一种检测水稻穗结构基因ips1的特异分子标记及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测水稻穗结构基因IDS1的特异分子标记及其检测方法，该分子标记为IPS1-1，该片段如序列表SEQ?ID?NO：1所示；该方法得具体过程为：步骤a，DNA提取；步骤b，PCR扩增；PCR反应体系为15μL，含50m?M?KCl，10mM?Tris-HCl(pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM?MgCl2，200μM?each?of?dNTPs,0.2μM?of?each?primer，5％(v/v)dimethyl?sulfoxide?and0.5U?Taq?DNA聚合酶；步骤c，PCR产物检测；扩增产物中加入上样缓冲液，取8μL上述样品于1.5％的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统成像观察；步骤d，获取IPS1基因。本发明分子标记可以用于鉴定待测材料是否在IPS1座位上含有丽江新团黑谷的控制穗结构的增效等位基因；能够改善穗部结构、优化一二次枝梗穗粒数比例、提高穗实粒数、增加水稻单产水平，同时提高稻米品质。
【专利说明】—种检测水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水稻育种中的检测【技术领域】，尤其涉及分子辅助选育高产优质水稻时，检测同时增产增效的IPSi等位基因的特异性分子标记及其检测方法。
【背景技术】
[0002]作为水稻的最终产量器官，穗的结构与形态始终是育种过程中的重要参考指标，其涉及了水稻产量构成三要素(每株穗数、穗粒数和粒重)的两个。由于生态条件等原因，东北粳稻穗数水平相对较高，在此基础上进一步增加的潜力较小。在长期自然选择和人工选择下，生产应用的品种间千粒重差异不大，对高产的作用相对较小，因此改善穗部结构、提高穗粒数是增加水稻单产水平的主攻方向。穗粒数由每穗颖花数和结实率共同决定，众多研究表明，增加颖花数的主要途径是提高二次枝梗颖花数，而二次枝梗颖花为弱势颖花，灌浆启动较晚，灌浆时间较长，在东北稻区往往结实率极低，改良意义不大。因而，东北稻区增加每穗颖花数的主要途径是尽可能增加一次枝梗数，同时维持适当的二次枝梗数，优化穗结构。长期的水稻育种实践表明，增加一次枝梗数，不仅能够实现产量的增加，而且能够在保证产量的前提下，提高精米率和整精米率等加工品质，同时能够大幅度改善稻米的垩白度和垩白米率。
[0003]目前关于水稻穗部结构相关QTL的解析取得了一定的进展，已经克隆了6个相关基因:Gnla、DST、LOG、DEPU Ghd7、Ghd7.1 和 Ghd8。其中 Gnla、DEPl 控制二次枝梗颖花数的增加，DST调控Gnla在分生组织中的表达，LOG是减效基因，Ghd7、Ghd7.1和Ghd8是通过延长生育期来提高穗粒数。这些基因均不适合东北稻区。
[0004]鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本创作。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种检测水稻穗结构基因IPSl的特异分子标记及其检测方法，用以克服上述技术缺陷。
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种检测水稻穗结构基因IPSl的特异分子标记，该分子标记为IPS1-1,该片段如序列表SEQ ID NO:1所不,其中，该分子标记的核苷酸序列如下:
[0007]IPSl-1的上游引物序列为:5'
[0008]-AGCCGAGGGACGTGCAAACTACT-3'
[0009]IPSl-1 的下游引物序列为:5' -ACAACATTCCCCTGGCAAGT—3'。
[0010]进一步，所述分子标记IPSl-1由东北粳稻'沈农265'和云南地方品种'丽江新团黑谷^构建的重组自交系 群体基因进行扩增获取。
[0011]进一步，在所述重组自交过程中，所述分子标记IPSl-1与IPSl共分离。
[0012]本发明还提供一种检测水稻穗结构基因IPSl的特异分子标记的方法，其过程为:[0013]步骤a，DNA提取；具体为:
[0014]步骤al，取长度为IOcm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中；
[0015]步骤a2，加入预热至65°C的CTAB抽提液600 μ L ;
[0016]步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60°C的水浴30_60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀；
[0017]步骤a4，取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿:异戊醇(24: 1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上1000Orpm离心IOmin,取上清液转入另一离心管中；
[0018]步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；
[0019]步骤a6，将上清液逐滴加入2倍体积的_20°C预冷的无水乙醇中，-20°C放置30min以上；
[0020]步骤a7，此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干；
[0021]步骤a8，用100 μ L的TE缓冲液回溶待用；
[0022]步骤a9，取1.5 μ L用于PCR扩增；
