多工试片的制作方法

多工试片的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种适用于各种类型的检测的多工试片。试片在不同的反应区可预先填充特殊配制的试剂，各反应在特别配制的试剂填充的不同反应区独立地进行。
【专利说明】多工试片

【技术领域】
[0001]本发明是有关于一种试验试片，且特别是有关于一种预先填充聚合酶链反应试剂的多工试片。

【背景技术】
[0002]在分子生物检验领域中，许多特定样品需要进行多种不同的实验或试验方法检测，有时需要针对一个样品进行多种项目检验。例如，在DNA的检测试验中，通过聚合酶链反应(PCR)检测测试，来检验一个样品中数种单核苷酸多态性(SNP)的基因型，或是检验一个样品中数个基因表现程度。实际诊断上会由几个DNA检验(assay)组成一个检验套组(panel)，例如几种PCR检验组成一个癌症诊断的检验套组。PCR检验中每组检验试剂中至少包括两个特定的DNA引子分子(某些PCR检验中还额外包括目标特定的报导探针(reporter probes))，这对引子(引子对)必须正确地与从要进行测试样品(样品)中所萃取的DNA模板混合，方能检验出样品中特定DNA目标是否存在或存在的量是多少。
[0003]传统上，引子对和样品置放于相同的反应容器以进行PCR。一般的置放方式通常是通过吸量管将单瓶储存的引子对、酶和dNTP混合物和缓冲液试剂以及样品一一以手动方式以吸量管移液到反应容器中。最常见的承载容器是96孔盘。利用前述置放方式，PCR检测至少需要两回合(两回)的吸量管移液操作，其中一回添加样品到反应容器中而另一回添加引子对到反应容器中。例如，假设利用一个检验套组来检查在一个样品中的36个目标，则需要至少36回移液操作以添加各自引子对到36个不同的反应容器中，另外需要36回移液操作以添加样品至上述各反应容器。此种操作方式不仅复杂容易出错，而且须耗用大量的人力。
[0004]另一种方法，所谓的多工法(multiplexing approach),是在同一个反应区利用包括一个以上引子对的混合物来测试样品。通常情况下，一个反应容器中加入2?4种引子对。例如，如果一个容器中使用4种引子对时，以测试样品中的36个目标来计，将需要9个反应容器，添加引子对最少需要36回移液操作，加上需要9回移液操作来添加样品，总共需进行45回移液操作。其人力操作已经减少。但尽管多工法具便利性，同一容器内同时进行许多反应可能会导致反应和/或信号检测相互干扰，而使试验的准确性变差。因此，此种多工法难以在一个反应容器中使用多于6种引子对。
[0005]另一种方法是在工厂对个别反应容器预填充引子对。实验室使用者只需要添加样品到已经预先填充好的容器内。以前述例子，测试一个样品的36个目标，将只需要36回移液操作添加样品至预先填充好的36个反应容器中。如果同时采用多工法技术，过程甚至可能被进一步降低至只需9回移液操作。
[0006]此外，另一种方法是降低滴定盘板的反应容器体积至约纳升(nano-liter)的范围内，以节省试剂成本，其样式为类似试片的微滴定板。在微滴定板的反应容器(也称为微井或纳米井孔)的尺寸和体积太小，无法手动填充所用的引子对或样品而又能避免造成相邻反应容器之间的交叉污染(即引子对从一井散逸至其他井)。
[0007]另一种方法是提供具有微流体通道的微流芯片，其可以协助递送检测试剂(主要是引子对)和样品至各单独的反应孔进行独立反应。但是，微流芯片设计和制造不易且检测成本相当高。
[0008]还有一种方法是预先提供引子对至各纳米井并且固定引子于该纳米井的表面。因此，用户可以以单一移液操作或通过单一微流体通道来添加样品到各孔中，而不担心引子从一井散逸到其他井，使井与井之间的交叉污染降至最低。然而，引子固定后会限制其在反应容器内的运动，进而大大降低了 PCR的效率。
[0009]总之，如果这些引子对或探针可以预先被放置在反应区，将可以大大简化人为操作。但是，只要检测反应涉及两个或多个反应区，同样的样品就需要分发到该反应的不同的反应区域，但预先填充的引子必须不能产生区域之间的交叉污染。
