一株超高放氢藻株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株放氢藻株及其应用。本发明提供重组莱茵衣藻，为将质粒pChlamiRNA3导入莱茵衣藻中，得到重组莱茵衣藻。所述莱茵衣藻为莱茵衣藻CC400。本发明的实验证明，本发明将pChlamiRNA3质粒转入莱茵衣藻藻种CC400（mt+）中，得到重组莱茵衣藻，且在重组莱茵衣藻中筛选得到突变藻株91号，在用气相色谱测定其产氢量时，突变藻株91号与野生型相比，持续产氢时间更长，达到600小时（野生型产氢时间可达到200小时）；总产氢量更高，达到13349毫升/升培养物（野生型可达到300毫升/升培养物）,是野生型的44.5倍。
【专利说明】一株超高放氢藻株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一株超高放氢藻株及其应用。
【背景技术】
[0002]由于矿物资源的日益枯竭，寻找清洁的替代能源已成为一项迫切的课题。氢是宇宙间最简单同时也是最为丰富的元素，被普遍认为是一种最有吸引力的替代能源。传统的化学产氢方法采用电解水或热解石油、天然气，生产成本也普遍较高。藻类光合制氢是微藻利用太阳能裂解水释放氢气的生物过程，是实现氢能可持续生产的重要途径之一。
[0003]莱茵衣藻是古老的单细胞真核绿藻，广泛用于光合作用与产氢机理研究。其遗传转化简单，基因组测序已于2007年完成，这为工程藻株的获得奠定了坚实的基础。高放氢藻株的筛选一直是国际前沿热点，主要是围绕着降低天线色素含量，提高光能利用率等方面开展相关研究工作。高放氢藻株的获得，不仅对于科学研究有重要意义，而且在氢能源的开发应用方面也有广阔的前景。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供一种重组莱茵衣藻。
[0005]本发明提供的重 组莱茵衣藻，为将质粒pChlamiRNA3导入莱茵衣藻中，得到重组莱茵衣藻。
[0006]上述重组莱茵衣藻中，所述莱茵衣藻为莱茵衣藻CC400。
[0007]上述重组莱茵衣藻中，所述重组莱茵衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)突变藻株91号，其保藏号为CGMCC N0.8706。
[0008]上述的重组莱茵衣藻在产氢中的应用也是本发明保护的范围。
[0009]本发明的另一个目的是提供一种获得氢的方法。
[0010]本发明提供的获得氢的方法，为发酵上述的重组莱茵衣藻，得到氢。
[0011 ] 上述方法中，所述发酵采用的培养基为缺硫TAP培养液。
[0012]上述方法中，所述发酵条件为25°C、连续光照、持续搅拌，所述发酵时间为0-600小时，且不为O。
[0013]上述方法中，所述光照的强度为110 μ Es-lm-2,所述搅拌的转速为200rpm。
[0014]本发明中莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)突变藻株91号，于2013年12月31日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.8706，分类命名为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
[0015]本发明的实验证明，本发明将pChlamiRNA3质粒转入莱茵衣藻藻种CC400 (mt+)中，得到重组藻株，且在重组藻株中筛选得到突变藻株91号，在用气相色谱测定其产氢量时，突变藻株91号与野生型相比，持续产氢时间更长，达到600小时(野生型产氢时间可达到200小时);总产氢量更高，达到13349毫升/升培养物(野生型可达到300毫升/升培养物)，是野生型的44.5倍。与已有报道相比，本发明中所述藻株产氢时间更持久，产氢量更高。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为重组藻株的产氢量检测(0_120h)
[0017]图2为突变藻株的产氢量检测(0_600h)
【具体实施方式】
[0018]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0019]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，部分如下:
