一种多器官转移人膀胱癌细胞的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种多器官转移膀胱癌细胞，具体地，涉及一种新的多器官转移膀胱癌细胞系CH-2，于2013年8月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC?NO：C2013129。本发明细胞系细胞形态及传代特点稳定，成瘤性好，其迁移能力极强，用于产生多器官转移的高侵袭性膀胱癌细胞，并可与低侵袭性膀胱癌细胞系联合使用，用于筛选针对不同性质膀胱癌的药物，以及用于筛选与转移相关给基因。
【专利说明】一种多器官转移人膀胱癌细胞
【技术领域】
[0001]本发明属于生物学和肿瘤学领域，具体地，本发明涉及一种新的多器官转移膀胱癌细胞的建立及其应用。
【背景技术】
[0002]人类的各种疾病的发生和发展是十分复杂的，要深入的探讨各种疾病的发病机理及其疗效机制不能在患者身上进行实验。但是可以遵循动物保护法，通过动物对各种疾病和生命现象进行研究，进而推绎到人类探索人类生命的奥秘，探索人类疾病发生发展的规律，以控制人类疾病的发生、发展，治愈疾病和减轻人类患病痛苦，提高生存质量，延长人类的寿命。
[0003]长期以来人们发现，以人本身作为实验对象来推动医学的发展是困难的，临床上所积累的经验不仅在时间和空间上存在着局限性，而且许多实验还在伦理道德和方法学上存在着各种限制。
[0004]人类疾病的动物模型(Animal model of human diseases)是生物医学科学研究中所建立具有人类疾病模拟性表现的动物实验对象和材料。使用动物模型是现代生物医学研究中的一个极为重要的实验方法和手段，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施。
[0005]肿瘤细胞系在肿瘤的基础研究中具有重要地位，体外培养肿瘤细胞是较困难的，尤其建立能够长期生长、传代，又具有一定特征的人肿瘤细胞系。
[0006]膀胱癌是最常见的泌尿系肿瘤之一，直接威胁患者的生存。世界范围内，2008年膀胱癌新发病例386300，有150200例病人死于膀胱癌。膀胱癌主要可以分为两种类型:肌层浸润和非肌层浸润。70%-80%新确诊的膀胱癌患者为非肌层浸润癌，即使及时给予相关治疗也会有50%-70%的复发率和10%-30%的患者进展为肌层浸润癌。而后者极易发生局部浸润或者远处转移，虽然行全膀胱切除术和淋巴结清扫，病人也常常难以治愈，是导致病人死亡的主要原因。不仅仅是膀胱癌，就整个人类恶性肿瘤来说，目前依然缺乏有效预防和治疗淋巴结或远处器官转移癌的方法，对恶性肿瘤的器官转移的机制也不明确。
[0007]就膀胱癌的研究领域而言，目前虽然已有膀胱癌细胞系，但由于其建立时间较早，其遗传背景复杂，传代情况已不稳定且成瘤性较差，其特性和遗传背景也不一致，造成膀胱癌特异性标志物表达参差不齐甚至不表达，且现有的细胞系对癌细胞侵袭程度分类不明确，故目前常用的膀胱癌细胞系已经不能满足现代科研的要求。
[0008]因此，本领域迫切需要开发符合现代膀胱癌变异状况、遗传背景清晰、能够稳定传代且成瘤性好，并具备一定膀胱癌人群特点的膀胱癌细胞系模型，以适用现代医学对动物模型的建立需求。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种具有高度恶性、高度转移性的膀胱癌细胞系。[0010] 本发明第一方面，提供了一种人膀胱癌细胞CH-2，所述细胞是中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:C2013129的多器官转移人膀胱癌细胞。
