使用序列标签的序列确定方法
【专利摘要】本发明涉及使用序列标签以改善相关序列的扩增子特别是大的和复杂的扩增子，例如包含编码免疫受体分子的重组核酸的扩增子的序列确定。在一个方面，比对具有相同序列标签的序列读段(read)，然后，由在每个位置的序列读段碱基响应(base call)的(可能加权的)平均碱基响应确定最终碱基响应。相似地，在另一个方面，通过共同序列标签比对包括一系列的掺入信号的序列读段，并且均聚物区域中的碱基响应被作为在每个“流”位置的功能掺入信号值。
【专利说明】使用序列标签的序列确定方法
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月15日申请的美国专利申请序列号13/835,093的优先权， 美国专利申请序列号13/835, 093要求以下美国临时专利申请的优先权：2012年6月11日 申请的序列号61/658, 317、2012年12月17日申请的序列号61/738, 277以及2013年3月 11日申请的序列号61/776, 647,它们每个的全文通过引用并入本文。本申请还要求全文通 过引用并入本文的2013年5月30日申请的美国临时专利申请序列号61/829,054的优先 权。
[0003] 发明背景
[0004] 生物或医学样品的分析通常需要确定DNA和/或RNA的大的和复杂的群体 的核酸序列，例如 Gloor 等，PLoS ONE 5(10) :el5406 (2010) ;Petrosino 等，Clinical Chemistry, 55(5):856-866 (2009) ;Arstila 等，Science, 286:958-961(1999)。尤其 地，编码免疫分子，例如T细胞或B细胞受体或它们的组分的核酸谱包含大量的关于有 机体的健康或疾病状态的信息，使得已经提出使用这样的谱作为许多健康状况的诊断 或预后指标，例如Faham和Willis，美国专利公开2010/0151471 ;Freeman等，Genome Research, 19 :1817-1824 (2009) ;Boyd 等，Sci. Transl. Med.，1 (12) : 12ra23 (2009) ;He 等， 0ncotarget(2011年3月8日）。这样的基于序列的谱能够比基于扩增的革E核酸的大小分 布、通过微阵列的序列取样、来自PCR扩增子的杂交动力曲线的方法或其它方法灵敏得多， 例如Morley等，美国专利5, 418, 134 ;van Dongen等，Leukemia, 17:2257-2317(2003) ;0gle 等，Nucleic Acids Research, 31: el39 (2003) ;Wang 等，BMC Genomics, 8:329 (2007) ;Baum 等，Nature Methods, 3(11) :895-901(2006)。然而，因为待分析的群体的大小、这样的群体 中序列的相似性、序列之间天然变异的有限可预测性以及由许多样品制备和测量步骤引入 数据的噪音，从序列数据有效确定克隆型（clonotype)和克隆型谱（clonotype profile) 构成挑战，例如 Warren 等，Genome Research, 21 (5) : 790-797 (2011) 〇
[0005] 序列标签或条形码已经以多种方式用于辅助核酸群体的分析，包括标记、 污染监测、罕见突变检测、物理排序、分子计数等，例如Kinde等，Proc. Natl. Acad. Sci. ,108 (23) :9530-9535 (2011) ;Casbon 等，美国专利公开 2012/0071331 出renner,美国 专利 5, 635, 400 ;Brenner 和 Macevicz，美国专利 7, 537, 897 ;Brenner 等，Proc. Natl. Acad. Sci. ,97:1665-1670(2000) ;Church 等，欧洲专利公开 0 303 459 ;Shoemaker 等，Nature Genetics, 14:450-456(1996) ;Morris 等，欧洲专利公开 0799897A1 ;Wallace,美国专利 5, 981，179。最近，Kinde等（以上引用）显示了序列标签如何能用于区分测序和扩增错误 与参照序列中的罕见突变。
