膀胱癌细胞的检测方法、用于膀胱癌细胞的检测方法的引物及膀胱癌标记物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种对膀胱癌的特异度高且能够检测出恶性度低的膀胱癌组织的检测灵敏度高的膀胱癌的检测方法及膀胱癌标记物。其为包括由从受检者采取的受检者样品检测膀胱癌标记物的表达量的步骤的膀胱癌细胞的检测方法、用于膀胱癌细胞的检测方法的引物及膀胱癌标记物，所述膀胱癌标记物包含选自miR-124、miR-9和miR-137中的1种以上的miRNA。
【专利说明】膀胱癌细胞的检测方法、用于膀胱癌细胞的检测方法的引物及膀胱癌标记物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种由从受检者得到的样品检测受检者的癌的方法、特别是检测膀胱癌细胞的方法及用于该方法的引物、作为膀胱癌标记物的物质。
【背景技术】
[0002]目前，在膀胱癌的检测中，最广泛使用尿细胞学检查。尿细胞学检查通过从尿内采取从膀胱剥离并脱落于尿内的膀胱细胞，用显微镜观察其形状来检测癌细胞。
[0003]另一方面，关于通过对组织检测作为进行基因调控的短RNA的微RNA (以下，“微RNA”有时可以与“miRNA”或“miR”、“hsa-miRNA”分别交换使用。)的表达量而进行癌组织检测的方法进行了研究。作为这样的技术，在专利文献I中公开了以检体中包含miR-9及miR-137的miRNA的基因表达的降低为指标检测检体的癌化的癌的检测方法以及通过使这些基因表达的癌抑制方法及癌抑制剂。
[0004]在专利文献2中公开测定来自对象的试验样品中的miRNA基因产物的水平，对是否具有乳腺癌、或有无发生危险进行检测的方法。
[0005]在专利文献3中公开了一种使BCL2关联癌的抗癌治疗的效力增加的方法，该方法是通过向对象投与至少I种抗癌治疗及向对象投与至少I种miR基因产物且含有作为与BCL2基因转录体中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因产物而进行的用于BCL2关联癌的诊断及疗法的方法。具体而言，公开了在癌中的慢性淋巴细胞性白血病中，投与miR基因中的miR-15及miR-16的验证结果。作为miRNA的表达有可能减少的癌组织，记载有膀胱。另外，作为可以用于BCL2关联癌的诊断及疗法的miRNA，例示有miR-137及miR-9。
[0006]在专利文献4中公开了将包含miR-137的微RNA作为妇科癌的生物标记物使用的妇科癌的判定方法。作为妇科癌的判定方法，记载了直接检测miRNA的表达量的方法。
[0007]在专利文献5中公开了一种预测癌患者的治疗后生存的方法，其包含:检测接受了治疗的癌患者的包含hsa-miR137的微RNA的表达水平，基于该微RNA的表达水平计算患者的风险分数，及基于风险分数的值确定治疗后生存的预见。作为预测的癌的实例，记载有肺癌、白血病、乳腺癌、胰腺癌、腺癌、鳞状细胞癌、结肠癌或肝细胞癌。
[0008]在专利文献6中公开了一种方法，该方法测定至少I种miR基因产物的水平，判断受检者是否具有实体癌或是否存在发生实体癌的危险性的任一种。
[0009]在非专利文献I中记载了 miR-137在大肠癌中的表达。在非专利文献2中记载了包含miR-137的miRNA在口腔癌中的表达。在非专利文献3中记载了 miR-137在大肠癌中的表达。
`[0010]现有技术文献
[0011]专利文献
[0012]专利文献1:日本特开2009-171876号公报
[0013]专利文献2:日本特表2009-505639号公报[0014]专利文献3:日本特表2009-507918号公报
[0015]专利文献4:日本特开2010-154843号公报
[0016]专利文献5:日本特表2010-523156号公报
[0017]专利文献6:日本特表2009-531019号公报
[0018]非专利文献
[0019]非专利文献1:F.Balaguer et al, Cancer Res2010; 70:6609-6618.[0020]非专利文献2:K.Kozaki et al, Cancer Res2008; 68:2094-2105.[0021]非专利文献3:M.Liu et al, Int.J.Cancer: 128, 1269-1279 (2011).
【发明内容】
[0022]发明所要解决的课题
[0023]目前，在广泛用于膀胱癌检测的尿细胞学检查中，在膀胱癌检测的灵敏度上存在问题。即，尿细胞学检查由于用显微镜观察细胞的形状，因此，如果根据该形状可以明显地检测判断为肿瘤细胞的细胞，则可以特异性地检测膀胱癌细胞，但是对于不能根据形状判断的恶性度低的肿瘤细胞而言，则无法检测。因此，检测恶性度低的肿瘤是困难的。
[0024]因此，本发明的发明人等为了追求对癌细胞的特异度和能够检测恶性度低的肿瘤的检测灵敏度，着眼于基因学上检测癌细胞的方法，特别是利用miRNA检测的癌检测方法。需要说明的是，在专利文献I中，利用miRNA检测的癌检测方法以及通过使其表达的癌抑制方法及癌抑制剂，但所公开的是针对口腔鳞状细胞癌的物质，对膀胱癌的组织没有进行验证。
[0025]在专利文献2中，记载了对乳腺癌或发生乳腺癌的危险进行检测的方法及组合物，但对膀胱癌的组织没有进行验证。
[0026]在专利文献3中，在作为miRNA的表达一般可以减少而多数例示的癌组织之一中包含膀胱，但对在膀胱癌中表达降低的基因没有进行具体地验证，也没有例示能够适用于膀胱癌的根据。作为投与的miRNA基因列举了 miR-137及miR_9，但只不过是在使BCL2基因的表达降低与癌的治疗有关的假说下，作为有可能使该BCL2基因的表达在理论上降低的多数的miRNA的候补中之一而例示的，这些miRNA实际上是否降低BCL2基因表达没有进行验证。另外，该方法限定于与BCL2基因和/或基因产物的过量表达相关联的癌的治疗可能性，关于miR-137及miR-9的给药实际上是否与癌的治疗有关则完全没有验证。
[0027]在专利文献4中，对所谓的妇科癌的判定方法及判定试剂盒进行了记载，但对膀胱癌没有记载。而且确认在子宫体癌中miR-137的表达反而上升。
[0028]在专利文献5中公开了预测癌患者的治疗后的生存的方法，但对是否为癌患者的检测方法没有进行记载。另外，对于癌而言，没有记载膀胱癌。
[0029]在专利文献6中，在6种癌(乳腺、大肠、肺、胰腺、前列腺、胃)中，miR-137的表达没有变化。miR-137是在不选择作为测定基因的基因(段落[0037])中被列举的，特别是对上述6种癌的测定中，也分别在不选择的基因中被列举。
[0030]在非专利文献I~3中，对包含miR-137的miRNA`的表达与大肠癌、口腔癌的发病及大肠癌的浸润的关联分别进行了记载，但对膀胱癌没有进行验证。
[0031]如上所述，根据癌种或癌的状态，关联的miRNA或其表达水平存在各种差异，表现出复杂的机制，本发明的发明人等对在膀胱癌中表达抑制的miRNA进行了探索。结果发现了在膀胱癌中表达抑制的miRNA，并发现了通过测定其表达量的膀胱癌的检测方法，从而完成了本发明。
[0032]因此，本发明的目的在于提供一种对膀胱癌的特异度高且能够检测恶性度低的膀胱癌组织的检测灵敏度高的膀胱癌细胞的检测方法、用于该方法的引物及膀胱癌标记物。
[0033]用于解决课题的技术方案
[0034]本发明的膀胱癌细胞的检测方法包括由从受检者采取的受检者样品检测膀胱癌标记物的表达量的步骤，该膀胱癌标记物包含选自miR-124、miR-9和miR-137中的I种以上的miRNA。
[0035]在膀胱癌的组织中，将与正常组织相比特异性地表达量不同的miRNA作为膀胱癌标记物检测。组织内的miRNA可以用实时reverse-transcription PCR (实时逆转录PCR、实时RT-PCR、定量RT-PCR)等方法迅速且准确地定量检测表达的有无及其量，因此，可以通过检测选自miR-124、miR-9及miR-137中的I种以上的miRNA的表达量而特异性地检测膀胱癌细胞，且即使为恶性度低的膀胱癌组织也可以进行检测。