[0011]本发明第二方面，本发明第一方面所述膀胱癌细胞的子代细胞，所述子代细胞能够导致裸鼠形成膀胱癌以及膀胱癌为原发灶的远处多器官转移。
[0012]在另一优选例中，所述的子代细胞基本保留(≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥ 99%)或全部保留了亲代的人多器官转移膀胱癌细胞CH-2的特性。
[0013]在另一优选例中，所述的子代细胞是CH-2细胞系经过10代以内，更佳地，5代以内传代的子代细胞。
[0014]在另一优选例中，所述膀胱癌细胞细胞或子代细胞具有以下一个或多个特性:
[0015](a)与现有细胞系(如T24)相比，所述的细胞具有特定的癌症相关基因(包括原癌基因和抑癌基因)表达谱；例如，抑癌基因P53和抑癌基因P27均为显著低表达，转移灶中K1-67基因高表达；
[0016](b)所述细胞的转移率为100%。
[0017]本发明第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的人膀胱癌细胞CH-2的用途，用于在非人哺乳动物中产生多器官转移膀胱癌或用于筛选治疗多器官转移膀胱癌的候选化合物。
[0018]在另一优选例中，所述的哺乳动物选自大鼠、小鼠、兔、羊、狗、猴子。
[0019]在另一优选例中，所述的哺乳动物是免疫缺陷实验动物。
[0020]在另一优选例中，所述的动物为裸鼠(T细胞缺陷)，N0N/SCID小鼠(T细胞、B细胞及NK细胞联合缺陷)。
[0021]本发明第四方面，提供了一种建立多器官转移膀胱癌动物模型的方法，包括步骤:
[0022](i)将IX IO4-1X IO9个本发明第一方面所述膀胱癌细胞或其子代细胞接种于非人哺乳动物；
[0023](ii)培养(i)中的哺乳动物7-100天，从而获得膀胱癌动物模型；
[0024]较佳地,所述的哺乳动物为免疫缺陷小鼠,培养天数为35天。
[0025]在另一优选例中，所述的接种是接种于以下部位:膀胱、腹腔、尾静脉、皮下部位或
其组合。
[0026]在另一优选例中，所述的哺乳动物是免疫缺陷实验动物。
[0027]本发明第五方面，提供了一种筛选治疗多器官转移膀胱癌的候选化合物的方法，包括步骤:
[0028](a)将I X IO4-1X IO9个权利要求1所述的人膀胱癌细胞或其子代细胞接种于哺乳动物；
[0029](b)培养步骤(a)的哺乳动物7-100天，获得膀胱癌动物模型；和
[0030](c)将测试化合物施用于步骤(b)的膀胱癌动物模型，并与未施用测试化合物的步骤(b)的膀胱癌动物模型进行比较，其中施用后导致膀胱癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗膀胱癌的候选化合物；
[0031]或者所述方法包括:
[0032](al)测试组中，在权利要求1的人膀胱癌细胞CH-2的培养体系中添加测试化合物，并观察膀胱癌细胞CH-2的数量和/或生长情况；在对照组中，在人膀胱癌细胞CH-2的培养体系中不添加测试化合物，并观察膀胱癌细胞CH-2的数量和/或生长情况；
[0033]其中，如果测试组中膀胱癌细胞CH-2的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对膀胱癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗膀胱癌的候选化合物。
[0034]在另一优选例中，在步骤(C)中，将测试化合物的施用方式选自下组:局部施用于膀胱癌病灶处、静脉给药、口服给药。
[0035]本发明第六方面，提供了一种膀胱癌细胞CH-2的用途，用于筛选膀胱癌侵袭性相关基因；较佳地，所述的膀胱癌细胞CH-2用于构建膀胱癌多器官动物转移模型。