[0006] 考虑到用于医疗和诊断应用的准确测序的重要性，如果序列标签的使用可以就提 高序列确定的效率和准确性而在这类应用中扩展，那么它将高度有益。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明涉及用于产生复杂的核酸群体的基于序列的谱的方法，所述复杂的核酸群 体特别是编码免疫分子或其部分的组库（repertoire)的重组核酸群体。在许多实施方式 和应用中示例了本发明，它们的一些总结于以下并遍及说明书中。
[0009] 在一个方面，本发明涉及确定免疫组库的克隆型的方法，所述方法包括步骤：(a) 从个体获得包含T细胞和/或B细胞的样品；(b)将序列标签附接到T细胞受体基因或者T 细胞和/或B细胞的免疫球蛋白基因的重组核酸的分子，以形成标签-分子轭合物，其中所 述标签-分子轭合物的基本上每个分子具有独特的序列标签；(c)扩增所述标签_分子轭 合物；(d)测序所述标签_分子轭合物；以及（e)比对相似序列标签的序列读段（read)以 确定相应于所述组库的相同克隆型的序列读段。
[0010] 在另一方面，本发明涉及在正被监测微小残留病（minimal residual disease)的 患者中检测克隆型残留污染（carry over contamination)的方法，包括步骤：（a)通过根 据权利要求A1的方法定期地测量患者的克隆型谱而监测患者的微小残留病；(b)记录克隆 型谱的每个测量的所述序列标签；以及（c)如果在后面的克隆型谱中检测到任何先前的克 隆型谱的序列标签，则检测到克隆型残留污染。
[0011] 在另一个方面，本发明涉及确定样品中淋巴细胞的数目的方法，包括下述步骤： (a)从个体获得包含淋巴细胞的样品；(b)将序列标签附接到所述淋巴细胞的T细胞受体基 因或免疫球蛋白基因的重组核酸的分子，以形成标签-分子轭合物，其中所述标签-分子轭 合物的基本上每个分子具有独特的序列标签；（c)扩增所述标签_分子轭合物；（d)测序所 述标签-分子轭合物；（e)计数不同的序列标签的数目，以确定样品中淋巴细胞的数目。
[0012] 在另一方面，本发明涉及在一个或更多个合成测序反应中确定一个或更多个多核 苷酸的核苷酸序列的方法，包括步骤：(a)将序列标签附接到所述一个或更多个多核苷酸 的每个，以形成标签-多核苷酸轭合物，其中所述标签-多核苷酸轭合物的基本上每个多 核苷酸具有独特的序列标签；(b)扩增所述标签-多核苷酸轭合物；（c)合成测序扩增的标 签-多核苷酸轭合物，其中合成测序包括至少一个dNTP流；以及（d)对于具有相同序列标 签的每个标签-多核苷酸，确定每个dNTP流的核苷酸掺入的数目，该数目作为每个这样的 dNTP流的测量的掺入信号的函数。
[0013] 本发明提供了从通过高通量测序编码免疫分子的体细胞重组的核酸获得的序列 数据的大的集合确定克隆型和克隆型谱的方法。在一个方面，本发明通过用独特的序列标 签标记样品中的每个体细胞重组的核酸分子而实施上述方法，所述独特的序列标签用于将 来自样品的包含相同克隆型序列的拷贝的序列读段分组。
[0014] 以上表征的本发明的这些方面以及其它方面，在所说明的许多实施方式和应用中 例示，其中一些在附图中示出，并在随后的权利要求书部分进行表征。然而上述概述并非旨 在描述所说明的本发明的每个实施方案或每个实施方式。
[0015] 附图简述
[0016] 本发明的新颖特征在随附的权利要求中具体阐述。通过参考以下阐述其中利用本 发明原理的示例性实施方案的详述和附图，获得对本发明的特征及优点的更好的理解，在 附图中：
[0017] 图1A-1B图示了通过取样而标记以将独特的序列标签附接到核酸分子的实例。
[0018] 图1C图示了IgH转录本，以及其内的天然变异的来源。
[0019] 图2A-2C显示了用于扩增重组的核酸分子的两阶段PCR(a two-staged PCR)方 案。
[0020] 图3图示了从与相同序列标签缔合的序列读段确定克隆型的序列的步骤的一个 实施方式。
[0021] 图4A-4D图示了本发明的涉及在合成测序操作中确定均聚物区域的实施方案。
[0022] 发明详述