[0036]膀胱癌标记物的表达量的检测优选通过检测膀胱癌标记物基因的甲基化(甲基化胞嘧啶)来检测上述膀胱癌标记物的表达量的降低。在膀胱癌细胞中，miR-124、miR-9及miR-137等的表达在编码各自的基因组基因上通过甲基化而被抑制，因此，对于miR-124而目，可以检测miR-124-2基因及miR-124-3基因中的甲基化，对于miR-9而目，可以检测miR-9-3基因的甲基化，对于miR137而言，可以检测miR-137基因中的甲基化，由此能够检测膀胱癌细胞中的这些miRNA的表达量的降低和膀胱癌细胞。在大量地表达对象miRNA的正常组织中含有癌组织的情况下，采用直接检测表达量的方法时，由于正常组织中的表达被检测，所以有时难以对癌组织中的对象miRNA进行检测，通过将甲基化这样的阳性的信号作为表达量的降低来检测，能够明确且可靠地检测其存在。
[0037]此外，膀胱癌细胞的检测方法包含由从受检者采取的受检者样品检测选自miR-137基因、miR-124-2基因、miR-124-3基因及miR-9-3基因中的I种以上的基因的甲基化的水平。在该检测方法中，优选将甲基化的水平与阈值进行比较。将判明不是癌组织的另外组织或其它部位的组织等中的上述基因的甲基化的水平设定为阈值，相对于该阈值将作为检测对象的组织中的上述基因的甲基化的水平进行比较，由此能够检测膀胱癌细胞。受检者样品中的甲基化的水平比阈值高时，可以判定受检者样品为癌组织。
[0038]优选利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行甲基化的检测。利用本方法，可以精密且定量地进行作为对象的miRNA的检测，因此能够可靠地进行膀胱癌细胞的组织的检测。
[0039]膀胱癌标记物优选至少包含miR-137。miR-137在膀胱癌细胞中与正常组织相比在表达量上可看到特别显著的差异，因此，利用miR-137能够可靠性最高地检测膀胱癌细胞。
[0040]优选将受检者样品中的膀胱癌标记物的表达量与阈值进行比较。将判明不是癌组织的另外组织或其它部位的组织等的miRNA的表达量设定为阈值，通过进行比较能够检测癌组织。受检者样品中的膀胱癌标记物的表达量比阈值低时，可以判定受检者样品为癌组织。
[0041]阈值优选为从正常组织中采取的对照样品中的上述膀胱癌标记物的表达量。在膀胱癌细胞中，由于miR-124、miR-9及miR-137等的表达被抑制，因此，能够通过与正常组织比较表达量的降低来检测膀胱癌细胞。
[0042]阈值优选为从受检者中在不同时间采取的或从受检者的不同组织中采取的对照样品中的上述膀胱癌标记物的表达量。通过与从受检者中在不同时间采取的对照样品进行比较，可以通过与发生癌时或切除癌时的比较来检测膀胱癌细胞。由于可以得到与膀胱癌细胞的表达有关的时间上的数据，因此能够判定癌的产生或治疗成果。通过与从受检者的不同组织中采取的对照样品进行比较，能够通过与没有发生癌的组织的比较来检测膀胱癌细胞。通过在各部位采取样品，能够检测发生癌的组织的部位。
[0043]受检者样品优选为尿样品。尿样品不依赖于手术等，也没有侵袭性，可以安全、简便且迅速地采取多次。尿样品可检测剥离脱落于尿中的尿道上皮细胞，所以，与血液样品或切除采取的样品相比，所含的miRNA的量少，但在本实施方式中，利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法等进行甲基化的检测，因此，可以利用尿样品充分地进行特异度和灵敏度高的检测。
[0044]在通过膀胱癌标记物的甲基化的检测而进行的表达量的检测中，用于膀胱癌细胞的检测方法的引物优选为用于利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行miR-137基因的扩增的引物的序列为序列号I所示的正向引物(GGGTTTAGYGAGTAGTAAGAGTTTTG)及序列号2所示的反向引物(CCCCCTACCRCTAATACTCTCCTC )，用于测序反应的引物的序列优选为序列号3所示的 GGTAITITTGGGTGGATAAT。
[0045]在通过膀胱癌标记物的甲基化的检测而进行的表达量的检测中，用于膀胱癌细胞的检测方法的引物优选为用于利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行miR-124-2基因的扩增的引物的序列为序列号4所示的正向引物(GTTGGGATTGTATAGAAGGATTATTTG)及序列号5所示的反向引物(ACTACRAAAATCCAAAAAAAAATACATAC )，用于测序反应的引物的序列优选为序列号 6 所示的 YGTTTTTATTGTTTTAGTTT。
[0046]在通过膀胱癌标记物的甲基化的检测而进行的表达量的检测中，用于膀胱癌细胞的检测方法的引物优选为用于利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行miR-124-3基因的扩增的引物的序列为序列号7所示的正向引物(AAAAGAGAYGAGTTTTTATTTTTGAGTAT)及序列号8所示的反向引物(TCCTCCRCAACTACCTTCCCCTA )，用于测序反应的引物的序列优选为序列号9 所示的 GAGATTYGTTTTTTTAAT。
[0047]在通过膀胱癌标记物的甲基化的检测而进行的表达量的检测中，用于膀胱癌细胞的检测方法的引物优选为用于利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行miR-9-3基因的扩增的引物的序列为序列号10所示的正向引物(GATTTGAATGGGAGTTTGTGATTGGT)及序列号11所示的反向引物(TCCCRAAACTCACRTAAAACACCC )，用于测序反应的引物的序列优选为序列号12 所示的 TTGGATTGAYGTTATTTT。
[0048]甲基化的检测优选利用甲基化特异性PCR法(MSP法)而进行。利用本方法，可以迅速、简便地且由少量的DNA样品进行作为对象的miRNA基因的甲基化的检测，因此能够可靠地进行膀胱癌的组织的检测。
[0049]在甲基化特异性P`CR法中，用于膀胱癌细胞的检测方法的引物优选用于miR-137基因的甲基化的检测的引物的序列为:作为甲基化等位基因特异性引物为序列号13所示的正向引物(GTAGCGGTAGTAGCGGTAGCGGT)及序列号14所示的反向引物(GCTAATACTCTCCTCGACTACGCG)，作为非甲基化等位基因特异性引物为序列号15所示的正向引物(TGGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGT)及序列号16所示的反向引物(CCACTAATACTCTCCTCAACTACACA)。
[0050]在甲基化特异性PCR法中，用于膀胱癌细胞的检测方法的引物优选用于miR-124-2基因的甲基化的检测的引物的序列为:作为甲基化等位基因特异性引物为序列号17所示的正向引物(AGGGGCGTATTTTGGGGTTTTTGC)及序列号18所示的反向引物(CCCCTACGACGTAATCGACCCG)，作为非甲基化等位基因特异性引物为序列号19所示的正向弓丨物(TTTAGGGGTGTATTTTGGGGTTTTTGT)及序列号20所示的反向引物(CATCCCCTACAACATAATCAACCCA)。
[0051]在甲基化特异性PCR法中，用于膀胱癌细胞的检测方法的引物优选用于miR-124-3基因的甲基化的检测的引物的序列为:作为甲基化等位基因特异性引物为序列号21所示的正向引物(GTTTTAGTGATAATCGGTCGGTGTC)及序列号22所示的反向引物(TCCACGAAATCCACGCTACAAACG )，作为非甲基化等位基因特异性引物为序列号23所示的正向引物(TGTGTTTTAGTGATAATTGGTTGGTGTT )及序列号24所示的反向引物(ATATCCACAAAATCCACACTACAAACA)。
[0052]在甲基化特异性PCR法中，用于膀胱癌细胞的检测方法的引物优选用于miR-9-3基因的甲基化的检测的引物的序列为:作为甲基化等位基因特异性引物为序列号25所示的正向引物(GATTGACGTTATTTTTTCGCGGGGC)及序列号26所示的反向引物(CGAAACTCACGTAAAACACCCGCG)，作为非甲基化等位基因特异性引物为序列号27所示的正向引物(TTGGATTGATGTTATTTTTTTGTGGGGT)及序列号28所示的反向引物(CCCAAAACTCACATAAAACACCCACA)。