[0036]本发明第七方面，提供了一种筛选潜在的膀胱癌侵袭性相关基因的方法，包括步骤:[0037]本发明第一方面所述膀胱癌细胞或其子代细胞中表达的基因与低侵袭性人膀胱癌细胞或正常膀胱细胞中表达的基因比较，选出权利要求1所述膀胱癌细胞中在统计学上表达上调或下调的基因，该基因为潜在的膀胱癌侵袭性相关基因。
[0038]在另一优选例中，所述的方法还包括:
[0039]对所获得的潜在的膀胱癌侵袭性相关基因进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以选出对于多器官转移膀胱癌其确切作用的基因。
[0040]在另一优选例中，所述的低侵袭性人膀胱癌细胞选自:中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:C2013128的低侵袭性人膀胱癌细胞CH-1或现有膀胱癌细胞系T24。
[0041]在另一优选例中，一种体外培养多器官转移膀胱癌细胞的方法，其特征在于，包括步骤:在适合的培养基中，培养本发明第一方面所述的人膀胱癌细胞或其子代细胞。
[0042]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1显示了 CH-2细胞系及转移细胞系形态，细胞呈不规则多边形或梭形，符合上皮细胞表型。
[0044]其中，图1A为CH-2细胞系(20代)，40X ;图1B为CH-2细胞系(20代)，100X。
[0045]图2显示了 CH-2细胞系增值曲线。细胞铺板后(约1000/空)24小时后每24小时用CCK-8试剂检测细胞增殖活性(24-120小时)提示CH-2细胞系约在第48h_72h内呈对
数生长。
[0046]图3显示了 CH-2细胞系染色体非显带标本组行分析与排列，可见于正常染色体相t匕，其染色体畸形且多处染色体断臂缺如或转位。
[0047]图4显示了 CH-2裸鼠膀胱原位及多器官转移模型。
[0048]图5A显示了处死裸鼠后，解剖发现发生右肾上极转移，双侧肾盂及输尿管未见异常；
[0049]图5B显示了右肾转移的组织培养出细胞系后再次膀胱原位种植35天解剖后发现腹膜后淋巴结转移。
[0050]图5C显示了右肾转移的组织培养出细胞系后再次膀胱原位种植35天解剖后出现的肝脏多发转移，左图为正常肝脏，右图为肿瘤转移后的肝脏。
[0051]
[0052]图6为免疫组化检测显示裸鼠原位瘤和病人膀胱癌组织CKaei的表达情况。
[0053]图6A显示了病人膀胱癌组织癌上皮细胞高表达角蛋白CKaei，而间质组织未见表达。图6B显不裸鼠原位瘤闻表达CKaei蛋白。
[0054]图7显示了所述的细胞与现有细胞系T24相比抑癌基因P53低表达，抑癌基因P27表达量类似。
【具体实施方式】
[0055]本发明人经过广泛而深入的研究，对数十例T2-T4期膀胱癌原发灶细胞进行培养和筛选，最后建立了一种新的多器官转移膀胱癌细胞系CH-2，其恶性程度高、成瘤性好、传代特性稳定，且具有高度转移性，可用于膀胱癌多转移性动物模型的建立，并可与低侵袭性膀胱癌细胞系联合使用，用于筛选针对不同性质膀胱癌的药物，并可用于筛选与转移相关基因。此外，本发明人还筛选了 Tl期膀胱癌原发灶，并建立了一种人低侵袭性膀胱癌细胞系CH-1，在此基础上，完成了本发明。[0056]具体地，本发明人将数十例T2-T4期膀胱癌原发灶细胞，分别接种于免疫缺陷小鼠，经培养生长后，进行裸鼠连续传代后取肿瘤组织进行体外传代培养，并提取产生的转移瘤进行进一步培养，并在通过相关生物学检测后，筛选获得一种传代稳定、高恶性、高转移性的膀胱癌细胞系。动物学实验表明，该细胞系接种裸鼠后导致裸鼠产生肿瘤以及多发性远处转移瘤，其病理形态学与原患者肿瘤细胞形态学相一致。
[0057]术语