[0023] 除非另外表明，本发明的实施可使用分子生物学（包括重组技术）、生物信息学、 细胞生物学和生物化学的常规技术和说明，它们在本领域的技术范围内。这样的常规技术 包括但不限于血细胞的取样和分析、核酸测序和分析等。合适的技术的具体说明还可参 考本文以下实例。然而，当然可使用其它等同的常规方法。可在标准的实验室手册例如 Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols. I-IV)、PCR primier:A Laboratory Manual、和Molecular Cloning:A Laboratory Manual (全部来自冷泉港实验室出版社）等 中找到这样的常规技术和说明。
[0024] 在一个方面，本发明涉及从免疫分子的组库获得并分析序列数据以快速并有效地 确定克隆型谱的方法，所述免疫分子例如T细胞受体（TCR)或B细胞受体（BCR)或其限定的 片段。序列数据通常包括来自用于分析免疫分子的DNA测序仪的序列读段的大的集合，所 述序列读段即碱基响应（base call)的序列和相关的质量分数（quality score)。构建克 隆型谱的一个主要挑战为快速地和准确地区分包含真的差异的序列读段与包含来自非生 物来源例如提取步骤、测序化学、扩增化学等的错误的那些。本发明的一个方面包括将独特 的序列标签附接到样品中的每个克隆型，以辅助确定这样的轭合物的序列读段是否源自相 同来源的克隆型。根据本发明的一个方面，序列标签被附接到体细胞重组的核酸分子，以形 成标签_分子轭合物，其中这样的轭合物的每个重组核酸具有独特的序列标签。通常，在从 包含T细胞和/或B细胞的样品提取核酸分子后进行这样的附接。优选地，如通过用于序 列的常规距离测量如Hamming距离等确定的，此类独特的序列标签彼此的差异尽可能大。 通过使标签-分子轭合物中序列标签之间的距离最大化，甚至具有高比率的测序错误和扩 增错误，相比不同的轭合物的任何其它标签序列，轭合物的序列标签保持远接近于其原始 的（ancestoral)标签序列。例如，如果使用16-mer的序列标签，并且克隆型集合上的每个 这样的标签与克隆型上每个其他序列标签具有至少50%或8个核苷酸的Hamming距离，则 必需至少8个测序错误或扩增错误，以将一个这样的标签转变为另一个用于序列标签的错 误读段（以及具有错的序列标签的克隆型的序列读段的不正确的分组）。在一个实施方案 中，选择序列标签使得在附接至重组核酸分子以形成标签-分子轭合物之后，标签-分子轭 合物的标签之间的Hamming距离为这样的序列标签的总长度的至少25%的数目（即，每个 序列标签与每个其他的这样的标签在序列上至少具有其核苷酸的至少25%的差异）；在另 一个实施方案中，这样的序列标签之间的Hamming距离为这样的序列标签的总长度的至少 50%的数目。
[0025] 在一个方面，通过以下步骤实施本发明：(a)从个体获得包括T细胞和/或B细 胞的样品；(b)将序列标签附接到T细胞受体基因或T细胞和/或B细胞的免疫球蛋白基 因的重组核酸分子，以形成标签-分子轭合物，其中所述标签-分子轭合物的基本上每个 分子具有独特的序列标签；（c)扩增所述标签-分子轭合物；（d)测序所述标签-分子轭 合物；以及（e)比对相似序列标签的序列读段，以确定相应于组库的相同克隆型的序列读 段。如以下更全面地描述的，使用常规技术获得包含B细胞或T细胞的样品。在附接序列 标签的步骤中，优选地，序列标签不仅独特，而且彼此的差别足够大，使得甚至大量测序错 误或扩增错误转变一个序列标签成另一个序列标签的可能性接近零。在附接序列标签后， 大多数测序技术必需扩增标签-分子轭合物；然而，在使用单分子测序技术时，扩增步骤是 任选的。单分子测序包括但不限于单分子实时（SMRT)测序、纳米孔测序等，例如美国专利 7, 313, 308、8, 153, 375、7, 907, 800、7, 960, 116、8, 137, 569 ;Manrao 等，Nature Biotechnolo gy, 4 (8): 2685-2693 (2012)等。