[0020]莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻种 CC400 (mt+)(以下也称为野生型藻株)和质粒pChlamiRNA3均购自杜克大学莱茵衣藻中心(Chlamy center, http://www.chlamy.0rg/);质粒pChlamiRNA3中均含有巴龙霉素抗性基因。
[0021]下述实施例中所用的培养基:
[0022]I) TAP 培养液:NH4Cl0.4g/L ;MgS04.7Η200.lg/L ;CaCl2.2Η200.05g/L ;K2HPO40.108g/L ；KH2PO40.056g/L ；Trisbase2.423g/L ;亨特微量元素(Hunter，s traceelements) lml/L,冰乙酸 lml/L,其余为水。
[0023]亨特微量兀素(Hunter，strace elements):H3BO4I1.4g/L、ZnSO4.7Η2022.0g/L、MnCl2.4H205.06g/L、CoCl2.6H201.61g/L、CuSO4.5H201.57g/L、(NH4)6Mo7O24.4H201.1Og/UFeSO4.7H204.99g/L，其余为水。
[0024]2)缺硫 TAP 培养液(g/L) =NH4Cl0.4g/L ；MgCl2.6H200.08g/L ；CaCl2.2H200.05g/L ；K2HP040.108g/L ；KH2PO40.056g/L ；Trisbase2.423g/L ;亨特微量元素(Hunter，s traceelements) lml/L,冰乙酸 lml/L,其余为水。
[0025]缺硫亨特微量兀素(Hunter，strace elements):H3BO4I1.4g/L> ZnCl2I0.42g/L>MnCl2.4H205.06g/L、CoCl2.6H201.61g/L、CuCl2.2H201.07g/L、(NH4)6Mo7O24.4H201.1Og/UFeCl2.4H203.57g/L，其余为水。
[0026]3)固体TAP培养基:在TAP培养液中加1.5% (质量百分含量)的琼脂粉。
[0027]4)含有巴龙霉素的培养基配方为:在固体TAP培养基中，加入100ug/ml巴龙霉素水溶液，使巴龙霉素在含有巴龙霉素的培养基中的终浓度为lOug/ml。
[0028]实施例1、产氢莱茵衣藻的获得
[0029]1、培养
[0030]用TAP固体培养基培养莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) CC400藻株:配制TAP液体培养液，121°C高压灭菌20分钟，待培养液温度降到室温后，用接种针从固体培养基上挑取莱茵衣藻单克隆到TAP培养液中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养(25°C，60rpm，110 μ Es^iT2)，悬浮培养细胞，得到 CC400 藻液。
[0031]固体培养时，将单克隆转到TAP固体培养基上划线培养。
[0032]2、重组莱茵衣藻的获得
[0033]将质粒pChlamiRNA3线性化，并用玻璃珠法转化藻种CC400，具体步骤如下:[0034]称取0.1g玻璃珠(425-600um,Sigma)置于1.5ml离心管中，121°C灭菌20分钟后，放于室温待用。将IOOul CC400藻液和IOul pChlamiRNA3质粒(Kpn I线性化)加入上述盛有玻璃珠的离心管中，在vortex (Genie2)上，7档震动15秒后，室温25°C放置4分钟。用移液器将藻液转移到新鲜的TAP培养液中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养24小时后(25°C，60rpm，110 μ Es—V2)，2500rpm离心，收集沉淀用TAP培养液悬起后，涂在含有巴龙霉素(10ug/ml)的培养基平板上，能够生长的藻株，为重组莱茵衣藻。
[0035]3、产氢突变藻株的筛选
[0036]I)藻株培养
[0037]将上述2得到的重组莱茵衣藻分别接到盛150ml正常TAP培养液的三角瓶中；当0D750值达到1.5时，再将其转到已加入磁转子的500ml培养液中；待0D750值达到1.5左右时，收集培养物。
[0038]2)、产氢量的测定
[0039](I) 25°C，2500rpm，离心上述I)收集的培养物5分钟；倒掉上清液，收集细胞；
[0040](2)用缺硫TAP培养液漂洗I)收集的细胞两次；将漂洗过的细胞用20ml左右缺硫培养液重悬细胞；
[0041](3)取20 μ I悬浮细胞， 加入980 μ I缺硫培养液，再加入4ml丙酮，混匀，5000rpm，5分钟；