[0053]本发明的膀胱癌标记物包含选自miR-124、miR-9及miR-137中的I种以上的miRNA。
`[0054]通过由从受检者采取的受检者样品检测膀胱癌标记物的表达量，将在膀胱癌的组织中与正常组织相比特异性地表达量不同的miRNA作为膀胱癌标记物检测。组织内的miRNA的表达量或该基因的甲基化水平可以用实时PCR或亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法等方法迅速且准确地定量检测表达的有无及其量，因此，能够通过检测选自miR-124、miR-9及miR-137中的I种以上的miRNA的表达量或该基因的甲基化水平而特异性地检测膀胱癌细胞，且即使为恶性度低的膀胱癌组织也能够检测。
[0055]本发明的膀胱癌标记物用于膀胱癌细胞的检测方法，所述方法包含由从受检者采取的受检者样品检测膀胱癌标记物的表达量的步骤。该膀胱癌标记物的表达量的检测用于膀胱癌细胞的检测方法，所述方法包括通过检测编码上述膀胱癌标记物的基因组基因的甲基化来检测上述膀胱癌标记物的表达量的降低的步骤。
[0056]本发明的膀胱癌细胞的检测方法由从深达度pTa或异型度G1/G2的受检者中采取的受检者样品进行检测。对于早期癌的患者，能够通过检测miRNA的基因的甲基化水平而有效地进行早期癌的检测。
[0057]本发明的核酸分子具有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号
6、序列号7、序列号8、序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号15、序列号16、序列号17、序列号18、序列号19、序列号20、序列号21、序列号22、序列号23、序列号24、序列号25、序列号26、序列号27或序列号28的核苷酸序列。这些分子能够用于膀胱癌细胞的检测的方法。
[0058]发明的效果
[0059]根据本发明，将在膀胱癌的组织中与正常组织相比特异性地表达量不同的miRNA作为膀胱癌标记物检测。组织内的miRNA的表达量或该基因的甲基化水平能够用实时PCR或亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法等方法迅速且准确地进行定量的检测，因此，能够通过检测选自miR-124、miR-9及miR-137中的I种以上的miRNA的表达量及该基因的甲基化水平而特异性地检测膀胱癌细胞，且即使为恶性度低的膀胱癌组织也能够检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0060]图1是表不在膀胱;癌细胞株中对编码miRNA的各基因组基因序列利用甲基化特异性PCR法分析甲基化状态的结果的图。
[0061]图2 是表示对图1 的 miRNA 中的 miR-9-1、miR-9-3, mi R-1 Ob、miR-34b 利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法分析甲基化状态的结果的图表。
[0062]图 3 是表示对图1 的 miRNA 中的 miR-124-1、miR-124-2, miR-124-3, miR-137 利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法分析甲基化状态的结果的图表。
[0063]图4 是表示对图1 的 miRNA 中的 miR-200b、miR-203、miR-409、miR-675 利用亚硫
酸氢盐-焦磷酸测序法分析甲基化状态的结果的图表。
[0064]图5是表示对各膀胱癌细胞株分析miR-137的miRNA表达量(a)及miR-137基因的甲基化(b)的结果的图表。
[0065]图6是表示分析癌部组织(T)及认为是正常的组织(DN)中的miR-137的表达的结果的图表。
[0066]图7是表示分析癌部组织(T)及认为是正常的组织(DN)中的miR-137的表达量的结果(a)及分析甲基化的结果(b)的图表。
[0067]图8是表示分析从匪IBC (非浸润性、浅表性)(a)、MIBC (浸润性)(b)病例的癌部组织(T)、认为是正常的组织(DN)及离癌部(T的采取组织)5mm的组织(AN ；AdjacentNormal-appearing bladder tissue)中分别采取的组织中的利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的miR-137的甲基化的结果的图表。
[0068]图9是表示对miR-137基因分析匪IBC (非浸润性、浅表性)、MIBC (浸润性)、该两者的情况的利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的甲基化及分析其ROC曲线的结果的图表。
[0069]图10是表示对miR-124-2基因分析匪IBC (非浸润性、浅表性)、MIBC (浸润性)、该两者的情况的利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的甲基化及分析其ROC曲线的结果的图表。
[0070]图11是表示对miR-124-3基因分析MOBC (非浸润性、浅表性)、MIBC (浸润性)、该两者的情况的利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的甲基化及分析其ROC曲线的结果的图表。
[0071]图12是表示对miR-9-3基因分析匪IBC (非浸润性、浅表性)、MIBC (浸润性)、该两者的情况的利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的甲基化及分析其ROC曲线的结果的图表。
[0072]图13是表示对癌组织摘除手术的术前及癌组织摘除后分析尿检体的miR-137基因的甲基化(a)及其ROC曲线(b)的结果的图表。`
[0073]图14是表示分析癌组织摘除手术的术前及术后(a)、非癌患者的术前及术后(b)的尿检体中的miR-137基因的甲基化的结果的图表。[0074]图15是表示对癌组织摘除手术的术前及癌组织摘除后分析尿检体的miR-124-2基因的甲基化(a)及其ROC曲线(b)的结果的图表。
[0075]图16是表示分析癌组织摘除手术的术前及术后(a)、非癌患者的术前及术后(b)的尿检体中的miR-124-2基因的甲基化的结果的图表。
[0076]图17是表示对癌组织摘除手术的术前及癌组织摘除后分析尿检体的miR-124-3基因的甲基化(a)及其ROC曲线(b)的结果的图表。
[0077]图18是表示分析癌组织摘除手术的术前及术后(a)、非癌患者的术前及术后(b)的尿检体中的miR-124-3基因的甲基化的结果的图表。
[0078]图19是表示对癌组织摘除手术的术前及癌组织摘除后分析尿检体的miR-9-3基因的甲基化(a)及其ROC曲线(b)的结果的图表。
[0079]图20是表示分析癌组织摘除手术的术前及术后(a)、非癌患者的术前及术后(b)的尿检体中的miR-9-3基因的甲基化的结果的图表。
[0080]图21是表示平台检测法的训练集的概略图。
[0081]图22是表示平台检测法的测试集的概略图。
[0082]图23是表示利用树图的检测法的训练集的概略图。
[0083]图24是表示利用树图的检测法的测试集的概略图。
[0084]图25是表示在膀胱癌细胞株中使miR-137强制表达并分析膀胱癌的抑制效果的结果的图表。
[0085]图26是表示miR-137基因及其附近的基因组DNA序列、以及在本实施方式的亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法及甲基化特异性PCR法(MSP)法中使用的引物的序列的图。
[0086]图27是表示miR-124-2基因及其附近的基因组DNA序列、以及在本实施方式的亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法及甲基化特异性PCR法(MSP)法中使用的引物的序列的图。
