一种与人类胎儿生长受限发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程及生殖医学领域，公开了一种与人类胎儿生长受限发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用。该标志物为hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p中的多种。该标志物对胎儿生长受限具有特异性和敏感性，可用于制备胎儿生长受限诊断或监测的试剂，可反复检测，且易于动态监测胎儿生长受限的程度。
【专利说明】一种与人类胎儿生长受限发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用
发明领域
[0001]本发明属于基因工程及临床医学领域，涉及与人类胎儿生长受限发生相关的血清微小核糖核酸(microRNA, miRNA)标志物及其应用。
【背景技术】
[0002]胎儿生长受限(fetal growth restriction, FGR)是指胎儿出生体重低于同孕龄平均体重的两个标准差，或低于同龄正常体重的第10百分位数。FGR是围生期的重要并发症，居围生儿死亡原因第2位，其围生儿死亡率为正常儿的6-10倍，在死亡中约占围生儿的30%，产时宫内缺氧围生儿中50%为FGR，据统计我国的发病率平均为6.39%。FGR会引起新生儿呼吸困难、红细胞增多症、低血糖、脑室出血、低温等并发症。FGR不仅直接影响胎儿的发育，远期也影响儿童期及青春期的体能与智能发育，以及增加成人对冠心病、2型糖尿病、高血压等心血管疾病和代谢性疾病的易感性。
[0003]FGR的病因迄今尚未完全阐明，其发生与孕妇、胎儿因素、胎盘、环境等多方面的因素密切相关。明确FGR的病因对早期诊断和治疗有重要的作用。30%~40%的FGR发生于孕母有各种疾患及妊娠合并症者，如子痫前期、妊娠合并高血压或高血压合并妊娠、妊娠期糖尿病等，此外母体血管疾病和血栓形成会导致子宫胎盘灌注不足而引起胎儿生长受限。10%由于多胎，多胎加重了子宫胎盘动脉的压力。10%由于胎儿问题一感染或畸形，约有40%发生于正常妊娠，其发病原因迄今仍未阐明，称为“特发性胎儿生长受限”。
[0004]有时即便孕妇和胎儿均无异常因素，胎盘及其附属物的变化亦可导致FGR。胎盘滋养细胞参与激活代谢、产生激素、吸收营养和排除代谢废物等，广泛的证据表明在FGR的发生中胎盘功能不足。导致胎儿生长受限的最主`要最直接的原因是胎盘发育异常及循环功能障碍，造成胎儿营养物质供给和利用障碍。研究发现不同的胎盘因素参与疾病的发生，如解剖、血管、染色体和/或形态异常等。FGR组与正常对照组相比，胎盘绒毛数目、绒毛血管数目、胎盘体重和胎儿-胎盘重量比均明显下降。增厚的绒毛滋养细胞基底膜、绒毛梗死的发病率、血栓形成和血肿的存在和发生在FGR组中较常见。子宫-胎盘血管、胎儿-胎盘血管重构异常也发生于FGR。绒毛血管的生成障碍导致胎儿与母体间血运减少、营养物质的输送能力下降。同时绒毛间隙纤维素沉积可导致绒毛间血流减少，合体滋养细胞微绒毛膜表面的Na(+)/K(+)ATPase活性明显降低，导致Na(+)_偶联的转运功能削弱，母胎间的交换面积和效率均降低。已知许多生长因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PIGF)、转化生长因子P (TGF P )、成纤维细胞生长因子(FGF)等在绒毛细胞内产生，经其受体在局部起作用，控制胎盘血管的生成、迁移、入侵等能力。此外，MMP-9是滋养层细胞分泌的有效水解酶，选择性水解子宫内膜成分及基底膜，在胎盘的植入中发挥重要作用，其分泌的减少使滋养细胞对子宫肌层的浸润和螺旋动脉的形成发生变化，限制胎盘血供，使绒毛间隙含氧量减少，造成绒毛细胞缺氧。但是FGR的病因迄今尚未完全阐明。
[0005]微小核糖核酸(microRNA,即miRNA)是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类长约19-25个核苷酸组成的内源性非编码小分子单链RNA，多位于基因组非编码区。它在生物进化过程中高度保守，在细胞中具有时空特异性表达模式，可在转录后水平对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。这些小分子RNA是从60~200nt的具有发夹状结构的前体中被切割出来而成熟，在动物细胞中，miRNA的转录初产物(pr1-miRNA)很快被一种核糖核酸酶III Drosha加工成miRNA前体(pre-miRNA)，然后由细胞核转运至细胞质中，经另一种核糖核酸酶III Dicer识别剪切为成熟miRNA。随后，这个单链与辅酶因子TRBP及PACT形成RNA诱导沉默复合物，再与mRNA的3’端非编码区(3’UTR)结合，从而发挥其调控mRNA转录与蛋白翻译的总开关作用。miRNA诱发的基因沉默现象是通过直接切割或阻碍基因的转录。多数的miRNA与一个特定的mRNA不是完全互补的，因此相同的mi RNA可以同时调控多个基因。另外，不同的mi RNAs也可以靶向调控相同的mRNA，并且有相似的生物学功能。大约30%的人类基因表达可能受miRNAs调控。第一个ncRNA于1965年在面包酵母中被发现，但是它的生理功能直到1993年才被认识，在线虫体内时序性调控生长发育，所以叫做“小时空RNA”。直到20世纪初,才被称为miRNA，它在细胞内的RNA干扰机制开始被认识。最近的十几年，在人类中已发现了1000多种miRNAs，作为21世纪生命科学的重大发现，越来越多的研究显示，其参与的细胞转录后调控，在个体发育、细胞胞增殖、分化、代谢和凋亡等多种生物学过程中发挥着重要的调节作用。目前，已发现血清miRNA可作为多种肿瘤发生与预后的良好生物标志物。