[0023]步骤b，PCR 扩增；PCR 反应体系为 15 μ L，含 50mM KCl, IOmMTris-HCl (pH8.8),0.1% Triton-X, 1.5mM MgCl2, 200 μ M each of dNTPs, 0.2 μ M of each primer, 5% (v/v)dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA 聚合酶；
[0024]步骤c，PCR产物检测；
[0025]扩增产物中加入上样缓冲液，取8 μ L上述样品于1.5%的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳I小时，利用凝胶成像系统成像观察；
[0026]步骤d，获取IPSl基因。
[0027]进一步，在上述步骤a2中，所述CTAB抽提液包括2 % (w/v) CTAB ； I OOmmo I/LTris-Hcl, pH8.0 ；20mmol/LEDTA, pH8.0 ；1.4mol/LnaCl。
[0028]进一步,在上述步骤a8中，所述TE缓冲液包括10mmol/LTris-Hcl ； lmmol/LEDTA,pH8.0。
[0029]进一步，上述步骤b中，采用AB1-9700进行扩增，反应程序为94°C预变性5min ;每个循环94°C预变性lmin，550°C退火lmin，72°C延伸2min，30个循环；最后72°C延伸8min。
[0030]与现有技术相比较本发明的有益效果在于:本发明分子标记可以用于鉴定待测材料是否在IPSI座位上含有丽江新团黑谷的控制穗结构的增效等位基因；能够改善穗部结构、优化一二次枝梗穗粒数比例、提高穗实粒数、增加水稻单产水平，同时提高稻米品质。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明IPSl在第4号染色体上的位置及连锁标记；
[0032]图2为本发明17个水稻品种分子标记IPSl-1的检测结果。
【具体实施方式】
[0033]以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0034]本发明东北粳稻'沈农265'和云南地方品种'丽江新团黑谷'构建的重组自交系群体，在沈阳和哈尔滨两地对穗部结构性状进行了 QTL分析，共检测到控制一次枝梗数的QTL5个，并利用剩余杂合体衍生群体对同时控制一次枝梗数、一次枝梗实粒数的QTLIPSl进行了精细定位，同时提供了与IPSl紧密连锁且共分离的分子标记。
[0035]在本发明中用于检测IPSl的特异性分子标记为IPS1-1，所述片段如序列表SEQID NO:1所示，其中，本发明的分子标记的核苷酸序列如下:
[0036]IPSl-1的上游引物序列为:5'
[0037]-AGCCGAGGGACGTGCAAACTACT-3'
[0038]IPSl-1 的下游引物序列为:5' -ACAACATTCCCCTGGCAAGT—3'。
[0039]请参阅图1所示，其为本发明IPSl在第4号染色体上的位置及连锁标记；图2为本发明17个水稻品种分子标记IPSl-1的检测结果，
[0040]其中，M:分子标记标准；1:沈农265 ;2:丽江新团黑谷；3 =Habataki ；4:Kasalath ；5:9311 ；6:七山占；7:通系83 ;8:日本晴；9:辽粳5 ；10:辽星I号；11:盐丰47 ；12:辽粳294 ；13:龙粳21 ；14:牡丹江31 ；15:松粳9号；16:吉粳88 ；17:空育131。
[0041]本发明根据前期精细定位结果，分别测定了丽江新团黑谷和沈农265的目标区域，并进行了比对分析，挑选出一个接近6000bp的大片段IdDel差异，并设计出该标记。将此标记应用于丽江新团黑谷和沈农265进行验证，发现具有IPSl的丽江新团黑谷能够扩增出580bp左右的条带，而沈农265无扩增条带。并进一步对重组自交系进行验证，发现该分子标记与IPSl共分离。此外， 还对一些水稻品种进行了目标基因的验证。综上，此分子标记可以用于鉴定待测材料是否在IPSl座位上含有丽江新团黑谷的控制穗结构的增效等位基因。
[0042]该检测方法具体为:
[0043]步骤a，DNA提取；具体为:
[0044]步骤al，取长度为IOcm左右黄化苗4_5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中；
[0045]步骤a2，加入预热至65°C的CTAB抽提液[2 % (w/v) CTAB ；
[0046]100mmol/LTris-Hcl，pH8.0 ;20mmol/LEDTA，pH8.0 ；
[0047]1.4mol/LNaCl] 600 μ L ；
[0048]步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60°C的水浴30_60min，期间每5mi η轻轻倒转离心管使之分散均匀。
[0049]步骤a4，取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿:异戊醇(24: I)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上1000Orpm离心IOmin,取上清液转入另一离心管中；
[0050]步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；
[0051]步骤a6,将上清液逐滴加入2倍体积的_20°C预冷的无水乙醇中，_20°C放置30min以上；
[0052]步骤a7，此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干；
[0053]步骤a8,用 100 μ L 的 TE 缓冲液(IOmmoI/LTris-HcI ； ImmoI/LEDTA, ρΗ8.0)回溶