[0010]最重要的考虑是，每个反应容器中必须填充预定量的样品。然而，在样品填充过程中，各反应容器中不同的测试检测试剂不能相互交叉污染。传统的方法是，用移液吸管或针状分注器将样品逐个添加到反应井中。随着反应孔体积变小，井间的距离越接近，要将各孔中填充样品却不会产生交叉污染极具挑战性。若需要设计特殊的机械机构的分注器或路径，个别传送至每个反应容器是复杂且耗时的。至于具微通道的微流体装置，微流体装置的设计和微管道配制则会显著地增加生产成本。


【发明内容】

[0011]本发明提供了一种预先填充试剂的多工试片，以用于生物、生物化学或化学分析检测；特别是，用于聚合酶链反应；且更具体地，应用于即时聚合酶链反应。使用释放控制(release-control)的概念,运用特别配方设计的预充式试剂,在样品溶液填充到反应容器中的过程中(样品填充期间)，允许试剂延迟释放。在样品填充期间结束后且PCR开始前，预充的试剂随后被释放到样品溶液中。因此，预先填充试剂的组成成分(如引子和相关联特定的报导探针)将完全悬浮在混合物溶液中，故PCR的效率不会降低。但是，预充式试剂的组成成分在被释放之前具有类似固定化的性质，这将会使因样品填充操作而导致交叉污染的可能性下降。当反应孔中预先填充释放控制物质(控释物质)时，样品可以通过溢流法(overflow)、浸泡法(immers1n)、毛细吸入现象(capillary suct1n)、真空吸引法(vacuum suct1n)、刷涂或刮涂法(squeegee)涂布在反应试片上，以单一回移液操作在很短的时间内便能填充所有的反应孔/井。预装试剂的配方也应使预充式试剂保存和/或运输便利。
[0012]本发明提供了多工试片，其包括至少具有样品装载区域和多个反应容器的检测区域的一试片。其中该些反应容器布置为阵列，每一个反应容器具开口部和比开口部窄的底部，每一个反应容器中包括预充式试剂的配方(formulat1n)和控释物质。
[0013]根据本发明实施例，每一个反应容器有一个倾斜的侧壁连接开口部和底部。
[0014]根据本发明实施例，该预充式试剂的配方包括聚合酶链反应(PCR)的至少一对引子。此外，该预充式试剂的配方可包括报导探针(reporter probes)。
[0015]根据本发明实施例，该控释物质包括甘油。甘油的重量百分比为20%或以上，该预充式试剂的配方变得粘稠且重力滑动率(gravity sliding rate)小于5μηι/天。
[0016]根据本发明实施例，该控释物质包括聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇/聚氧化乙烯(PEG/PEO)、藻酸、天然淀粉或人工淀粉。
[0017]根据本发明实施例，该控释物质包括聚氨酯、琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺。
[0018]根据本发明实施例，该控释物质包括活性炭的微米颗粒或活性炭的纳米颗粒。
[0019]为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图作详细说明如下。

【专利附图】

【附图说明】
[0020]图1A显示根据本发明实施例的例示性检测阵列板示意图；
[0021]图1B是根据本发明实施例的阵列板的反应容器的剖视示意图；
[0022]图2显示出根据本发明实施例的预充式试剂分注模式示意图；
[0023]图3A-3E显示出根据本发明实施例的检测试验的应用程序步骤示意图；
[0024]图4A显示本发明反应容器中具有荧光染料和甘油的预充式试剂所发出的荧光信号不意图；
[0025]图4B显示出添加样品溶液到已经有具有荧光染料和甘油的预充式试剂的反应容器后所发出的荧光信号示意图；
[0026]图4C显示出添加样品溶液到已经有具有荧光染料但不含甘油的预充式试剂的反应容器后所发出的荧光信号示意图；
