针对甲型h3n2流感病毒的纳米抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了针对于甲型H3N2流感病毒抗原表位的纳米抗体及编码该纳米抗体的基因序列，同时还公布了能够表达该纳米抗体的宿主细胞以及其在诊断和治疗中的应用。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于甲型H3N2流感诊断试剂盒的研发及靶向治疗等。
【专利说明】针对甲型H3N2流感病毒的纳米抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学或生物制药【技术领域】，涉及针对于甲型H3N2流感病毒的纳米抗体、其编码序列及在诊断和治疗中的应用。
【背景技术】 [0002]流感病毒根据核蛋白抗原性不同，可分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行型流感病毒常常引起局部暴发，不引起世界性流感大流行；C型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流行。甲型流感病毒感染宿主谱最广，包括人、猪、马、禽、犬等多种动物。甲型流感病毒根据其表面的血凝素(HA)抗原的不同可以分为16个亚型(H1-H16)，根据神经氨酸酶(NA)抗原的不同可以分为9个亚型(N1-N9)。流感病毒通过表面蛋白抗原性的累积改变(抗原漂移)或不同流感病毒发生基因重排而产生一种新的流感病毒(抗原转变)来逃避感染宿主的免疫识别，从而在感染群体中传播、繁衍。甲型H3N2流感是一种因甲型H3N2流感病毒引起的呼吸系统疾病。1968年香港爆发的H3N2流感至使百万人失去生命。2013年初，美国东部多个州爆发H3N2季节性流感，波士顿市政府于I月9日宣布公共卫生紧急状态。 目前的流感疫苗并不能有效针对这些毒株为人类提供保护。传统抗体属于大分子物质，每个分子含有两套重链和轻链，并与糖分子重叠在一起。抗体药物的大分子特性制约了其广泛使用和疗效的发挥。一般的抗体能被消化系统很快降解，从而阻止了其进入大脑或一些肿瘤的外围，许多疾病无法用单克隆抗体药物治疗。并且单克隆抗体在高温和强酸强碱的条件下会分解，必须在绝对零度下保存，否则会在数周内失去活性。另外，在合成单克隆抗体之前，通常需要从老鼠体内分离出抗体，再进行复杂的人源化操作以及利用生物反应器进行制备，这一过程耗时长、费用高。
[0003]而纳米抗体是目前最小的抗体分子，其分子量是普通抗体的1/10，最初由比利时科学家Hamers，R在骆驼血液中发现，它是工程化抗体产品中备受关注的一类。它具有分子小、稳定性强、可溶性好、免疫原性低、易表达、易改造等独特优势，并且可根据应用的需要对其进行方便的个性化设计，是目前抗体产品开发的一大热点。纳米抗体已经发展成为有广泛生物应用价值和临床应用价值的通用分子，其应用涉及到疾病诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。利用纳米抗体技术获得针对甲型H3N2流感病毒表位的纳米抗体，从而应用于临床诊断和靶向治疗。
【发明内容】
[0004]发明目的:本发明所要解决的技术问题是提供一种针对甲型H3N2流感病毒表位的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在诊断检测和治疗中的应用。
[0005]技术方案:为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种H3N2纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述的框架区FR由四个框架区组成，分别为FR1、FR2、FR3和FR4，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列:FRl为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
或FRl为SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列；
或FRl为SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.11所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
或FRl为SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.13所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.14所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
或FRl为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.15所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.16所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
或FRl为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.17所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.18所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
所述的互补决定区⑶R由三个互补决定区组成，分别⑶R1、⑶R2和⑶R3，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列:
CDRl为SEQ ID N0.19所示的氨基酸序列， CDR2为SEQ ID N0.20所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.21所示的氨基酸序列；
或CDRl为SEQ ID N0.22所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.23所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.24所示的氨基酸序列；
或CDRl为SEQ ID N0.25所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.26所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.27所示的氨基酸序列；
或CDRl为SEQ ID N0.28所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.29所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.30所示的氨基酸序列；
或CDRl为SEQ ID N0.31所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.32所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.33所示的氨基酸序列；
或CDRl为SEQ ID N0.34所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.35所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.36所示的氨基酸序列。
[0006]本发明的进一步改进在于:H3N2纳米抗体的VHH链具有SEQ ID N0.37、38、39、40、41或42所示的氨基酸序列。
[0007]本发明第二方面，一种H3N2纳米抗体，它是针对甲型H3N2流感病毒表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID N0.37、38、39、40、41或42所示的氨基酸序列的VHH链。
[0008]本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质:权利要求1或2所示的H3N2纳米抗体的VHH链，或权利要求3所示的H3N2纳米抗体。
[0009]优选地，所述的DNA分子，它具有选自下组的DNA序列:如SEQ ID N0.43、44、45、46、47或48所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQ ID NO:43、44、45、46、47或48所示的氨基酸序列。
[0010]本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，它可以表达针对甲型H3N2流感病毒的纳米抗体。
[0011]本发明的第六方面，提供了本发明所述的H3N2纳米抗体检测甲型H3N2流感病毒的应用。