[0026]在另一方面，本发明包括通过计数独特的序列标签而确定样品中淋巴细胞的数目 的方法。甚至没有序列标签的情况下，TCR0或IgH基因的克隆型，特别是包括V(D)J区的 那些，给淋巴细胞及其克隆提供独特的标记。在重组核酸是从基因组DNA获得时，可通过测 序后计数的独特的克隆型的数目而估计样品中淋巴细胞的计数。当存在与相同克隆型相关 的相同的淋巴细胞的显著的克隆群体时（或者当重组的核酸是从其个体序列的量可反映、 或依赖于表达率及细胞数目的样品mRNA获得时），该方法失效。序列标签的使用克服了该 缺点，并且特别地可用于在患许多淋巴紊乱（例如淋巴瘤或白血病）的患者中提供淋巴细 胞计数。根据本发明的一个方面，序列标签可用于获得样品中淋巴细胞的绝对计数，无论是 否存在大的显性克隆，例如白血病。可用下述步骤实施这样的方法：(a)从个体获得包含淋 巴细胞的样品；(b)将序列标签附接到所述淋巴细胞的T细胞受体基因或免疫球蛋白基因 的重组核酸的分子，以形成标签-分子轭合物，其中所述标签-分子轭合物的基本上每个分 子具有独特的序列标签；（c)扩增所述标签-分子轭合物；(d)测序所述标签-分子轭合物； 以及（e)计数不同的序列标签的数目，以确定所述样品中淋巴细胞的数目。在一些实施方 案中，重组核酸分子来自基因组DNA。
[0027]在本发明的一个实施方案中，序列标签通过取样标记而附接到样品的重组核酸分 子上，例如 Brenner 等，美国专利 5, 846, 719 ;Brenner 等，美国专利 7, 537, 897 ;Macevicz， 国际专利公开W0 2005/111242等中公开的，它们通过引用并入本文。在通过取样标记中， 将被标记（或独特地标记）的群体的多核苷酸用于（通过附接、连接等）取样大得多的群 体的序列标签。即，如果多核苷酸群体具有K个成员（包括相同多核苷酸的重复），并且序 列标签的群体具有N个成员，则N?K。在一个实施方案中，本发明使用的序列标签群体的大 小为样品中克隆型群体大小的至少10倍；在另一个实施方案中，本发明使用的序列标签群 体的大小为样品中克隆型群体大小的至少100倍；并且在另一个实施方案中，本发明使用 的序列标签群体的大小为样品中克隆型群体大小的至少1000倍。在其它实施方案中，选择 序列标签群体的大小，使得当这样的克隆型与这样的序列标签群体在例如附接反应（诸如 连接反应、扩增反应等）中组合时，样品中基本上每个克隆型将具有独特的序列标签。在一 些实施方案中，基本上每个克隆型意指至少90%的这样的克隆型将具有独特的序列标签； 在其它实施方案中，基本上每个克隆型意指至少99%的这样的克隆型将具有独特的序列标 签；在其它实施方案中，基本上每个克隆型意指至少99. 9%的这样的克隆型将具有独特的 序列标签。在许多组织样品或活体组织切片中，T细胞或B细胞的数目可达到或为约1百万 细胞；因此，在本发明的一些实施方案中使用这样的样品，在通过取样标记中使用的独特序 列标签的数目为至少1〇 8,或者在其它实施方案中为至少1〇9。
[0028]在其中达1百万的克隆型被通过取样标记的实施方案中，可通过在合成反应的每 个添加步骤使全部四种核苷酸前体的混合物反应的组合合成有效地生产序列标签的大的 集合，例如，如在通过引用并入本文的Church的美国专利5, 149, 625中公开的。结果为具 有"NA. . . Nk"结构的序列标签的大的集合，其中，每种队=A、C、G或T，并且k为标签中核 苷酸的数目。这样的组合合成产生的序列标签的集合中序列标签的数目为4 k。因此，具有 至少14的k或约14至18的范围内的k的这样的序列标签的集合适于通过取样标记而将 序列标签附接到1〇 6个成员的分子群体。具有上述结构的序列标签的集合包括许多在实施 本发明的方法时可引入差异或错误的序列。例如，上述组合合成的序列标签的集合包括许 多具有均聚物片段的成员标签，一些测序方法例如合成测序方法难于准确地确定上述均聚 物片段的确定长度。因此，本发明包括具有对于特定的方法步骤例如测序有效的结构的组 合合成的序列标签。例如，可通过将四种天然的核苷酸分成在组合合成中交错地使用的不 相交的子集而产生对于合成测序有效的数个序列标签结构，从而防止均聚物分割成上述指 定的长度。例如，使z为A或C，并且x为G或T，以产生如下结构的序列标签：
[0029] [ (z)! (z) 2. ? ? (z) J [ (x)! (y) 2... (x)』]…