[0027]图4D显示出经PCR40次热循环后，从装有样品溶液与具荧光染料和控释物质的预充式试剂的反应容器中所发出的荧光信号示意图；
[0028]图4E显示出经PCR40次热循环后，从装有样品溶液与具荧光染料但不含控释物质的预充式试剂的反应容器中所发出的荧光信号示意图。
[0029]附图标记说明:
[0030]10,20,30:检测阵列板；
[0031]32、100:检测区域；
[0032]102:反应容器；
[0033]102a:开口部；
[0034]102b:底部；
[0035]34、104:样品装载区域；
[0036]160a ?160f:纳井；
[0037]22A、22B、22C:分注器；
[0038]20A、20B、20C:反应室；
[0039]320:反应井；
[0040]K:刮板；
[0041]R:预充式试剂；
[0042]S:样品。

【具体实施方式】
[0043]本发明提供多工试片或多工检测阵列板，可以广泛地应用于不同类型的反应检验。本发明提供一种预先填充可测试多种反应的试剂的检验试片，可以是玻璃微孔板或塑料微孔板。生产的检验试片板可以在不同的反应区中包括预充式检测试剂，而在填充有特殊配制试剂的反应区所独立进行的反应可以是相同的或不同的。本发明还提供了一种试剂的控释配方。根据本发明所配制的检验试剂的配方制剂可改善所用试剂长期保存，使所用试剂的运输和分配更容易。
[0044]下面的一些名词特提供说明。
[0045]“试剂”可指用于一个特定测试/检验的数种成分的配方或制剂。例如，在采用聚合酶链反应的试验中，检测试剂包括一对引子、酶、dNTPs、荧光报导物与盐类等。在应用程序中，不同的引子对和荧光报导物可能先被添加到反应容器中，再其次是样品与酶、dNTP和其它添加剂混合再加到反应容器中。
[0046]“样品”一般是指被测试的物品。例如，样品可以是农业标本、病理切片、土壤试样或从上述样品中提取的核酸片段(包括DNA或RNA等)。
[0047]“分析”或“试验”可指对同一样品进行的一或多个实验或测试项目。例如，使用PCR来针对核酸样品检测300单核苷酸多态性(300SNP)基因型，该检测包括数种PCR检测项目，通过检查每个单核苷酸态性(SNP)的每个基因型(A、T、C、G)。例如，使用即时荧光定量PCR确定一个特定序列的核酸量。“样品溶液”或“样品混合物”指的是样品溶液与反应区中试剂的前述部分混合的混合物或混合溶液。
[0048]“反应容器”可指管盘的各个管、各反应管、微滴定板的孔或井，或测试试片或阵列板的凹坑/孔。如本文所述，“试片”、“试片板”、“检测阵列板”或“检测板”均可指容纳前述反应容器的同一衬底或衬板。
[0049]当在容器中的液体体积减小到一定程度时，在容器中的液体流动主要是由表面的附着力而非重力所控制。如果容器中的液体体积只有几纳升，该液体具有较高的表面粘附性会粘着到容器(纳井)上，也就是说，此时液体可以被视为粘接剂般稳定附着至容器底部或容器壁上。
[0050]较佳的，反应容器可以是试验试片或检测阵列板的单个反应孔或井。正如前面所讨论的，优选乃是使用更小的体积的反应容器，其尺寸例如从几纳升到几百纳升不等。
[0051]图1A显示根据本发明实施例的例示性检测阵列板示意图。如图1A所示，检测阵列板(或试片)10例如是:由聚碳酸酯(PC)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成的试片且外形尺寸为36毫米X36毫米Xl毫米。该检测阵列板10具有一个检测区域100，其包含10,000个反应容器(纳井nanowells) 102，该些反应容器102排列为100X100阵列而占据覆盖面积为22.5毫米X 22.5毫米。阵列板10并具有样品装载区域104。从阵列板10的剖视图(图1A的右侧部分)来看，纳井102具有较宽的开口部102a和较窄的底部102b。例如，每个矩形纳井102具深度100微米(dl)，其开口部102a的尺寸:200微米(LI) X 185微米(Wl)与底部102b的尺寸:106.74微米(L2) X 91.74微米(W2)。纳井102之间的距离或间距(Pl)可能范围为25?40微米，纳井102的倾斜侧壁的角度Θ例如大于90度，优选在100至135度之间，更优选在110至120度之间。每个纳井102可以容纳例如2.1纳升的样品溶液。