[0058]如本文所用，术语“多器官转移膀胱癌细胞系”、“人高侵袭性膀胱癌细胞CH-2”、“本发明膀胱癌细胞系”、“本发明细胞”、“本发明细胞系CH-2”、“本发明高侵袭性膀胱癌细胞”、“本发明多发转移性膀胱癌细胞”可互换使用，均指本发明多器官转移膀胱癌细胞系CH-2，其在2013年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉、中国)，保藏编号为 CCTCC NO:C2013129
[0059]如本文所用，术语“多器官转移”指通过淋巴或血液途径在除原发灶以外一个或多个器官、组织中发生转移的现象。
[0060]细胞系特点
[0061]本发明高侵袭性膀胱癌细胞与现有的膀胱癌细胞系相比，其染色体畸形且多处染色体断臂缺如或转位。此外本发明膀胱癌细胞系具有以下一种或多种特征:
[0062](a)与现有细胞系(如T24)相比，所述的细胞具有特定的癌症相关基因(包括原癌基因和抑癌基因)表达谱；例如，抑癌基因P53和抑癌基因P27均为显著低表达，转移灶中CKaei基因和K1-67基因高表达；
[0063](b)所述细胞的转移率为100%。
[0064]此外，本领域技术人员可以根据本领域细胞传代培养的常规方法，对CH-2细胞系进行传代从而获得CH-2的子代细胞。当然，为了保持CH-2遗传特性的同一性，优选采用CH-2传10代以内(更佳地为5代以内)的细胞系作为CH-2的子代细胞，当传代至10代以上时，则需通过测序鉴定才能够确定保持子代细胞的同源性。通常，本领域会选用具有亲代细胞系95%以上同源性的子代细胞，且所述的子代细胞必须保持或基本保持亲代细胞的生物特性。
[0065]应用
[0066]本发明的多器官转移膀胱癌细胞系可用于制备多器官转移膀胱癌动物模型，还可用于筛选治疗多器官转移膀胱癌候选药物。
[0067]一种优选的建立多器官转移膀胱癌动物模型的方法，包括步骤:
[0068]⑴将I X IO4-1 X IO9个权利要求1所述膀胱癌细胞或其子代细胞接种于哺乳动物；
[0069](ii)培养(i)中的哺乳动物7-100天，从而获得膀胱癌动物模型。
[0070]其中，所述的接种是接种于以下部位:膀胱、腹腔、尾静脉、皮下部位或其组合；所述的哺乳动物是免疫缺陷实验动物。
[0071]一种优选的筛选治疗多器官转移膀胱癌的候选化合物的方法，包括步骤:
[0072](a)将IXlO4 — IXlO9个本发明上述的人膀胱癌细胞或其子代细胞接种于哺乳动物；
[0073](b)培养步骤(a)的哺乳动物7-100天，获得膀胱癌动物模型；和
[0074](C)将测试化合物施用于步骤(b)的膀胱癌动物模型，并与未施用测试化合物的步骤(b)的膀胱癌动物模型进行比较，其中施用后导致膀胱癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗膀胱癌的候选化合物；
[0075]或者所述方法包括:
[0076](a)测试组中，在本发明所述的人膀胱癌细胞CH-2的培养体系中添加测试化合物，并观察膀胱癌细胞CH-2的数量和/或生长情况；在对照组中，在人膀胱癌细胞CH-2的培养体系中不添加测试化合物，并观察膀胱癌细胞CH-2的数量和/或生长情况；
[0077]其中，如果测试组中膀胱癌细胞CH-2的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对膀胱癌细胞的生长、转移或增殖有抑制作用的治疗膀胱癌的候选化合物。
[0078]优选地，所述的哺乳动物是免疫缺陷小鼠(裸鼠)，其培养时间为35天。
[0079]此外，本发明多器官转移膀胱癌细胞系还可与低侵袭性膀胱癌细胞系配对使用，用于筛选潜在的膀胱癌相关基因以及治疗不同侵袭程度膀胱癌的药物筛选。
[0080]通用方法