[0006]最新的研究成果发现血清中存在数百种的miRNA，性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、乳腺癌中已经证实血清miRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋，血清miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。该研究迅速引起国际媒体的广泛关注，路透社、合众社、《科学的美国人》、美国《技术评论》等都对该研究成果进行了专门报道，《Nature》杂志也在其网站首页的“最新研究进展”专栏中展示了这一最新研究进展。然而孕妇血清中miRNA在胎儿生长受限早期诊断监测中的应用还未得到相应的关注，若能发现与胎儿生长受限发病相关的特异且稳定的血清miRNA作为生物标志物，并研发相应疾病的`诊断、监测试剂盒，不仅能创造令人瞩目的经济效益，对我国胎儿生长受限的防治也将是一次强有力的推动。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供与人类胎儿生长受限发生相关的血清microRNA标志物。
[0008]本发明的另一个目的是提供上述血清microRNA标志物的引物。
[0009]本发明还有一个目的是提供含有上述血清microRNA标志物或其引物的应用。
[0010]本发明再有一个目的是提供含有上述血清microRNA标志物的引物的用于人类胎儿生长受限诊断或监测的试剂盒。
[0011]本发明的目的是通过下列技术措施实现的:
[0012]与人类胎儿生长受限相关的血清microRNA标志物，选自hsaniR-lOa、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p、hsa-miR-675_5p 中的多种。
[0013]所述的血清microRNA 标志物由 hsa-miR-lOa、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p 和 hsa-miR-675_5p 构成。所述的血清 microRNA标志物，其中 hsa-miR-lOa 的序列为 uacccuguagauccgaauuugug (SEQ ID N0.1),hsa_miR-320b 的序列为 aaaagcuggguugagagggcaa (SEQ ID N0.2), hsa-miR-409_3p的序列为 gaauguugcucggugaaccccu (SEQ ID N0.3), hsa-miR-483_3p 的序列为 ucacuccucuccucccgucuu (SEQ ID N0.4), hsa-miR-675_5p 的序列为uggugcggagagggcccacagug (SEQ ID N0.5)。
[0014]所述的血清microRNA标志物的引物，其中序列为SEQ ID N0.1的标志物的上游引物为SEQ ID N0.6，下游引物为SEQ ID N0.7 ;序列为SEQ ID N0.2的标志物的上游引物为SEQ ID N0.8，下游引物为SEQ ID N0.9 ;序列为SEQ ID N0.3的标志物的上游引物为SEQ ID N0.10，下游引物为SEQ ID N0.11 ;序列为SEQ ID N0.4的标志物的上游引物为SEQID N0.12，下游引物为SEQ ID N0.13 ;序列为SEQ ID N0.5的标志物的上游引物为SEQ IDN0.14，下游引物为 SEQ ID N0.15。
[0015]所述的血清microRNA标志物或其引物在制备胎儿生长受限诊断或监测试剂中的应用。所述试剂是能够测定这些血清microRNA标志物在血清中表达量的试剂。
[0016]一种人类胎儿生长受限诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述血清microRNA标志物(hsa-miR-10a、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p 和 hsa-miR-675_5p中的多种)的引物。
[0017]所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述引物(SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.1,SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10 和 SEQ ID N0.11，SEQ ID N0.12 和 SEQ IDN0.13，SEQ ID N0.14 和 SEQ ID N0.15)中的多对。
[0018]所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有下列5对引物SEQ ID N0.6和SEQ IDN0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10 和 SEQ ID N0.11，SEQ ID N0.12 和 SEQID N0.13，SEQ ID N0.14 和 SEQ ID N0.15。
[0019]试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
[0020]本发明详细描述如下:
[0021]本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了 RT-PCR方法、TaqMan miRNA Array,Real-time PCRCTaqMan探针和染料法)方法的一种或几种进行检测。