[0087]图28是表示miR-124-3基因及其附近的基因组DNA序列、以及在本实施方式的亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法及甲基化特异性PCR法(MSP)法中使用的引物的序列的图。
[0088]图29是表示miR-9-3基因及其附近的基因组DNA序列、以及在本实施方式的亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法及甲基化特异性PCR法(MSP)法中使用的引物的序列的图。
[0089]图 30 是表示对 pTa、Gl/G2 的患者分析 miR-137、miR-124-2、miR-124_3 及 miR-9-3基因的甲基化的结果的图。
[0090]图31是表示基于图30的结果利用平台检测法及树图的检测法的图。
【具体实施方式】
[0091]以下，示出实施方式，对本发明详细地进行说明。
[0092](膀胱癌细胞的检测方法)
[0093]本实施方式中的膀胱癌是指尿道上皮癌(移行上皮癌)、鳞状细胞癌或腺癌这种产生于膀胱的癌。
[0094]在本实施方式中，将选自I种以上的miR-124、miR-9及miR-137中的I种以上的miRNA用作膀胱癌标记物。miRNA为具有后述的序列的10个碱基对以上的短链单链RNA，具有5’ -磷酸、3’ -OH的结构，有时在3’末端突出2个碱基。在本实施方式中，指人工化学合成的物质或在生物体内合成的物质中的任一种。[0095]本发明中使用的miRNA的序列信息及编码各miRNA的基因组基因的序列注册于miR BASE (http://microrna.sanger.ac.uk/)。序列和 Accession 号分别如下所述。
[0096]miR-137 (5，-uuauugcuuaagaauacgcguag-3，)(MIMAT0000429)(序列号 29)
[0097]miR-124 (5，_uaaggcacgcggugaaugcc_3，)(MIMAT0000422)(序列号 30)
[0098]miR-9 (5，-ucuuugguuaucuagcuguauga-3，)(MIMAT0000441)(序列号 31)
[0099]miR-137 基因(5，-ggtcctctgactctcttcggtgacgggtattcttgggtggataata cggattacgttgttattgcttaagaatacgcgtagtcgaggagagtaccagcggca-3J ) (M10000454)(序列号 32)
[0100]miR-124-2 基因(5，-atcaagattagaggctctgctctccgtgttcacagcggacct tgatttaatgtcatacaattaaggcacgcggtgaatgccaagagcggagcctacggctgcacttgaa_3，)(M10000444) (j^列号33)
[0101]miR-124-3 基因(5，-tgagggcccctctgcgtgttcacagcggaccttgatttaatgt ctatacaattaaggcacgcggtgaatgccaagagaggcgcctcc-3，)(M10000445)(序列号 34)
[0102]miR-9-3 基因(5，-ggaggcccgtttctctctttggttatctagctgtatgagtgccacagagccgtcataaagctagataaccgaaagtagaaatgattctca-3，)(M10000468)(序列号 35)
[0103]本发明人等发现，在膀胱癌中，上述物质中的miR-137能够作为膀胱癌细胞的明确指标。另外，也可以检测上述miRNA中的多个，比较验证其结果。通过比较验证多个miRNA,可以进行特异度和灵敏度更高的检测。
`[0104]作为本实施方式的膀胱癌标记物的表达量的检测、即上述的miRNA的检测的方法，能够采用检测从作为检测膀胱癌细胞的对象的被检者采取的被检者样品的miRNA的表达量的方法。作为被检者样品，可以采取膀胱癌的组织或含有该组织的生物体样品而进行，可以由来自尿样品、血液样品或利用内窥镜切除采取的样品等进行检测。在本实施方式中，使用利用内窥镜切除采取的样品或从膀胱全摘标本中采取的样品。
[0105]目标膀胱癌标记物的表达量的检测通过比较从作为检测膀胱癌细胞的对象的被检者中采取的受检者样品中的膀胱癌标记物的表达量和阈值而进行。受检者样品中的膀胱癌标记物的表达量与阈值相比减少时，受检者样品的组织可以判定为膀胱癌。就阈值而言，对从正常组织中采取的对照样品进行，比较表达量。该对照样品可以是与怀疑是膀胱癌的受检者不同的正常的受检者的正常组织的样品，也可以是怀疑是膀胱癌的受检者在健康时采取的或从健康的组织中采取的同一受检者的样品。在本实施方式中，将相同的受检者的、从有可能产生癌的组织中充分分离的正常组织设定为对照样品。
[0106]膀胱癌细胞中的上述膀胱癌标记物的表达量的检测优选通过检测编码目标miRNA的基因组序列的甲基化并比较而进行。相对于对照样品，受检者样品的编码目标miRNA的基因组序列的甲基化的度数高时，目标miRNA的表达量降低。因此，编码受检者样品的目标miRNA的基因组序列的甲基化的度数高时，能够判定膀胱癌细胞的存在。通过甲基化的检测，能够不依赖于组织中的miRNA表达量的背景而以高精度进行检测。在甲基化的检测中可以利用各种甲基化检测手段，可以使用亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性PCR(MSP)法、定量MSP法、COBRA (联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析)法、亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法等。这些方法可以单独使用任一种，也可以组合使用2种以上。上述方法中，从可以精密且定量地进行作为对象的miRNA的检测方面考虑，优选使用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法，从可以迅速、简便地且由少量的DNA样品进行甲基化的检测方面考虑，优选使用甲基化特异性PCR法(MSP 法)。
[0107]需要说明的是，MSP法为记载于Methods Mol Med.2005; 113:279-91及铃木拓、丰田实、今井浩三:bisulfite PCR法，新基因工程手册改订第4版(村松正宝.山本雅编)，羊土社，pp99-106,2003中的方法，亚硫酸氢盐测序法为记载于Methods.2002Jun;27
(2):101-7及铃木拓，丰田实，今井浩三:bisulfitePCR法，新基因工程手册改订第4版(村松正宝.山本雅编),羊土社，pp99-106，2003中的方法，亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法为记载于Nat Protoc.2007; 2 (9): 2265-75中的方法，联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法为记载于 Methods Mol Biol.2002;200:71-85 及铃木拓，丰田实，今井浩三:bisulf itePCR 法，新基因工程手册改订第4版(村松正宝.山本雅编)，羊土社，pp99-106,2003中的方法，荧光定量法(Methylight)为记载于Methods.200IDec; 25 (4):456-62等中的方法，或可以适当变更这些方法而使用。需要说明的是，亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法有时一般省略为焦磷酸测序法，该情况的焦磷酸测序法和本说明书中的亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法是指相同的方法。