[0081]所有膀胱癌原发灶均取自罹患膀胱癌并至本院进行手术切除的患者，膀胱癌经检查后确认为T2-T4期，所有患者或其家属均签署术后标本用于科研的知情同意书。
[0082]原代细胞培养
[0083]对膀胱癌原代细胞的培养可采取本领域常规手段，一种优选的培养方法如下:
[0084]取患者癌组织，放入15ml离心管加入0.5%胶原酶IV 2_3ml震荡后37 °C消化15min;充分消化后用Iml玻璃吸管反复吹打至无明显组织块后放入离心机700g离心5min ;弃上清，加入含10%胎牛血清的RPM1-1640培养液IOml和双抗(青霉素和链霉素)100 μ I后吹打均匀放入两个25 cm 2培养瓶中于37°C C02浓度为5%的美国Thermo 二氧化碳孵养箱内培养，24小时后换液继续培养。2-3天换液一次，并用相差显微镜观察上皮细胞和间质细胞生长状态。两培养瓶中的上皮细胞呈不规则的多边形和梭形，间质细胞呈长条形或绳索状，二者均贴壁生长。数天后，相差显微镜下观察可发现细胞培养瓶底出现大量细胞克隆。采用选择消化法去除间质细胞。0.25%胰酶用PBS稀释10倍，加入培养瓶显微镜下观察间质细胞由条索状变为圆球时轻轻吹打，此时吹打下来的细胞为间质细胞，然后按常规细胞消化传代法将剩下的细胞由25 cm 2培养瓶转入75 cm 2继续培养。
[0085]动物模型
[0086]本发明的动物模型可采用各种免疫缺陷的哺乳动物，优选地，为裸鼠。一种优选的本发明动物模型制备方法如下:膀胱癌细胞系传至第20代时用胰酶消化离心用RPM1-1640培养液配成每100 μ I含1-5 X IO6的个细胞的悬液300 μ I备用。选取生长状态良好的4_6周雌性裸鼠用于建立动物模型。待裸鼠麻醉后，腹部及会阴部消毒，有24G静脉留置针为导尿管插裸鼠膀胱内排空膀胱后注入胰酶100μ 1，用I号线结扎裸鼠尿道并同时退出导管。胰酶消化膀胱30min后抽出胰酶并用100μΙ PBS冲洗膀胱一次，注入准备好的细胞悬液100μΙ，同样结扎尿道。两小时后去除结扎线。观察荷瘤鼠生长状态，三周处死。荷瘤鼠处死后解剖，由下向上按系统仔细分析观察各脏器有无异常或肿瘤转移。
[0087]增殖曲线[0088]细胞在6cm盘中用含10%胎牛血清的RPMI1640于37°C含5%C02的培养箱中培养3天，密度约为70-80%时用胰酶消化。用玻璃吸管吹打后移至15ml离心管中700g离心5min，用手工计数板调整细胞密度为10个/ul。每种细胞用微型移液器吸取细胞悬液IOOul于96孔板，做三个重复。观察5天，CH-2原代细胞系观察5次，其余观察3次。用450nm波长观测CCK-8试剂吸光度。细胞系倍增时间的计算是选取细胞在对数生长期的一段时间。
[0089]染色体核型分析
[0090]SKY实验:(I)细胞传代后培养2d ; (2)试验前换液加入秋水仙素(lng/L)继续培养2h后收获细胞；(3)按常规方法制备染色体进行核型分析。结果判读:分析10个分裂象，出现2个或以上相同的染色体或染色体片段增加时定义为扩增；出现3个或以上相同的染色体或染色体片段缺失时定义为缺失，染色体核型的描述使用国际上通用的标准，染色体倍体根据细胞系的染色体数决定，以倍体为标准确定缺失或扩增。
[0091]免疫组化检测
[0092]转移灶取下后用4%甲醛固定24小时后，连同原病人肿瘤组织一起由医院病理科脱水包埋做成蜡块后用石蜡切片机(德国Leica)切成5 μ m每片，用于HE染色和免疫组化检测。用于免疫组检测的抗体有CKaei (购自北京中衫金桥生物技术有限公司)。二抗购自长岛公司。
[0093]本发明的主要优点在于:
[0094]1.本发明的膀胱癌细胞系CH-2的性状稳定，可稳定多次传代。
