交体时本发明的杂交体的示意图。即，该情况 下，结合与本发明的DNA的卫星区域的两侧的碱基序列（A'和B'）互补的碱基序列（A和 B)而设计了探针。若利用该探针与本发明的DNA杂交，则微卫星区域形成环结构，形成具有 包含全部微卫星区域的环结构的杂交体。
[0047]

【权利要求】
1. 一种检测具有微卫星区域的DNA的方法，其通过下述步骤来检测： (1) 使具有微卫星区域的DNA和探针接触，形成所述DNA和所述探针的杂交体，所述杂 交体具有包含微卫星区域的环结构，所述探针不具有与该微卫星区域互补的碱基序列而与 该微卫星区域的两侧的碱基序列杂交； (2) 将所得到的杂交体分离出来； (3) 对该杂交体进行检测。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，探针为以下序列：按照从微卫星区域的3'端起相 邻1?11喊基的喊基的互补喊基和从微卫星区域的5'端起相邻1?11喊基的喊基的互 补碱基结合的方式，使从微卫星区域的3'端起向着具有微卫星区域的DNA的3'端方向以 相邻1?11碱基的碱基起始的5?1000碱基的碱基序列的互补链、与从微卫星区域的5' 端起向着具有微卫星区域的DNA的5'端方向以相邻1?11碱基的碱基起始的5?1000 碱基的碱基序列的互补链结合而成的序列。
3. 如权利要求1所述的方法，其中，探针为以下序列：按照从微卫星区域的3'端起相 邻1喊基的喊基的互补喊基和从微卫星区域的5'端起相邻1喊基的喊基的互补喊基结合 的方式，使从微卫星区域的3'端起向着具有微卫星区域的DNA的3'端方向以相邻1碱基 的喊基起始的5?1000喊基的喊基序列的互补链、与从微卫星区域的5'端起向着具有微 卫星区域的DNA的5'端方向以相邻1喊基的喊基起始的5?1000喊基的喊基序列的互补 链结合而成的序列。
4. 如权利要求1所述的方法，其中，微卫星区域中，作为重复的基准的一个单位的重复 数为2?100。
5. 如权利要求1所述的方法，其中，微卫星区域中，作为重复的基准的一个单位的重复 数为5?100。
6. 如权利要求1所述的方法，其中，分离杂交体的方法是基于分子量、分子结构和电荷 中的至少1种进行分离的方法。
7. 如权利要求1所述的方法，其中，分离杂交体的方法为电泳法。 8. DNA和探针的杂交体，其是使具有微卫星区域的DNA和探针接触而具有包含微卫星 区域的环结构的所述DNA和所述探针的杂交体，所述探针不具有与该微卫星区域互补的碱 基序列而与该微卫星区域的两侧的碱基序列杂交。
9. 如权利要求8所述的杂交体，其中，探针为以下序列：按照从微卫星区域的3'端起相 邻1?11喊基的喊基的互补喊基和从微卫星区域的5'端起相邻1?11喊基的喊基的互 补碱基结合的方式，使从微卫星区域的3'端起向着具有微卫星区域的DNA的3'端方向以 相邻1?11碱基的碱基起始的5?1000碱基的碱基序列的互补链、与从微卫星区域的5' 端起向着具有微卫星区域的DNA的5'端方向以相邻1?11碱基的碱基起始的5?1000 碱基的碱基序列的互补链结合而成的序列。
10. 如权利要求8所述的杂交体，其中，探针为以下序列：按照从微卫星区域的3'端起 相邻1喊基的喊基的互补喊基和从微卫星区域的5'端起相邻1喊基的喊基的互补喊基结 合的方式，使从微卫星区域的3'端起向着具有微卫星区域的DNA的3'端方向以相邻1碱 基的喊基起始的5?1000喊基的喊基序列的互补链、与从微卫星区域的5'端起向着具有 微卫星区域的DNA的5'端方向以相邻1喊基的喊基起始的5?1000喊基的喊基序列的互 补链结合而成的序列。
【文档编号】C12N15/09GK104204203SQ201380015175
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年3月22日 优先权日:2012年3月22日
【发明者】松隈章一, 石川友一, 黑泽龙雄 申请人:和光纯药工业株式会社, 地方独立行政法人神奈川县立医院机构