待用；
[0054]步骤a9，取1.5μ L用于PCR扩增。[0055]步骤b，PCR 扩增；PCR 反应体系为 15 μ L，含 50mM KCl, IOmMTris-HCl (pH8.8),
0.1% Triton-X, 1.5mM MgCl2, 200 μ M each of dNTPs,0.2μΜ of each primer, 5% (V/V)dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA 聚合酶。
[0056]本实施例采用AB1-9700进行扩增，反应程序为94°C预变性5min ;每个循环94°C预变性lmin，550°C退火lmin，72°C延伸2min，30个循环；最后72°C延伸8min。
[0057]步骤c，PCR产物检测；
[0058]扩增产物中加入上样缓冲液，取8 μ L上述样品于1.5%的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳I小时，利用凝胶成像系统成像观察。
[0059]步骤d，获取IPSI基因，本实施例中，能够扩增出条带的水稻品种具有IPSl基因。[0060]以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种检测水稻穗结构基因IPSI的特异分子标记，其特征在于，该分子标记为IPS1-1，该片段如序列表SEQ ID NO:1所示，其中，该分子标记的核苷酸序列如下: IPSl-1的上游引物序列为:5,
-AGCCGAGGGACGTGCAAACTACT-3' IPSl-1 的下游引物序列为:5' -ACAACATTCCCCTGGCAAGT—3'。
2.根据权利要求1所述的检测水稻穗结构基因IPSl的特异分子标记，其特征在于，所述分子标记IPSl-1由东北粳稻'沈农265'和云南地方品种'丽江新团黑谷'构建的重组自交系群体基因进行扩增获取。
3.根据权利要求2所述的检测水稻穗结构基因IPSl的特异分子标记，其特征在于，在所述重组自交过程中，所述分子标记IPSl-1与IPSl共分离。
4.一种检测水稻穗结构基因IPSl的特异分子标记的方法，其特征在于，其过程为: 步骤a, DNA提取；具体为: 步骤al，取长度为IOcm左右黄化苗4_5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中； 步骤a2，加入预热至65°C的CTAB抽提液600 μ L ; 步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60°C的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀； 步骤a4，取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿:异戊醇(24: I)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上1000Orpm离心lOmin，取上清液转入另一离心管中； 步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止； 步骤a6，将上清液逐滴加入2倍体积的_20°C预冷的无水乙醇中，-20°C放置30min以上； 步骤a7，此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干； 步骤a8，用100 μ L的TE缓冲液回溶待用； 步骤a9，取1.5μ L用于PCR扩增； 步骤 b，PCR 扩增；PCR 反应体系为 15 μ L，含 50mMKCl，IOmMTris-HCl (pH8.8) ,0.1 %Triton-X,1.5mM MgC12,200 μ M each of dNTPs,0.2 μ M of each primer,5 % (v/v)dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA 聚合酶； 步骤c，PCR产物检测； 扩增产物中加入上样缓冲液，取8 μ L上述样品于1.5%的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳I小时，利用凝胶成像系统成像观察； 步骤d，获取IPSl基因。
5.根据权利要求4所述的检测水稻穗结构基因IPSl的特异分子标记的方法，其特征在于，在上述步骤a2中，所述CTAB抽提液包括2% (w/v) CTAB ；100mmol/LTris-Hcl,pH8.0 ；20mmol/LEDTA, pH8.0 ； 1.4mol/LnaCl。
6.根据权利要求5所述的检测水稻穗结构基因IPSl的特异分子标记的方法，其特征在于,在上述步骤a8中 ，所述TE缓冲液包括IOmmoI/LTris-HcI ；ImmoI/LEDTA, pH8.0。
7.根据权利要求4或5所述的检测水稻穗结构基因IPSl的特异分子标记的方法，其特征在于，上述步骤b中，采用AB1-9700进行扩增，反应程序为94°C预变性5min ;每个循环94°C预变性lmin，550°C退火 lmin，72°C延伸2min，30个循环；最后72°C延伸8min。
【文档编号】C12N15/11GK103789433SQ201410038662
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】姜树坤, 王嘉宇, 张凤鸣, 刘丹, 白良明, 孙世臣, 丁国华, 王彤彤, 张喜娟, 姜辉 申请人:黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所