[0095]2.本发明的膀胱癌细胞系CH-2的成瘤性好，恶性程度高，是膀胱癌的基础和临床前期应用研究的理想细胞系(有效性试验)，填补了目前膀胱癌研究领域中对高度转移性膀胱癌模型的缺陷。
[0096]3.本发明的膀胱癌细胞系CH-2遗传特性明确，其低表达P53
[0097]4.本发明的膀胱癌细胞系CH-2可与低侵袭性膀胱癌细胞系配对使用，用于筛选膀胱癌转移相关基因以及筛选针对不同侵袭性膀胱癌的治疗药物。
[0098]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0099]实施例1CH-2细胞系的建立
[0100](a)来源:
[0101]肿瘤分期:T2-T4
[0102]主诉:血尿
[0103]膀胱镜检:膀胱三角区2X2cm占位
[0104]病理:高级别尿路上皮癌
[0105]手术:膀胱癌电切术
[0106](b)原代细胞培养:
[0107]取癌组织0.5X0.5cm进行原代细胞培养，方法参见通用方法。
[0108]胶原酶消化后的新鲜膀胱癌组织离心铺板后约5小时细胞就可以贴壁生长。5天左右可出现大量细胞克隆，此时可见间质细胞和上皮细胞混杂生长。用差异消化法传代3次后可基本清除间质细胞。
[0109](c)动物模型建立:
[0110]取细胞接种于免疫缺陷小鼠，CH-2细胞系第一次体内共种植3只雌性裸鼠，3只裸鼠均成功荷瘤。35天后处死3只裸鼠，解剖后发现，3只裸鼠均发生不同数目的远处转移。
[0111]实施例2多器官转移膀胱癌细胞系CH-2的生物学特性
[0112]形态学观察:该细胞系呈梭形或多边形(图1)，细胞形态稳定。
[0113]增殖活性:采用CCK-8试剂检测CH-2细胞系的增殖活性，发现它的倍增区间为48-72小时(图2)。
[0114]传代活性:该细胞系已经传至第86代，细胞形态和生长速度不变，冻存后复苏良好。
[0115]相关蛋白表达及多器官转移膀胱癌的标志物表达:
[0116]a.通过免疫组化方法用鼠抗人角蛋白抗体CKaei检测鼠原位瘤的来源及种属。结果显示,病人尿路尿路上皮癌组织高表达CKaei蛋白，而间质组织未见表达(图6A)。病人组织和原位瘤几乎不表达K1-67，在转移灶中高表达。病人组织低表达P53蛋白，原位瘤和个转移灶几乎不表达。
[0117]实施例3低侵袭性膀胱癌细胞系CH-2的转移率和种植成瘤率研究
[0118]取细胞接种于免疫缺陷小鼠，CH-2细胞系第一次体内共种植40只雌性裸鼠，38只裸鼠成功荷瘤，其中所有小鼠均出现淋巴结或者其他脏器的转移。重复上述实验3次，取平均荷瘤成功率以及转移率，结果发现改细胞系的荷瘤成功率约为75-80%，转移率为100%。
[0119]实施例4低侵袭性膀胱癌细胞系CH-2子代细胞制备与应用
[0120]4.1对CH-2细胞进行传代5-10代，获得所述CH_2细胞系的子代细胞，并对不同代数的细胞系进行测序，结果发现当传代至10代时，所有的子代细胞与CH-2的同源性均大于95%。
[0121]4.2采用实施例2的方法研究5-10代子代细胞的生物学特性，结果显示与CH_2亲代细胞一致。[0122]细胞系保藏
[0123]本发明的人低侵袭性膀胱癌细胞CH-1，于2013年8月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉，中国)，保藏号为CCTCC NO:C2013128。[0124]本发明的人高侵袭性膀胱癌细胞CH-2，于2013年8月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉，中国)，保藏号为CCTCC NO:C2013129。