[0042](4)取离心后的上清液,测定663nm和645nm处的吸光值,根据下面的公式计算总
叶绿素含量:
[0043]Chl (a+b ) =8.02 X 0D663+20.21 X 0D645
[0044](5)采用Schott培养瓶做放氢瓶，培养体系为100ml (加入缺硫TAP培养基)，计算最终叶绿素浓度达到20 μ g/ml所需的(I)步骤中的细胞原液体积，加入细胞，用缺硫TAP培养液补足到100ml ；
[0045](6)用石腊封住瓶口，以防止气体外漏；
[0046](7)将培养瓶置于25°C，110 μ Es-lm-2培养箱中的磁力搅拌器(转速200rpm)上连续光照培养(光照强度:110 μ Es-lm-2)，分别取不同的时间点测定放氢量。
[0047]采用SHIMADZU GC-2014气相色谱测定氢气含量，载气为氮气。测定时用Iml注射器吸取放氢瓶气体部分500μ 1，注入进样孔，甲烷外标法计算气体体积。
[0048]Υ(甲烷体积，ul) =0.0002χ (X，峰面积)+0.708，R2 (相关系数)=0.9979)
[0049]结果如图1所示，可以看出，对获得的多个突变藻株进行放氢量测定，到缺硫密闭培养120小时时，突变藻株91号产氢量可达到816毫升/升培养物，是野生型的3.5倍(野生型可达到232毫升/升培养物)，其余突变藻株产氢量均与野生型相当。这说明，与野生型相比，突变藻株91号具有更高的产氢能力。
[0050]将莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii )突变藻株91 号，于 2013 年 12 月 31 日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.8706，分类命名为莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。
[0051]实施例2、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )突变藻株 91 号的 CGMCCN0.8706 应用[0052]为了进一步确定突变藻株91号的持续产氢能力与产氢时间，对其产氢过程进行长时间监测，具体如下:
[0053]将莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)突变藻株 91 号 CGMCC N0.8706 按照实施例1中的3的方法进行培养和产氢检测。以野生型藻株为对照。
[0054]结果如图2所示，可以看出，到缺硫密闭培养200小时时，野生型藻株的产氢量达到最大值(300毫升/升培养物)，突变藻株91号的产氢量达到5744毫升/升培养物；且突变藻株91号产氢可一直持续到600小时，总产氢量达到13349毫升/升培养物，是野生型的44.5倍。 [0055]总之，突变藻株91号的持续产氢时间(600小时)和产氢量(13349毫升/升培养物)均高于野生型(200小时，300毫升/升培养物)，高于已报道藻株，具有一定的潜在应用价值。
【权利要求】
1.重组莱茵衣藻,为将质粒pChlamiRNA3导入莱茵衣藻中，得到重组莱茵衣藻。
2.根据权利要求1所述的重组莱茵衣藻，其特征在于:所述莱茵衣藻为莱茵衣藻CC400。
3.根据权利要求1或2所述的重组莱茵衣藻，其特征在于:所述重组莱茵衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )突变藻株 91 号，其保藏号为 CGMCC N0.8706。
4.权利要求1-3中任一所述的重组莱茵衣藻在产氢中的应用。
5.一种获得氢的方法，为发酵权利要求1-3中任一所述的重组莱茵衣藻，得到氢。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述发酵采用的培养基为缺硫TAP培养液。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述发酵条件为25°C、连续光照、持续搅拌，所述发酵时间为0-600小时，且不为O。
8.根据权利要求 7所述的方法，其特征在于:所述光照的强度为110yEs-lm-2，所述搅拌的转速为200rpm。
【文档编号】C12R1/89GK103710266SQ201410014492
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】黄芳, 赵磊, 陈梅, 张锦 申请人:中国科学院植物研究所