[0012]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发利用灭活的甲型H3N2流感病毒天然抗原免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因库。然后将灭活的甲型H3N2流感病毒分子偶联在酶标板上，展示该蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了 H3N2特异性的纳米抗体基因，再将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是所建文库的插入率检测图，是构建的单域抗体文库的插入率检测结果，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是:第一道为DNA分子标记，其余孔道为检测插入片段的PCR产物，PCR产物带约为500bp ;经检测，该文库的插入率达到90%以上。
[0014]图2是一种H3N2纳米抗体纯化图，是经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后，一种H3N2纳米抗体的SDS-PAGE的电泳图，使用IDA溶液(含有浓度梯度的咪唑)进行洗脱，结果显示，H3N2纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95%以上。
[0015]图3是六种H3N2纳米抗体纯化图，是经镍柱纯化后，得到的六种H3N2纳米抗体的SDS-PAGE的电泳图，其表达的蛋白分别对应SEQ ID NO:45、46、47、43、44或48所示的核苷酸序列。结果显示，H3N2纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95%以上。
【具体实施方式】
[0016]本发明应用针对H3N2偶联在酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，以此形式的抗原筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
[0017]本发明的第一方面，提供了一种H3N2纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区⑶R，所述框架区FR由四个框架区组成，分别为FR1、FR2、FR3和FR4，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列:
FRl为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
或FRl为SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列；
或FRl为SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.11所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
或FRl为SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.13所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.14所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
或FRl为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.15所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.16所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
或FRl为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.17所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.18所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
所述的互补决定区⑶R由三个互补决定区组成，分别⑶R1、⑶R2和⑶R3，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列:
CDRl为SEQ ID N0.19所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.20所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.21所示的氨基酸序列；
或CDRl为SEQ ID N0.22所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.23所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.24所示的氨基酸序列；
或CDRl为SEQ ID N0.25所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.26所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.27所示的氨基酸序列；
或CDRl为SEQ ID N0.28所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.29所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.30所示的氨基酸序列；
或CDRl为SEQ ID N0.31所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.32所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.33所示的氨基酸序列；
或CDRl为SEQ ID N0.34所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.35所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.36所示的氨基酸序列。
[0018]本发明的进一步改进在于:H3N2纳米抗体的VHH链具有SEQ ID N0.37、38、39、40、41或42所示的氨基酸序列。
[0019]本发明第二方面，一种H3N2纳米抗体，它是针对甲型H3N2流感病毒表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID N0.37、38、39、40、41或42所示的氨基酸序列的VHH链。
[0020]本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质:权利要求1或2所示的H3N2纳米抗体的VHH链，或权利要求3所示的H3N2纳米抗体。
[0021]优选地，所述的DNA分子，它具有选自下组的DNA序列:如SEQ ID N0.43、44、45、46、47或48所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQ ID NO:43、44、45、46、47或48所示的氨基酸序列。
[0022]本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，它可以表达针对甲型H3N2流感病毒的纳米抗体。
[0023]本发明的第六方面，提供了本发明所述的H3N2纳米抗体检测甲型H3N2流感病毒的应用。
[0024]本发利用灭活的甲型H3N2流感病毒天然抗原免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因库。然后将灭活的甲型H3N2流感病毒分子偶联在酶标板上，展示该蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了 H3N2特异性的纳米抗体基因，再将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
[0025]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0026]实施例1:H3N2纳米抗体文库的构建:
(１)将0.1mg灭活的甲型H3N2流感天然抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；(2)7次免疫结束后，提取100 mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA ; (3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH ；
(4)利用限制性内切酶PstI及NotI酶切20 Ug PComb3卩遼菌体展示载体(Biovector供应)及10 ug VHH并连接两个片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TGl中，构建H3N2纳米抗体文库并测定库容，库容大小为1.0X109。与此同时，我们随机挑取24颗克隆进行菌落PCR检测，结果表明所建文库的插入率在90%以上，图1显示菌落PCR结果。
[0027]实施例2:针对H3N2的纳米抗体筛选过程:
(I)将溶解在100 mM NaHC03> pH 8.2中的20 Ug灭活H3N2抗原偶联在NUNC酶标板上，4 °C放置过夜；(2)第二天加入100 uL 0.1%酪蛋白，室温封闭2 h ；(3)2 h后，加入100 uL噬菌体(5X 10ntfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，室温作用I h ;(4)用0.05%PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉非特异的噬菌体；(5)用100 mM TEA (triethylamine)将与H3N2特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TGl细胞，37 °C培养I h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮，逐步得到富集。
[0028]实施例3:用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆:
(I)从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100微克每毫升的氨苄青霉素的TB培养基(I升TB培养基中含有2.3克磷酸二氢钾，12.52克磷酸氢二钾，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生长至对数期后，加终浓度I毫摩尔的IPTG，28 °C培养过夜。(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置I小时。(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入一mouse ant1-HA tag antibody(抗鼠抗HA抗体,购自北京康为世纪生物科技有限公司),在室温下放置I小时。(4)用PBST洗去未结合的抗体,加入ant1-mouse alkaline phosphataseconjugate (山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置I小时。(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。(7)将阳性克隆孔的菌转摇在 含有100微克每毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，将⑶R1，⑶R2，⑶R3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终共有6株不同的抗体。其抗体的VHH链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 37、38、39、40、41或42所示。
[0029]实施例4:纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化:
(I)将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在LA+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37 1:培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5 mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37 °C摇床培养过夜；(3)接种I mL的过夜菌种至330 mL TB培养液中，37 °C摇床培养，培养到OD值达到0.6~I时，加入IPTG，28 V摇床培养过夜；(4)离心，收菌；(5)利用渗透法，获得抗体粗提液；(6)经镍柱离子亲和层析可制备纯度达90%以上的蛋白。
[0030]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种针对H3N2纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区⑶R，其特征在于，所述的框架区FR由四个框架区组成，分别为FR1、FR2、FR3和FR4，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列: FRl为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列； 或FRl为SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列； 或FRl为SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.11所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列； 或FRl为SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.13所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.14所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列； 或FRl为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.15所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.16所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列； 或FRl为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQ ID N0.17所示的氨基酸序列，FR3为SEQ ID N0.18所示的氨基酸序列，FR4为SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列； 所述的互补决定区⑶R由三个互补决定区组成，分别⑶R1、⑶R2和⑶R3，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列: CDRl为SEQ ID N0.19所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.20所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.21所示的氨基酸序列； 或CDRl为SEQ ID N0.22所示的氨基`酸序列，CDR2为SEQ ID N0.23所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.24所示的氨基酸序列； 或CDRl为SEQ ID N0.25所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.26所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.27所示的氨基酸序列； 或CDRl为SEQ ID N0.28所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.29所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.30所示的氨基酸序列； 或CDRl为SEQ ID N0.31所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.32所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.33所示的氨基酸序列； 或CDRl为SEQ ID N0.34所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID N0.35所示的氨基酸序列，CDR3为SEQ ID N0.36所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的H3N2纳米抗体的VHH链，其特征在于，它具有SEQID N0.37、38、39、40、41或42所示的氨基酸序列。
3.一种H3N2纳米抗体，其特征在于，它是针对甲型H3N2流感病毒表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID N0.37、38、39、40、41或42所示的氨基酸序列的VHH链。
4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质:权利要求1或2所示的H3N2纳米抗体的VHH链，或权利要求3所示的H3N2纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列^SEQID N0.43、44、45、46、47或48所示的氨基酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，它含SEQ ID NO:43、44、45、46、47或48所示的氨基酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它可以表达针对甲型H3N2流感病毒的纳米抗体。
8.权利要求3 所述的H3N2纳米抗体用于检测甲型H3N2流感病毒的应用。
【文档编号】C12N15/13GK103755804SQ201410038476
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】万亚坤, 欧卫军, 朱敏, 孙燕燕 申请人:南通市伊士生物技术有限责任公司