[0108]基因表达量的检测也可以通过直接检测miRNA的表达量而进行。为了直接检测miRNA的表达量,可以适当使用实时RT-PCR法、northern印迹法等miRNA的检测手段。这些方法可以单独使用任一种，也可以组合使用2种以上。上述方法中，从简易性或灵敏度方面考虑，优选利用实时RT-PCR法的检测。
[0109]膀胱癌细胞的检测也可以使用目标miRNA的表达量的直接检测和编码目标miRNA的基因组序列的甲基化的检测的任一种而进行，也可以并用两者而进行。
[0110]关于miR-137基因、miR-124-2基因、miR-124-3基因、miR-9-3基因，将用于利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的甲基化的检测的引物及用于利用MSP法的甲基化的检测的引物和作为其基础的序列分别示于图26、图27、图28及图29。图中分别示出miR-137基因、miR-124-2基因、miR-124-3基因、miR-9-3基因的`上游的序列(序列号36、38、40、42)、亚硫酸氢盐变换后的序列(下线部表示用于引物的序列)(序列号37、39、41、43)、用于同时扩增甲基化等位基因和非甲基化等位基因时的PCR的正向引物和反向引物、及用于PCT扩增后的测序反应的引物、以及用于利用MSP法的检测的甲基化等位基因特异性正向引物和反向引物、及非甲基化等位基因特异性正向引物和反向引物的组合的一例。
[0111]关于miR-137基因，作为利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的PCR扩增中使用的引物，正向引物使用GGGTTTAGYGAGTAGTA AGAGTTTTG，反向引物使用CCCCCTACCRCTAATACTCTCCTC。作为测序反应中使用的引物，使用 GGTATTTTTGGGTGGATAAT。
[0112]关于miR-124-2基因，作为利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的PCR扩增中使用的引物，正向引物使用GTTGGGATTGTATAGAA GGATTATTTG，反向引物使用ACTACRAAAATCCAAAAAAAAA TACATAC。作为测序反应中使用的引物，使用YGTTTTTATTGTTTTAGTTTo
[0113]关于miR-124-3基因，作为利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的PCR扩增中使用的引物，正向引物使用AAAAGAGAYGAGTTTTT ATTTTTGAGTAT，反向引物使用TCCTCCRCAACTACCTTCCC CTA。作为测序反应中使用的引物，使用 GAGATTYGTTTTTTTAAT。
[0114]关于miR-9-3基因，作为利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的PCR扩增中使用的引物，正向引物使用GATTTGAATGGGAGTTTG TGATTGGT，反向引物使用TCCCRAAACTCACRTAAAACACCC。作为测序反应中使用的引物，使用 TTGGATTGAYGTTATTTT。
[0115]在甲基化特异性PCR法(MSP法)中，使用以下的引物。用于miR-137的检测的引物的序列，作为甲基化等位基因特异性引物，正向引物使用GTAGCGGTAGTAGCGGTAGCGGT，反向引物使用GCTAATACTCTCCTCGACTACGCG，作为非甲基化等位基因特异性引物，正向引物使用 TGGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGT，反向引物使用 CCACTAATACTCTCCTCAACTACACA。
[0116]用于miR-124-2的检测的引物的序列，作为甲基化等位基因特异性引物，正向引物使用 AGGGGCGTATTTTGGGGTTTTTGC，反向引物使用 CCCCTACGACGTAATCGACCCG，作为非甲基化等位基因特异性引物，正向引物使用TTTAGGGGTGTATTTTGGGGTTTT TGT，反向引物使用CATCCCCTACAACATAATCAACCCA。
[0117]用于miR-124-3的检测的引物的序列，作为甲基化等位基因特异性引物，正向引物使用 GTTTTAGTGATAATCGGTCGGTGTC，反向引物使用 TCCACGAAATCCACGCTACAAACG，作为非甲基化等位基因特异性引物，正向引物使用TGTGTTTTAGTGATAATTG GTTGGTGTT，反向引物使用 ATATCCACAAAATCCACACTACAA ACA。
[0118]用于miR-9-3的检测的引物的序列，作为甲基化等位基因特异性引物，正向引物使用 GATTGACGTTATTTTTTCGCGGGGC，反向引物使用 CGAAACTCACGTAAAACACCCGCG，作为非甲基化等位基因特异性引物，正向引物使用TTGGATTGATGTTATTTTTTTGT GGGGT，反向引物使用CCCAAAACTCACATAAAACACCCACA。
[0119]作为本实施方式的变更方式，作为miR-137基因、miR-124-2基因、miR-124-3基因、miR-9-3基因的引物，可以选择选自图26、27、28及29所示的亚硫酸氢盐变换后的序列中的其它序列。
[0120](以尿样品作为受检者样`品的诊断方法)
[0121]在本发明的其它实施方式中，受检者样品为从受检者采取的尿样品。作为对照样品，使用对膀胱癌进行过治疗、例如膀胱的切除手术之后的尿样品。miRNA的表达量的检测通过上述的实施方式同样的甲基化的检测而进行。其它方面与上述实施方式同样。
[0122]对照样品相对于受检者样品甲基化的度数低时，可以判定通过治疗除去了膀胱癌的组织。
[0123]在该实施方式中，由于尿样品对受检者没有侵袭性且痛苦为最小限度，可以非常容易地采取多次，因此优选。尿样品由于检测剥离脱落于尿中的尿道上皮细胞，因此，与血液样品或切除采取的样品相比，所含的miRNA的量少，在本实施方式中，由于进行利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法的甲基化的检测，因此，能够利用尿样品充分地进行特异度和灵敏度高的检测。
[0124](膀胱癌抑制剂)
[0125]本发明的其它实施方式为包含选自miR-124、miR_9及miR-137中的I种以上的miRNA的膀胱癌抑制剂。本发明的发明人等发现，通过对癌组织投与在膀胱癌的癌细胞中表达抑制的这些基因或者使其表达，可以抑制膀胱癌。
[0126]膀胱癌抑制剂，例如作为基因治疗剂，以上述的miRNA为有效成分，在用于基因治疗剂的基剂中配合该有效成分。作为实例，可以添加缓冲液或氨基酸等其它营养剂，做成溶液或进行了粉末化等的注射剂。或者，为了做成液剂或缓释剂等，可以配合于适当需要的基材中。[0127]也可以向细胞中导入上述的miRNA，做成用于使癌细胞表达的药剂。例如，可以做成用于将上述的miRNA包含于脂质体等中并在组织中使核酸分子导入的药剂、用于用微注射法等向细胞中导入核酸分子的方法的药剂、用于通过病毒载体对生物体给药并在细胞内导入上述miRNA的药剂。
[0128]实施例
[0129](癌细胞株中的miRNA表达的分析)
[0130]将膀胱癌细胞株(T24及UM-UC-3)用DNA甲基化酶抑制剂5_aza_2，-deoxycytidine (5-aza-dC)及 HDAC 抑制剂 4-phenylbutyric acid (4-PBA)进行处理。使用TaqMan miRNA Low Density Array System (应用生物系统)分别分析处理后的试样和没有进行处理的对照的表达谱。在处理后的试样中筛选与对照相比表达上升的miRNA。
[0131]其结果，在T24及UM-UC-3的2个细胞株中共同看到在药剂处理后表达上升的146种miRNA。这些miRNA中，在pre_miRNA的上游5kb以内的区域存在CpG岛的为以下的23种(注册于上述的miRBASE)。这些基因由于在抑制甲基化的情况下表达上升，因此，有可能在这些细胞株中通过甲基化而抑制表达。