[0052]图1B是根据本发明实施例的阵列板的反应容器的剖视示意图。在图1B中，阵列板10的反应容器可以设计具有不同的形状或配置方式。例如，纳井160a?160b乃是在检测阵列板10内形成的凹槽但没有贯通检测阵列板10。纳井160b/160d/160f具有倾斜侧壁。纳井160c?160f贯穿检测阵列板10而在检测阵列板10的顶面和底面上有两个开口端。由于毛细作用，样品液体能稳滞于纳井160c?160d中。纳井160d穿透检测阵列板10且在检测阵列板10的顶面和底面上具有两个开口端，并有倾斜的侧壁连接的两个开口端。
[0053]纳井的形状，大小或数量并不限定于该实施例所示。纳井的横截面形状可以是例如圆形，方形或多边形。
[0054]一般情况下，引子是溶于水性溶剂或溶液，本发明的试验试片可能设计为反应区域(井)的内壁和底表面是亲水性的，而在各反应区域(井)之间是疏水性的。预先填充的试剂或探针将只附着至亲水性区域，也就是说，只附着到反应区域(井)的内壁和底部表面。每个反应容器或井的尺寸可以是小于I毫米。以此尺寸大小规模，少量的样品液体可以在10秒内溢流填充大量的反应容器，显著提高了样品装载效率。
[0055]预充式试剂可以通过移液操作(pipetting)或通过任何可能的液体或凝胶分装器而添加到反应容器或反应井中。图2显示出根据本发明实施例的预充式试剂分注模式示意图。预充式试剂乃是制备包括一或多个与控释配方混合的检验试剂。如图2所示，预充式试剂为液态溶液，分别通过不同的分注器22A、22B、22C滴落或分装到检测阵列板20的三个反应室20A、20B、20C。然后检测阵列板20就准备好要存放或装运。如图2所示，在反应室20A、20B和20C中，不同的试剂乃以不同的配给模式(配给图案)来添加，因不同配给模式可能会影响到控制其释放速率或各成分释放比率。
[0056]样品可以通过溢流法(overflow)、浸泡法(immers1n)、毛细吸入现象(capillary suct1n)、真空吸引法(vacuum suct1n)、刷涂或刮涂法(squeegee)涂布在反应试片上。溢流法是使样品溢出或淹浸反应区而使样品填满反应区的方法。浸溃法是将具反应容器或井的试验试片浸泡到样品溶液中，而充填反应容器或井。至于毛细吸入法或真空吸引法，样品可通过毛细作用反应或真空抽吸填充到反应区或容器中。刷涂法或刮涂法是指通过毛刷或刮板同时驱动或推动样品至反应井中。
[0057]图3A-3E显示出根据本发明实施例的检测试验的应用程序步骤示意图。如图3A所示，检测阵列板30上设置有具有多个反应井320的检测区域32和样品装载区域34。如图3B所示，预充式试剂R由分注器36分装添加到反应井320。如图3C所示，利用样品装载装置38将样品S添加到样品装载区域34。在图3D-3E中，刮板K推动样品S而涂布至阵列板30的检测区域32，而使样品S填充至反应井320中。在样品S与预充式试剂R接触后，预充式试剂R开始溶解，并释放特定的引子、荧光报导物或试剂到样品溶液中。然后检测反应在检测反应的优选条件下启动。
[0058]一些试剂可以预先填充至相同的反应井以进行多个反应。
[0059]在样品添加过程中，样品可能会覆盖所有的反应区，并在短期(所谓浸没期)内，样品可能淹没贯通几个反应区。释放控制是指以可控制的方式释放特定成分的机制。例如，特定成分被包围、溶解或吸附在粘性载体、固体或液体之上或之中，以便于在一个特定的时刻释放特定成分。预充引子对的配方设计为在浸没期间或直至浸没期已经结束都不溶解(或只稍微溶解)。释放控制机制可能会通过温度、超音波或光解反应触发，或通过长时间溶解包覆或包埋填充配方。