[0030] 其中，i和j相同或不同，选择i和j以限制任何均聚物片段的大小。在一个实施 方案中，i和j在1至6的范围内。在这样的实施方案中，序列标签可具有12至36个核苷 酸范围内的长度；并且在其它实施方案中，这样的序列标签可具有12至24个核苷酸范围内 的长度。在其它实施方案中，可使用其它核苷酸配对，例如，z为A或T，并且x为G或C;或 者，z为A或G，并且x为T或C。可选地，使z'为四种天然核苷酸的三种的任意组合，并且 使x'为不是z'的任何核苷酸（例如，z'为A、C或G，并且X'为T)。这产生了如下的序列 标签：
[0031] [(z'Mz'h... (2，）上，[(z'Mz'h... (z'^x，…
[0032] 其中如上选择i，并且x'的出现作为插入以终止任何非期望的均聚物。
[0033] 其灾的序列标答
[0034] 本发明使用了在扩增和测序前用独特的序列标签标记核酸例如基因组DNA片段 的方法，所述独特的序列标签可包括"嵌合标签（mosaic tag)"。这样的序列标签可用于识 别扩增和测序错误。嵌合标签使现有技术的完全随机的序列标签可能出现的由于不适当的 退火、引发（priming)、发卡形成等所致的测序和扩增人工产物最小化。在一个方面，嵌合标 签为包括交错的恒定区和可变区的序列标签，其中，每个恒定区在嵌合标签中具有位置，并 包括预定序列的核苷酸，并且每个可变区在嵌合标签中具有位置，并包括预定数目的随机 选择的核苷酸。通过图示的方式，22-mer的嵌合标签（SEQ ID N0:4)可具有下述形式：
[0035] 核苷酸位置：
[0036]
【权利要求】
1. 一种确定免疫组库的克隆型的方法，所述方法包括步骤： (a) 从个体获得包含T细胞和/或B细胞的样品； (b) 将序列标签附接到T细胞受体基因或者T细胞和/或B细胞的免疫球蛋白基因的 重组核酸的分子，以形成标签-分子轭合物，其中所述标签-分子轭合物的基本上每个分子 具有独特的序列标签； (c) 扩增所述标签-分子轭合物； (d) 测序所述标签-分子轭合物；以及 (e) 比对相似序列标签的序列读段以确定相应于所述组库的相同克隆型的序列读段。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述比对的步骤还包括通过在所述相似序列标签 的所述克隆型的每个核苷酸位置确定大多数核苷酸而确定每个所述标签-分子轭合物的 每个所述克隆型的核苷酸序列。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述附接的步骤包括通过取样标记所述重组核酸 的分子。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述附接的步骤在反应混合物中实施，使得所述 序列标签以所述重组核酸的分子的浓度的至少100倍的浓度存在于所述反应混合物中。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述序列标签被掺入对于所述重组核酸的分子特 异的引物中。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述序列标签为嵌合标签。
7. -种确定样品中淋巴细胞的数目的方法，所述方法包括步骤： (a) 从个体获得包含淋巴细胞的样品； (b) 将序列标签附接到所述淋巴细胞的T细胞受体基因或免疫球蛋白基因的重组核酸 的分子，以形成标签-分子轭合物，其中所述标签-分子轭合物的基本上每个分子具有独特 的序列标签； (c) 扩增所述标签-分子轭合物； (d) 测序所述标签-分子轭合物； (e) 计数不同的序列标签的数目，以确定所述样品中淋巴细胞的数目。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述重组核酸为DNA。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述淋巴细胞为T细胞，并且所述重组核酸为T细 胞受体基因或其片段。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中所述淋巴细胞为B细胞，并且所述重组核酸为免 疫球蛋白基因或其片段。