[0132]hsa-miR-10b, hsa-miR-124，hsa-miR-132，hsa-miR-137，hsa_miR-147b，hsa_miR-148a, hsa-miR-152, hsa_miR-185a, hsa-miR-193a_5p, hsa_miR-200b,hsa-miR-200b ?., hsa-miR-203, hsa-miR-22, hsa-miR-330_5p，hsa-miR-34c_5p,hsa-miR-409-3p, hsa-miR-409_5p，hsa_miR-449b，hsa-miR-545 ?., hsa-miR-636,hsa-miR-639, hsa-miR-675, hsa-miR-9。
[0133]对于这些miRNA，使用膀胱癌细胞株T24及UM-UC-3、HT1197、HT_1376、SW780进行MethyIation-speci fic PCR (MSP)法时，以下的12种miRNA基因看到甲基化。
[0134]miR-34b、miR-9-1、miR-9-3, miR-124-1、miR-124-2, miR-124-3, miR-203、miR-10b、miR-675、miR-200b、miR-137、miR-409。关于这些 MSP 法的结果示于图1。图中，U表示没有进行甲基化的DNA (Unmethylated),M表示进行了甲基化的DNA (Methylated)。
[0135]关于对这些基因利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进一步分析甲基化状态的结果，示于图2、图3、图4。图中的纵轴的甲基化(％) (Methylation化％)表示甲基化的程度。原发膀胱癌组织(Primary Bladder Cancer Tissue)表示对通过手术摘除的来自膀胱癌组织的DNA进行分析的结果,膀胱癌细胞株(Bladder Cancer Cell Lines)表示对来自膀胱癌组织的细胞株(T24，UM-UC3，HT1197，HT-1376，SW780)的DNA进行分析的结果，SV-HUC-1表示对来自正常尿道上皮细胞株的DNA进行分析的结果，正常尿道上皮(Normal Urothelium)表示对来自正常尿道上皮的DNA (由BioChain公司购入)进行分析的结果。
[0136]由这些结果发现了在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株中进行甲基化的12种miRNA。
[0137](膀胱癌细胞株中的miR-137的表达的分析)
[0138]对于上述miRNA中的miR-137而言，关于在膀胱癌细胞株T24、UM_UC_3、HTl 197、HT-1376、SW780、正常尿道上皮细胞株SV-HUC-1中的表达量，图5 Ca)表示使用TaqManRT-PCR (Applied Biosystems公司)进行实时RT-PCR分析的结果。该结果显示:miR-137在HTl 197、SW780中表达低。
[0139]图5 (b)表示对这些膀胱癌细胞株利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法分析miR-137基因的甲基化的结果。该结果显示:miR-137基因在UM-UC-3、HT1197、HT-1376、SW780中进行甲基化。图5 (a)、(b)的结果显示:在膀胱癌细胞株中miR-137的表达降低，该降低有可能是甲基化引起的。
[0140](各癌部位的miRNA的表达的分析)
[0141]从癌部组织(T)以及在癌摘除时获得的从癌中充分分离的认为是正常的组织(DN ；Distant Normal-appearing tissue)中提取 RNA,图 6 表不实时 RT-PCR 分析 miR-137的表达量的结果。在该结果中，在癌部(T)看到表达量低的倾向。没有看到能够以表达量的水平进行比较的程度的差异，认为这是由于T中也混入了正常组织，因此检测表达量降低的基因是困难的。
[0142]下面，图7 Ca)表示采用图6中使用的一部分样品(091218-2、100204-1、100217B-1)的T、DN，对miR-137用实时RT-PCR分析表达量的结果，图7 (b)表示利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法分析miR-137基因的甲基化的结果。由该结果看到:通过miRNA的表达量和其编码的基因组基因中的甲基化之间存在逆相关，即基因组上的基因CpG岛的甲基化，miRNA的表达量降低。由这些结果显示:可以通过分析miR-137基因的甲基化来检测表达量的降低，即检测是否为癌细胞。
[0143]图8 (NMIBC (a)、MIBC (b))表示对于从NMIBC (非浸润性、浅表性)及MIBC(浸润性)的癌组织中分别采取的T、离癌部(T的采取组织)5mm的组织(AN ；AdjacentNormal-appearing bladder tissue)、DN,利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法分析miR-137基因的甲基化的结果。其中，来自同一个体的结果用线连结。
[0144]另外，图9表示miR-137基因的匪IBC及MIBC、该两者的情况下的利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法分析甲基化以及对检测的灵敏度(Sensitivity)和特异度(Specificity)分析 ROC (receiver operating characteristic)曲线的结果。也表不了对miR-124-2基因(图10)、miR-124-3基因(图ll)、miR-9_3基因(图12)进行同样的分析的结果。关于miR-9-3基因以外的miRNA，在匪IBC及MIBC中均在T和AN间及T和DN间看到显著差异，显示以T、AN、DN的`顺序甲基化降低。在miR-9-3基因中，在MIBC的T和AN间没有看到显著差异，但看到甲基化降低的倾向。此外，图中没有显示，但关于miR-9-l基因也进行了甲基化的分析，但甲基化的频率极低。由这些结果来看，关于这些miRNA，与非癌部相比，癌部进行了高甲基化，认为在利用甲基化的倾向确定癌部位方面起作用。另外判明:即使为编码相同的miRNA的基因组基因序列，也在甲基化的频率方面存在差异。
[0145](尿检体中的miR-137基因的甲基化状态的分析)
[0146]对受检者的癌组织摘除手术的术前(Pre-OP)及癌组织摘除后(Post-OP)的尿检体利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行miR-137基因的甲基化的分析。图13表示其结果(a)和ROC曲线(b)。需要说明的是，关于Post-OP，在开腹手术的情况下，由于全部摘除膀胱，因此，仅得到内窥镜切除例的尿检体，因此，N数变少。在术后看到miR-137基因的甲基化减少的倾向。
[0147]对图13 Ca)的结果制作ROC曲线，以灵敏度(Sensitivity)和特异度(Specificity)的两者为最佳的方式调整截止值，在截止值5.2%时，可以进行灵敏度=78%、特异度=78%、PPV = 0.89、NPV = 0.60的灵敏度下的检测。
[0148]图14表示癌组织的摘除手术的术前及术后(a)、非癌的受检者的摘除手术(在摘除后判明为不是癌的实例)的术前及术后(b)的利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行miR-137基因的甲基化的分析的结果。其中，来自同一个体的结果用线连结。通过癌组织的摘除，miR-137基因的甲基化减少，非癌的情况下没有变化，与图13 (a)所示的尿检体中的结果相关。由这些结果显示:认为尿检体中的miR-137基因的甲基化作为膀胱癌细胞的诊断标记物是有用的，尿中的甲基化的分析可以应用于癌组织有无的检查。
[0149](尿检体中的miR-124-2基因的甲基化状态的分析)
[0150]对受检者的癌组织摘除手术的术前(Pre-OP)及癌组织摘除后(Post-OP)的尿检体利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行miR-124-2基因的甲基化的分析。图15表示其结果(a)和ROC曲线(b)。在术后看到miR-124-2基因的甲基化减少的倾向。