[0060]通过调整本发明的的试剂或引子的稀释剂配方，试剂或引子可包括至少一种挥发性成分、至少一种低挥发性的成分和至少一种粘性成分。在装填试剂或引子至反应区中之前，高含量的挥发性成分是必需的，以提供足够的流动性，或者通过直接接触或非直接接触型机制，容许试剂或引子分装，并允许液体传送到所欲的反应区中。一旦试剂或引子添加到反应区中，因其挥发性成分挥发减少，从而降低试剂液体的流动性和移动性，而呈现一粘性固硬化状态。预充式检测试剂的水或挥发性溶剂可能会部分或完全去除以便利运输。但是，因为试剂含有非挥发性或低挥发性成分，所述试剂液体无法被完全干燥，进而防止由于过度干燥剥离或剥落。
[0061]在不搅拌或加热的情况下，当暴露于样品液体，因其通过有限的质量传输表面，类似凝胶的试剂或引子探针的溶出率是有限且相当慢的。然而，样品涂布上或填充可能在几秒钟内就完成，故得以避免反应区而不同引子的交叉污染。
[0062]释放控制配方
[0063]在本发明中使用的非挥发性或低挥发性的成分可以是高水溶性、高粘度和低挥发性的物质，例如糖、碳水化合物、甘油、寡醣、多醣或醇类等。在试剂或弓I子预填在反应区中之后，配方中挥发性成分例如水逐渐蒸发，而使非挥发性或低挥发性成分的含量逐渐增加。这样的现象会强化生化反应抑制，故有益于试片保存。如果甘油作为非挥发性成分，在易挥发的挥发性成分蒸发后，例如甘油的重量百分比可能会增加至20%或更多。此种浓度甘油能抑制生化反应更利于长期保存。
[0064]为了实现控制释放的效果，加入控释物质于预填充试剂的配方中，此配方可以被称为作为释放控制预充式试剂的配方。控释物质包括长链的高分子化合物、(能够)形成胶体的成分、(能够)形成多孔结构的成分、(能够)吸附试剂缓慢释放的成分、(能够)与试剂键合缓慢释放的成分或其组合。
[0065]形成胶体的成分可能是聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)或聚乙二醇/聚氧化乙烯(PEG/PE0)，以形成聚合物凝胶。干燥后，在与水接触时需要一定的时间方能完全溶解。藻酸(alginic acid)也被称为褐藻胶(algin)或藻酸盐(alginate),是阴离子多醣，在适当的条件下可以用来形成凝胶。此外，自然或人工的淀粉可以被用来作为形成胶体的成分或控释物质。。
[0066]形成多孔结构的成分填充到反应容器后能够形成多孔结构，该成分可以是例如聚氨基甲酸乙酯、琼脂糖和聚丙烯酰胺。该物质可形成微孔结构填补于反应容器中。
[0067]吸附试剂缓慢释放的成分可以是脂质体，微米颗粒或纳米颗粒如活性炭颗粒。
[0068]与试剂键合缓慢释放的成分是，能够与反应容器的的全部或部分表面反应，使其表面对于需要慢慢被释放出来的试剂具有高亲和力的化合物。也就是说，该成分可以修饰反应容器的表面，是容器表面对于需要缓释的试剂有很高的亲和力或吸附力而得到控释效果。样品进入之后，可以颠倒或改变亲和力或吸附效果而释放出试剂参与反应。通过改变在反应容器中液体的PH值、盐度、温度、酶反应、化学反应或光化学反应，可以颠倒或减少其亲和力或吸附效果。
[0069]具预充式试剂的检测阵列板的制备
[0070]为了实现控制释放的配方，试剂也可以利用水或挥发性溶剂来与控释物质混合，预先填充到反应井(反应容器)。除去水或挥发性成分后，将混合物变成固体或半固体或凝胶形式。试剂如PCR引子分散在在半固体或凝胶态的控释物质(作为基体)中。当样品被施加到该反应井后，由于基体填充物质缓慢溶解，试剂会缓慢释放出来。
[0071]或者，液体状态试剂预先填充到反应井(反应容器)，然后填充控释物质到反应井。除去挥发成分或水后，该混合物变成固体或半固体或凝胶样的形式，适合于保存。
[0072]或者，液体状态控释物质预先填充到反应井(反应容器)中，然后填充试剂到反应井。除去挥发性成分或水后，将混合物变成固体或半固体或凝胶形式。
[0073]又或者，试剂预先填充到反应井(反应容器)中并干燥。然后，控释物质通过喷雾法、注入法或涂层法填充到反应井中，以覆盖干燥的试剂。除去水或挥发性成分从控释物质后，该混合物变成固体或半固体或凝胶样的形式。