11. 一种确定免疫组库的克隆型的方法，所述方法包括步骤： (a) 从个体获得包含T细胞和/或B细胞的样品； (b) 通过取样标记来自所述T细胞和/或B细胞的分子以形成标签-分子轭合物，其中 每个标签具有序列并且每个分子包含来自T细胞受体基因或免疫球蛋白基因的重组核酸； (c) 测序所述标签-分子轭合物；并且 (d) 比对相似标签的序列读段以确定相似的克隆型。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述比对的步骤还包括通过在所述相似序列标 签的所述克隆型的每个核苷酸位置确定大多数核苷酸而确定每个所述标签-分子轭合物 的每个所述克隆型的核苷酸序列。
13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述附接的步骤在反应混合物中实施，使得所 述序列标签以所述重组核酸的分子的浓度的至少100倍的浓度存在于所述反应混合物中。
14. 一种在正被监测微小残留病的患者中检测克隆型残留污染的方法，所述方法包括 步骤： (a) 通过根据权利要求1所述的方法定期地测量所述患者的克隆型谱而监测患者的微 小残留病；和 (b) 记录克隆型谱的每个测量的每个所述序列标签的所述序列；以及 (c) 如果在后面的克隆型谱中检测到任何先前的克隆型谱的序列标签，则检测到克隆 型残留污染。
15. -种在一个或更多个合成测序反应中确定一个或更多个多核苷酸的核苷酸序列的 方法，所述方法包括步骤： (a) 将序列标签附接到所述一个或更多个多核苷酸的每个，以形成标签-多核苷酸轭 合物，其中所述标签-多核苷酸轭合物的基本上每个多核苷酸具有独特的序列标签； (b) 扩增所述标签-多核苷酸轭合物； (c) 合成测序扩增的标签-多核苷酸轭合物，其中合成测序包括至少一个dNTP流；以 及 (d) 对于具有相同序列标签的每个标签-多核苷酸，确定每个dNTP流的核苷酸掺入的 数目，该数目作为每个这样的dNTP流的测量的掺入信号的函数。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述一个或更多个多核苷酸为多个多核苷酸。
17. 根据权利要求15所述的方法，其中所述多个为至少104。
18. 根据权利要求15所述的方法，其中每个所述dNTP流的核苷酸掺入的所述数目为最 接近于所述测量的掺入信号的平均数的整数。
19. 根据权利要求15所述的方法，其中所述合成测序的步骤包括步骤： (a) 对于每个所述标签-多核苷酸轭合物，在允许测序引物退火到这样的标签-多核苷 酸轭合物以及在核苷三磷酸的存在下通过核酸聚合酶沿所述标签-多核苷酸轭合物延伸 这样的测序引物的条件下形成复合体，所述复合体包括所述测序引物、所述核酸聚合酶，以 及所述标签-多核苷酸轭合物； (b) 通过dNTP流将dNTP引入所述复合体； (c) 测量掺入信号； (d) 洗涤所述复合体；和 (e) 重复步骤（b)至（d)。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述dNTP为延伸阻断的dNTP，并且其中所述洗 涤的步骤还包括去阻断掺入的延伸阻断的dNTP的步骤，使得在后面的引入步骤中可掺入 其它延伸阻断的dNTP。
21. 根据权利要求15所述的方法，其中每个不同的标签-多核苷酸轭合物在不同的反 应限制区中。
22. 根据权利要求15所述的方法，其中所述附接的步骤包括通过取样标记所述一个或 更多个多核苷酸以形成所述标签-多核苷酸轭合物。
23. 根据权利要求15所述的方法，其中所述序列标签为具有在1至5个核苷酸范围内 的长度的可变区的嵌合标签。
24. 根据权利要求15所述的方法，其中所述序列标签包括交错区域，所述交错区域包 括选自A、C、G和T的不相交子集的核苷酸，使所述每个交错区域具有1至5个核苷酸范围 内的长度。
25. 根据权利要求15所述的方法，其中所述测序的步骤包括测序所述扩增的标签-多 核苷酸轭合物的样品。
26. 根据权利要求15所述的方法，其中所述一个或更多个多核苷酸为T细胞受体基因 或免疫球蛋白基因的重组核酸的分子。
【文档编号】C12Q1/68GK104520443SQ201380042163
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年6月11日 优先权日:2012年6月11日
【发明者】马利克·法哈姆, 马丁·穆尔黑德, 托马斯·威利斯, 建标·郑 申请人:赛昆塔公司