[0151]对图15 (a)的结果制作ROC曲线，以灵敏度和特异度的两者为最佳的方式调整截止值，在截止值为5.2%时，可以进行灵敏度=70%、特异度=89%、PPV = 0.94、NPV = 0.55的灵敏度下的检测。
[0152]图16表示癌组织的摘除手术的术前及术后(a)、非癌的受检者的摘除手术的术前及术后(b)的结果。其中，来自同一个体的结果用线连结。通过癌组织的摘除，miR-124-2基因的甲基化减少，非癌的情况下没有变化，与图15 (a)所示的尿检体中的结果相关。由这些结果显示:认为尿检体的中的miR-124-2基因的甲基化作为膀胱癌的诊断标记物是有用的，尿中的甲基化的分析可以应用于癌组织有无的检查。
[0153](尿检体中的miR-124-3基因的甲基化状态的分析)
[0154]对受检者的癌组织摘除手术的术前(Pre-OP)及癌组织摘除后(Post-OP)的尿检体利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行miR-124-3基因的甲基化的分析。图17表示结果(a)和ROC曲线(b)。在术后看到miR-124-3基因的甲基化减少的倾向。
`[0155]对图17 (a)的结果制作ROC曲线，以灵敏度和特异度的两者为最佳的方式调整截止值，在截止值为12%时，可以进行灵敏度=65%、特异度=97%、PPV = 0.98、NPV = 0.54的灵敏度下的检测。
[0156]图18表示癌组织的摘除手术的术前及术后(a)、非癌的受检者的摘除手术的术前及术后(b)的结果。其中，来自同一个体的结果用线连结。通过癌组织的摘除，miR-124-3基因的甲基化减少，非癌的情况下没有变化，与图17 (a)所示的尿检体中的结果相关。由这些结果显示，认为尿检体的中的miR-124-3基因的甲基化作为膀胱癌的诊断标记物是有用的，尿中的甲基化的分析可以应用于癌组织有无的检查。
[0157](尿检体中的miR-9-3基因的甲基化状态的分析)
[0158]对受检者的癌组织摘除手术的术前(Pre-OP)及癌组织摘除后(Post-OP)的尿检体利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行miR-9-3基因的甲基化的分析。图19表示其结果(a)和ROC曲线(b)。在术后看到miR-9-3基因的甲基化减少的倾向。
[0159]对图19 (a)的结果制作ROC曲线，以灵敏度和特异度的两者为最佳的方式调整截止值，在截止值为7.2%时，可以进行灵敏度=69%、特异度=86%、PPV = 0.92、NPV = 0.54的灵敏度下的检测。
[0160]图20表示癌组织的摘除手术的术前及术后(a)、非癌的受检者的摘除手术的术前及术后(b)的结果。其中，来自同一个体的结果用线连结。通过癌组织的摘除，miR-9-3基因的甲基化减少，非癌的情况下没有变化，与图19(a)所示的尿检体中的结果相关。由这些结果显示:认为尿检体的中的miR-9-3基因的甲基化作为膀胱癌的诊断标记物是有用的，尿中的甲基化的分析可以应用于癌组织有无的检查。
[0161]另外，关于miR-137基因、miR-124-2基因、miR-124-3基因及miR-9-3基因这4种基因，组合各自的甲基化检测结果，对使用尿检体的膀胱癌诊断的方法进行研究及分析。
[0162]首先，关于平台检测法，示于图21及图22。在本方法中，将上述的灵敏度(sensitivity、Sens)和特异度(specificity、Spec)的两者为最佳的数值设定为截止值,分别对miR-137基因设定为5.2%,对miR-124-2基因设定为5.2%,对miR-124-3基因设定为12%，对miR-9-3基因设定为7.2%，在满足该数值的情况下，对各基因每I点进行合计(合计“是”的数量)。将其设定为miR分值，在各点数中制作ROC曲线。其结果，在0-1点间灵敏度为94%，特异度为64%。在1-2点间，灵敏度为81%，特异度为89%。在2_3点间，灵敏度为65%，特异度为97%。另外，将其设定为图21所示的训练集(Training Set)，重新使用其它尿检体，作为图22所示的测试集(Test Set)再次进行研究。其结果，在0_1点间灵敏度为94%，特异度为64%。在1-2点间，灵敏度为82%，特异度为91%。在2-3点间，灵敏度为71%，特异度为91%。由该结果确认了该检测法的再现性。
[0163]下面，关于利用树图的检测法，示于图23及图24。在本方法中，各4个基因中，用在特异度为100%时灵敏度最高的miR-137基因的甲基化为9.8%的截止值区分(灵敏度为57%)。满足该条件的情况下，分类为类型3。不满足的情况下，进一步用miR-9-3基因的甲基化为6.7%的截止值区分。该值是在miR-137基因的甲基化为9.8%以下的情况下，用miR-124-2基因、miR-124-3基因及miR-9-3基因的每个制作ROC曲线时，灵敏度、特异度最高的值，分别为87%及75%。在满足该条件的情况下，分类为类型2，在不满足该条件的情况下，分类为类型I。另外，将其设定为图23所示的训练集，重新使用其它的尿检体作为图24所示的测试集再次进行研究。其结果，就类型3而言，特异度为100%，灵敏度为68%，在类型I和2的分类中，特异度为55%，灵敏度为91%。由该结果判定:就该检测法而言，确认了再现性。需要说明的是，类型3的特异度为100%，在分类为该类型的情况下，相当高的概率为癌。在分类为类型I的情况下，为癌的可能性低，在分类为类型2的情况下，判定很有可能为癌。
[0164]由上述平台法及树图法显示组合有miR-137基因、miR-124-2基因、miR-124-3基因及miR-9-3基因的癌的检测方法的有用性。需要说明的是，上述的数值为一例，筛选或术后随访等各情况下，可以根据目的进行认为是需要的灵敏度、表示特异度的截止值的变更等，分开使用。
[0165]表1表示由上述的实施例(图13、图15、图17及图19)得到的尿检体中的灵敏度和特异度的两者为最佳的各基因的截止值及使用该截止值时的灵敏度和特异度。
[0166][表 I]
【权利要求】
1.一种膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 包括由从受检者采取的受检者样品检测膀胱癌标记物的表达量的步骤，所述膀胱癌标记物包含选自miR-124、miR-9和miR-137中的I种以上的miRNA。
2.如权利要求1所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 所述膀胱癌标记物的表达量的检测是通过检测编码所述膀胱癌标记物的基因组基因的甲基化来检测所述膀胱癌标记物的表达量的降低。
3.如权利要求2所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 所述甲基化的检测利用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序法进行。
4.如权利要求1~3中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于:所述膀胱癌标记物至少包含miR-137。
5.如权利要求1~4中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于:将所述受检者样品中的所述膀胱癌标记物的表达量与阈值进行比较。
6.如权利要求1~5中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于:所述阈值为从正常组织中采取的对照样品中的所述膀胱癌标记物的表达量。
7.如权利要求1~5中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于:所述阈值为从受检者中在不同时间采取的或者从受检者的不同组织中采取的对照样品中的所述膀胱癌标记物的表达量。