[0074]此外，液体状态试剂预填充到反应井(反应容器)中，然后控释物质的干燥粉末喷入反应井覆盖试剂，以形成控制释放膜。
[0075]实例一:(1)配制20?200 μ M的各个检验用的引子DNA水溶液；(2)将各引子DNA水溶液分别定量配送到预定位址的微反应井中；(3)将填好引子DNA的检验芯片置于60°C烘箱I?24小时；(4)配制1%?20%水溶性高分子聚合物溶液(如PVA、PEG、聚酯、琼脂糖、明胶)；(5)取出烘干的检验芯片，将水溶性高分子聚合物溶液以刮板填入微反应井中；以及
(6)以60°C烘箱烘干填有水溶性高分子聚合物溶液的检验芯片。干掉的高分子溶液于引子DNA表面形成一层水溶性的薄膜，当反应液及样品DNA溶液导入时，高分子薄膜会缓缓溶解以释出引子DNA，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。
[0076]实例二:(1)配制20?200 μ M的各个检验用的引子DNA水溶液；(2)将各引子DNA水溶液分别定量配送到预定位址的微反应井中；(3)将填好引子DNA的检验芯片置于60°C烘箱I?24小时；(4)配制溶于己烧的石腊溶液(paraffin wax solut1n in n-hexane)；(5)取出烘干的检验芯片，将石蜡溶液以刮板填入微反应井中；以及(6)于抽气烘箱中将溶剂加温抽离。石蜡附着于引子DNA表面形成一层薄膜，当反应液及样品DNA溶液于室温导入时，石蜡薄膜暂时阻挡引子DNA释出，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。待反应开始加热时，溶解的石蜡将浮出于水溶液的表面，使反应液及引子DNA互溶并开始反应。
[0077]实例三:(1)配制20?200 μ M的各个检验用的引子DNA水溶液；(2)将各引子DNA水溶液分别定量配送到预定位址的微反应井中；(3)将填好引子DNA的检验芯片置于60°C烘箱I?24小时；(4)配制水溶性高分子聚合物溶液(如PVA、PEG、聚酯、琼脂糖、明胶)；
(5)取出烘干的检验芯片，将水溶性高分子溶液以超音波震荡或造雾器形成高分子溶液的微珠，均匀撒入微反应井中；以及(6)将填有水溶性高分子聚合物溶液的检验芯片以烘箱烘干或真空抽干。反应芯片抽干或烘干水分后，引子DNA表层即附上一层可溶性高分子薄膜，当反应液及样品DNA溶液导入时，高分子薄膜会缓缓溶解以释出引子DNA，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。
[0078]实例四:(1)配制20?200 μ M的各个检验用的引子DNA水溶液；(2)将各引子DNA水溶液分别定量配送到预定位址的微反应井中；(3)将填好引子DNA的检验芯片置于60°C烘箱I?24小时；(4)配制水溶性高分子聚合物溶液(如PVA、PEG、聚酯、琼脂糖、明胶)；以及(5)取出烘干的检验芯片放置于加热板上，再将水溶性高分子溶液形成高分子溶液的微珠，均匀撒向微反应井中。当微珠接近加热板时，微珠中液体蒸干成为高分子的微粒而撒入微反应井中，引子DNA表层即附上一层可溶性高分子微粒，当反应液及样品DNA溶液导入时，可溶性的高分子微粒会阻挡并延缓引子DNA的溶解释出，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。
[0079]实例五:(1)配制20?200 μ M的各个检验用的引子DNA水溶液；(2)将各引子DNA水溶液分别定量配送到预定位址的微反应井中；以及(3)将填有引子DNA的检验芯片与石蜡块一同置于反应室中，加热石蜡块使其溶解并产生石蜡蒸气。石蜡蒸气均匀渗入于微反应井中，附于引子DNA表面形成一层薄膜，当反应液及样品DNA溶液于室温导入时，石蜡薄膜暂时阻挡引子DNA释出，因而防止引子DNA于样品DNA和反应液导入时造成的交叉污染。待反应开始加热时，溶解的石蜡将浮出于水溶液的表面，使反应液及引子DNA互溶并开始反应。