[0022]具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分:
[0023]一、研究对象选择和分组依据
[0024]A组:健康对照组(n=80，10人芯片筛选，30人一期验证，40人独立人群验证)，无其
他全身性重大疾病。
[0025]B组:胎儿生长受限组(n=80，10人芯片筛选，30人一期验证，40人独立人群验证)，无其他全身性重大疾病。
[0026]二、血液血清分离及miRNA提取
[0027](I)新鲜肝素抗凝血5ml于离心机3000g离心5min,取上清每100 V-1分装至洁净1.5ml EP 管中；
[0028](2)加入60iU裂解液，漩涡震荡5s，室温静置3min ；
[0029](3)加入20 u I蛋白液，漩涡震荡5s，室温静置lmin，IlOOOg离心3min ；
[0030](4)取上清至新的2ml收集管，加入270 U I异丙醇，漩涡震荡5s ；[0031](5)将microRNA离心柱放在收集管中，将步骤4的液体加入离心柱中，室温静置2min, IlOOOg离心30s，倒掉收集管中液体，将离心柱放回收集管；
[0032](6)加入IOOii I洗脱液I至microRNA离心柱，IlOOOg离心30s，倒掉收集管中液体，将离心柱放回收集管；
[0033](7)加入700 ii I洗脱液2至microRNA离心柱，IlOOOg离心30s，倒掉收集管中液体，将离心柱放回收集管；
[0034](8)加入 250 V-1 洗脱液 2 至 microRNA 离心柱，IlOOOg 离心 2min ；
[0035](9)将microRNA离心柱放置在新的1.5ml收集管中，加入25 U I去核糖核酸酶水至microRNA离心柱膜上,室温静置lmin, IlOOOg离心Imin ；
[0036](10)重复步骤9 一次，_70°C保存收集管中的样本。
[0037]本发明实验中使用的离心柱和配套试剂(裂解液、蛋白液、洗脱液I和洗脱液2)均来自 Exiqon mi RCURY RNA isolation kit (货号 300112)试剂盒,下同。
[0038]三、Real-time PCR方法测量血清miRNAs表达量
[0039]1.取经前处理的血清，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。
[0040]按下表所示配制反转录体系:
[0041]
【权利要求】
1.人类胎儿生长受限相关的血清microRNA标志物,选自hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p、hsa-miR-675_5p 中的多种。
2.根据权利要求1所述的血清microRNA标志物，其特征在于由hsa_miR-10a、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p 和 hsa-miR-675_5p 构成。
3.根据权利要求1或2所述的血清microRNA标志物,其特征在于hsa_miR-10a的序列为 SEQ ID N0.1，hsa-miR-320b 的序列为 SEQ ID N0.2，hsa-miR-409_3p 的序列为 SEQ IDN0.3，hsa-miR-483-3p 的序列为 SEQ ID N0.4，hsa-miR-675_5p 的序列为 SEQ ID N0.5。
4.权利要求3所述的血清microRNA标志物的引物，其特征在于序列为SEQID N0.1的标志物的上游引物为SEQ ID N0.6，下游引物为SEQ ID N0.7 ;序列为SEQ ID N0.2的标志物的上游引物为SEQ ID N0.8，下游引物为SEQ ID N0.9 ;序列为SEQ ID N0.3的标志物的上游引物为SEQ ID N0.10，下游引物为SEQ ID N0.11 ;序列为SEQ ID N0.4的标志物的上游引物为SEQ ID N0.12，下游引物为SEQ ID N0.13 ;序列为SEQ ID N0.5的标志物的上游引物为SEQ ID N0.14，下游引物为SEQ ID N0.15。
5.权利要求1或2所述的血清microRNA标志物在制备人类胎儿生长受限辅助诊断或监测试剂中的应用。
6.权利要求4所述的引物在制备人类胎儿生长受限辅助诊断或监测试剂中的应用。
7.一种人类胎儿生长受限辅助诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1或2所述的血清microRNA标志物的引物。
8.根据权利要求7所述的辅助诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求4所述引物中的多对。
9.根据权利要求8所述的辅助诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有引物SEQID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10 和 SEQ ID N0.11，SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.1`3，以及 SEQ ID N0.14 和 SEQ ID N0.15。
【文档编号】C12N15/11GK103757017SQ201410028086
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】吴炜, 汤秋勤, 丁虹娟, 陈敏, 夏彦恺, 陆春城, 王心如 申请人:南京医科大学