8.如权利要求1~7中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于:所述受检者样品为尿样品。
9.一种引物，用于权利要求1~8中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述膀胱癌标记物的表达量的检测中，用于miR-137基因的扩增的引物的序列为序列号I所示的正向引物(GGGTTTAGYGAGTAGTAAGAGTTTTG )及序列号2所示的反向引物(CCCCCTACCRCTAATACTCTCCTC)。
10.一种引物，用于权利要求1~9中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述膀胱癌标记物的表达量的检测中，用于miR-137的测序反应的引物的序列为序列号 3 所示的 GGTAITITTGGGTGGATAAT。
11.一种引物，用于权利要求1~10中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述膀胱癌标记物的表达量的检测中，用于miR-124-2的扩增的引物的序列为序列号4所示的正向引物(GTTGGGATTGTATAGAAGGATTATTTG)及序列号5所示的反向引物(ACTACRAAAATCCAAAAAAAAATACATAC)。
12.一种引物，用于权利要求1~11中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述膀胱癌标记物的表达量的检测中，用于miR-124-2的测序反应的引物的序列为序列号 6 所示的 YGTTTTTATTGTTTTAGTTT。
13.一种引物，用于权利要求1~12中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于:在所述膀胱癌标记物的表达量的检测中，用于miR-124-3的扩增的引物的序列为序列号7所示的正向引物(AAAAGAGAYGAGTTTTTATTTTTGAGTAT )及序列号8所示的反向引物(TCCTCCRCAACTACCTTCCCCTA)。
14.一种引物，用于权利要求1~13中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述膀胱癌标记物的表达量的检测中，用于miR-124-3的测序反应的引物的序列为序列号 9 所示的 GAGATTYGTTTTTTTAAT。
15.一种引物，用于权利要求1~14中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述膀胱癌标记物的表达量的检测中，用于m i R-9 -3的扩增的引物的序列为序列号10所示的正向引物(GATTTGAATGGGAGTTTGTGATTGGT )及序列号11所示的反向引物(TCCCRAAACTCACRTAAAACACCC)。
16.一种引物，用于权利要求1~15中任一项所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述膀胱癌标记物的表达量的检测中，用于miR-9-3的测序反应的引物的序列为序列号 12 所示的 TTGGATTGAYGTTATTTT。
17.如权利要求2所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于:` 所述甲基化的检测利用甲基化特异性PCR法进行。
18.一种引物，用于权利要求17所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述甲基化特异性PCR法中，用于miR-137的检测的引物的序列为，作为甲基化等位基因特异性引物为序列号13所示的正向引物(GTAGCGGTAGTAGCGGTAGCGGT )及序列号14所示的反向引物(GCTAATACTCTCCTCGACTACGCG )，作为非甲基化等位基因特异性引物为序列号15所示的正向引物(TGGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGT )及序列号16所示的反向引物(CCACTAATACTCTCCTCAACTACACA)。
19.一种引物，用于权利要求17所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述甲基化特异性PCR法中，用于miR-124-2的检测的引物的序列为，作为甲基化等位基因特异性引物为序列号17所示的正向引物(AGGGGCGTATTTTGGGGTTTTTGC )及序列号18所示的反向引物(CCCCTACGACGTAATCGACCCG)，作为非甲基化等位基因特异性引物为序列号19所示的正向引物(TTTAGGGGTGTATTTTGGGGTTTTTGT)及序列号20所示的反向引物(CATCCCCTACAACATAATCAACCCA)。
20.一种引物，用于权利要求17所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述甲基化特异性PCR法中，用于miR-124-3的检测的引物的序列为，作为甲基化等位基因特异性引物为序列号21所示的正向引物(GTTTTAGTGATAATCGGTCGGTGTC)及序列号2 2所示的反向引物(TCCACGAAATCCACGCTACAAACG )，作为非甲基化等位基因特异性引物为序列号23所示的正向引物(TGTGTTTTAGTGATAATTGGTTGGTGTT)及序列号24所示的反向引物(ATATCCACAAAATCCACACTACAAACA)。
21.一种引物，用于权利要求17所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 在所述甲基化特异性PCR法中，用于miR-9-3的检测的引物的序列为，作为甲基化等位基因特异性引物为序列号25所示的正向引物(GATTGACGTTATTTTTTCGCGGGGC)及序列号26所示的反向引物(CGAAACTCACGTAAAACACCCGCG )，作为非甲基化等位基因特异性引物为序列号27所示的正向引物(TTGGATTGATGTTATTTTTTTGTGGGGT)及序列号28所示的反向引物(CCCAAAACTCACATAAAACACCCACA)。
22.—种膀胱癌标记物，其特征在于: 其包含选自miR-124、miR-9和miR-137中的I种以上的miRNA。
23.如权利要求22所述的膀胱癌标记物，其用于膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于，所述膀胱癌细胞的检测方法包括: 由从受检者采取的受检者样品检测所述膀胱癌标记物的表达量的步骤。
24.如权利要求23所述的膀胱癌标记物，其用于膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于，所述膀胱癌细胞的检测方法包括: 所述膀胱癌标记物的表达量的检测通过检测编码所述膀胱癌标记物的基因组基因的甲基化来检测所述膀胱癌标记物的表达量的降低的步骤。
25.如权利要求2所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于: 由从深达度PTa或异型度G1/G2的受检者中采取的受检者样品进行检测。
26.—种核酸分子,其特征在于: 其具有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、序列号8、序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号15、序列号16、序列号17、序列号18、序列号19、序列号20、序列号21、序列号22、序列号23、序列号24、序列号25、序列号26、序列号27或序列 号28的核苷酸序列。
【文档编号】C12Q1/68GK103857796SQ201280044395
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年3月14日 优先权日:2011年9月16日
【发明者】清水崇, 铃木拓, 丰田实, 塚本泰司 申请人:Lsip基金运营联合公司