[0080]实例六:(I)配制1%?20%水溶性高分子聚合物溶液(如PVA、PEG、聚酯、琼脂糖、明胶)，以刮板将高分子水溶液均匀填入空白芯片的微反应井中；(2)配制20?200 μ M的各个检验用的引子DNA水溶液；(3)将各引子DNA水溶液分别定量配送到已填有高分子水溶液的预定位址的微反应井；(4)将填好引子DNA的检验芯片置于60°C烘箱I?24小时；以及(5)取出烘干的检验芯片。干掉的高分子溶液于引子DNA表面形成一层水溶性的薄膜，当反应液及样品DNA溶液导入时，高分子薄膜会缓缓溶解以释出引子DNA，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。
[0081]实例七:(I于含有1%?20%缓释配方的水溶液中(缓释剂如PEG、PVA或甘油)配制20?200 μ M的引子DNA溶液；(2)将含缓释配方的引子DNA溶液分别定量配送到预定位址的微反应井中；(3)将填好含缓释配方的引子DNA的检验芯片置于60°C烘箱I?24小时。导入反应液及样品DNA溶液时，烘干的引子DNA会延迟溶解释出至少10秒以上，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。
[0082]图4A显示本发明反应容器中具有荧光染料和甘油的预充式试剂所发出的荧光信号示意图。图4B显示出添加样品溶液到已经有具有荧光染料和甘油的预充式试剂的反应容器后所发出的荧光信号示意图。图4C显示出添加样品溶液到已经有具有荧光染料但不含甘油的预充式试剂的反应容器后所发出的荧光信号示意图。图4D显示出经PCR40次热循环后，从装有样品溶液与具荧光染料和控释物质的预充式试剂的反应容器中所发出的荧光信号示意图。图4E显示出经PCR40次热循环后，从装有样品溶液与具荧光染料但不含控释物质的预充式试剂的反应容器中所发出的荧光信号示意图。
[0083]实验如图4A和4B所示，预充式试剂水溶液含有15% (重量百分比)甘油(作为控释物质)以及荧光染料Alexa Fluor 488 (8 μ Μ)以检查样品装载期间的交叉污染状况。如图4Α所示，预充式试剂溶液分装至9个纳井(3X3)中。预充式试剂溶液的液滴位于井底表面上，而挥发性成分(水)蒸发后，甘油的重量百分比可增至20%或更多。水蒸发后，液滴变粘而其重力滑动率小于5 μ m/天，粘附至井的底部或侧壁。在30天的观察期后这些液滴(图4A中显示为圆点)仍然固定在纳井中。样品溶液涂抹检测预先装载的检测阵列板的整个表面，以引入样品。样品溶液可能包含标准的PCR反应混合物，包括dNTPs、氯化镁和TaqDNA聚合酶等。正如图4B中所示，在90?92 °C之间简短加热I分钟后，于纳井中均匀分布的荧光(即荧光染料)表示预充式试剂完全溶解至样品溶液中。例如，预充式试剂的溶出速率在低于90°C时一分钟内为90%或以上，在室温下的溶解率为每秒1%或更小。
[0084]在相邻的纳井间，没有观察到可检测的荧光信号差异。既然该些纳井观察到控制释放的控制效果，在样品溶液的加载过程中应无交叉污染发生。
[0085]与此相反，在图4C的实验中，不含甘油的预充式试剂溶液被存入纳井不久后完全干涸。如图4C所示，九个三列纳井分装入无甘油但含荧光染料的预充式试剂溶液，样品溶液以从左至右涂抹越过纳井阵列的方式载入。加载样品溶液后，立即在三列纳井的左侧第一列可检测到荧光信号。纳井检测的荧光强度从左栏右列逐渐减少。由于没有观察到控释控制效果，避免交叉污染是不可能的。这个实验说明预充式试剂中使用控释配方作为解决方案的重要性。
[0086]同样地，相对于如图4D所示明亮清晰的荧光图案(清晰的圆点阵列、线条或安排为字母的排列图案)，如图4E所示，在不同荧光图案的周围观察到模糊糊化的荧光信号，这表示具有预充试剂但无控释物质的反应容器于引入样品时发生交叉污染。
[0087]综上所述，本发明利用一个特定配方的预充式试剂，使预先放置试剂探针有足够的粘性，能附着至反应区的内壁表面或底表面，流动性小且不易剥落，便于运输或长期储存。特别配制的试剂的释放可被控制，以便于样品填充过程中将不会释放预充式引子探针。在样品填充过程中，样品可能覆盖所有的反应区，而在此很短的时间内样品乃连通全部或一些反应区(即所有或几个反应区实际上是相互连通的)。本发明通过特定配方的预充式试齐U，因反应在不同的反应区独立地进行，反应区之间的引子探针不会发生交叉污染。