[0125]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种人膀胱癌细胞CH-2，所述细胞是中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNO:C2013129的人高侵袭性膀胱癌细胞CH-2即多器官转移人膀胱癌细胞。
2.权利要求1所述膀胱癌细胞的子代细胞，所述子代细胞能够导致裸鼠形成膀胱癌以及膀胱癌为原发灶的远处多器官转移。
3.如权利要求1所述的膀胱癌细胞或权利要求2所述的子代细胞，所述膀胱癌细胞细胞或子代细胞具有以下一个或多个特性: (a)与现有细胞系(如T24)相比，所述的细胞具有特定的癌症相关基因(包括原癌基因和抑癌基因)表达谱；例如，抑癌基因P53和抑癌基因P27均为显著低表达，转移灶中K1-67基因高表达； (b)所述细胞的转移率为100%。
4.权利要求1所述的人膀胱癌细胞CH-2的用途，用于在非人哺乳动物中产生多器官转移膀胱癌或用于筛选治疗多器官转移膀胱癌的候选化合物。
5.如权利要求4所述的用途，所述的哺乳动物选自大鼠、小鼠、兔、羊、狗、猴子。
6.一种建立多器官转移膀胱癌动物模型的方法，包括步骤: (i)将I X IO4-1 X IO9个权利要求1所述膀胱癌细胞或其子代细胞接种于非人哺乳动物； (?)培养(i)中的哺乳动物7-100天，从而获得膀胱癌动物模型； 较佳地，所述的哺乳动物为免疫缺陷小鼠，培养天数为35天。
7.一种筛选治疗多器官转移膀胱癌的候选化合物的方法，包括步骤: (a)将IX IO4-1X IO9个权利要求1所述的人膀胱癌细胞或其子代细胞接种于哺乳动物； (b)培养步骤(a)的哺乳动物7-100天，获得膀胱癌动物模型；和 (c)将测试化合物施用于步骤(b)的膀胱癌动物模型，并与未施用测试化合物的步骤(b)的膀胱癌动物模型进行比较，其中施用后导致膀胱癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗膀胱癌的候选化合物； 或者所述方法包括: (al)测试组中，在权利要求1的人膀胱癌细胞CH-2的培养体系中添加测试化合物，并观察膀胱癌细胞CH-2的数量和/或生长情况；在对照组中，在人膀胱癌细胞CH-2的培养体系中不添加测试化合物，并观察膀胱癌细胞CH-2的数量和/或生长情况； 其中，如果测试组中膀胱癌细胞CH-2的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对膀胱癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗膀胱癌的候选化合物。
8.—种膀胱癌细胞CH-2的用途，用于筛选膀胱癌侵袭性相关基因；较佳地，所述的膀胱癌细胞CH-2用于构建膀胱癌多器官动物转移模型。
9.一种筛选潜在的膀胱癌侵袭性相关基因的方法，包括步骤: 将权利要求1所述膀胱癌细胞或其子代细胞中表达的基因与低侵袭性人膀胱癌细胞或正常膀胱细胞中表达的基因比较，选出权利要求1所述膀胱癌细胞中在统计学上表达上调或下调的基因，该基因为潜在的膀胱癌侵袭性相关基因。
10.如权利要求9所述的方法，所述的方法还包括: 对所获得的潜在的膀胱癌侵袭性相关基因进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以选出对于多器官转移膀胱癌其确切作用的基因。
11.一种体外培养多器官转移膀胱癌细胞的方法，其特征在于，包括步骤:在适合的培养基中，培养权利要求1所述的人膀胱癌细胞或其子代细胞。
【文档编号】C12Q1/02GK103911343SQ201410084333
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】许传亮, 徐伟东, 任善成, 韦荣超, 吴承耀, 孙颖浩 申请人:许传亮, 徐伟东, 任善成, 韦荣超, 吴承耀, 孙颖浩