[0088]本案的样品也可以直接将试验试片浸溃到样品溶液中来快速大量弓I入样品，使样品自动和迅速地填充到每个反应区。然后，从样品溶液将试验试片取出。引入样品过程期间中，由于预充式试剂的控释效果，确保每个反应区的反应独立性。
[0089]最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
【权利要求】
1.一种多工试片，其特征在于，包括: 至少一试片，具有多个反应容器，其中该些反应容器布置为阵列，每一个反应容器具开口部和底部，每一个反应容器中包括预充式试剂配方和控释物质。
2.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述预充式试剂配方包括聚合酶链反应的至少一对引子。
3.根据权利要求2所述的多工试片，其特征在于，所述预充式试剂配方包括报导探针。
4.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述控释物质包括甘油。
5.根据权利要求4所述的多工试片，其特征在于，甘油的重量百分比为20%或以上，所述预充式试剂配方变得粘稠且其重力滑动率小于5 μ m/天。
6.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述控释物质包括聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇/聚氧化乙烯、藻酸、天然淀粉或人工淀粉。
7.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述控释物质包括聚氨酯、琼脂糖或聚丙烯酰胺。
8.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述控释物质包括活性炭的微米颗粒或活性炭的纳米颗粒。
9.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述至少一试片由聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯所制成。
10.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述每一个反应容器具有一倾斜侧壁连结所述该开口部与所述底部，所述倾斜侧壁的角度Θ大于90度。
11.根据权利要求10所述的多工试片，其特征在于，所述倾斜侧壁的角度Θ在100至135度之间。
12.根据权利要求10所述的多工试片，其特征在于，所述倾斜侧壁的角度Θ在110至120度之间。
13.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述至少一试片包括样品装载区域。
14.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述至少一试片包括盖板覆盖于所述至少一试片上而在所述至少一试片和所述盖板之间以形成一个封闭的空间。
15.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述每一个反应容器具有两个开口端。
16.根据权利要求1所述的多工试片，其特征在于，所述每一个反应容器具有两个开口端和一个倾斜侧壁连接所述两个开口端。
【文档编号】C12M1/00GK104250612SQ201410048563
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年2月12日 优先权日:2013年6月27日
【发明者】邱创泛, 潘诏智, 味正唯, 张钰 申请人:奎克生技光电股份有限公司