抑制细胞生长的方法、对nek10变异基因具有rna干扰效应的核酸分子、以及抗癌剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于抑制细胞生长的方法、一种可用于作为抗癌剂的核酸分子和一种用于新的抗癌剂的筛选方法。在本发明中，对NEK10变异基因表达和NEK10变异蛋白活性的抑制效应是通过使用对NEK10变异基因具有RNA干扰效应的核酸分子转染细胞而获得的。本发明还提供了一种抗癌剂的筛选方法，该抗癌剂具有这种抑制效应作为标记。
【专利说明】抑制细胞生长的方法、对NEK10变异基因具有RNA干扰效应的核酸分子、以及抗癌剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于抑制细胞生长的方法、一种对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的核酸分子、一种用于抑制NEKlO变异基因表达的组合物、一种抗癌剂和一种用于筛选抗癌剂的方法，所述组合物包含用于在细胞中表达所述核酸分子的表达载体以及所述核酸分子，所述抗癌剂具有所述核酸分子作为其活性成分。
【背景技术】
[0002]在现代日本，癌症是死亡的首要原因，每年有超过30，000人死于癌症。尽管在癌症的检测和治疗上已经取得了进展，但是与癌症相关的死亡率居高不下。尽管分子靶向抗癌剂(如Gl ivec?和Herc印tin?)最近在癌症化疗使用中引起了关注，但是由于已经证明它们在患者体内的疗效是有限的，所以期望开发出新的分子靶向抗癌剂。
[0003]开始于1970年代的第一部分(first part),在构巢曲霉(Aspergillusnidulans)中发现了 NIMA激酶,并且在裂殖酵母(fission yeast)中发现了 Finl形式的NIMA激酶的同源物。NIMA激酶属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，并且已经表明在细胞周期的M期发挥了重要的作用。也就是说，NIMA激酶明确地被确定为在进入M期、染色体凝集的控制、纺锤体的形成和胞质分裂中发挥了核心作用的分子(参见，例如，非专利文献I )。
[0004]人类NIMA激酶的同源物由NEKl~NEKll形式的NIMA-相关激酶(NEK)组成，并且这些激酶构成了 NEK家族。到目前为止，所述NEK家族已知由细胞周期和信号转导途径中的重要分子组成。例如，已经报道了 NEK家族成员的NEK2、NEK6、NEK7和NEK9以相同于NIMA激酶和Finl的方式参与了进入M期、染色体凝集的控制、纺锤体的形成和胞质分裂(参见，例如，非专利文献2)。`
[0005]已经报道，NEKlO在控制G2/M期检查点(checkpoint)响应UV辐射中发挥了重要作用(参见，例如，非专利文献3)。已经报道，存在于NEKlO基因中的SNP参与了乳腺癌的发病(参见，例如，非专利文献4和5)。然而，关于NEKlO是否参与了细胞生长(且特别是癌细胞的生长)是不清楚的。此外，推定为人类NEKlO变异体(variant)的分子被登记在NCBI数据库中(登录号:AK098832.1，被称为人类NEKlO变异体)。尽管人类NEKlO变异体由于具有类似于NEK家族其它分子的激酶节段，从而也存在参与了细胞周期控制的可能性，但是它在体内具有何种类型的功能却是未知的。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]非专利文献1:M.J.0 ’ Connell，et al.，Trends in CellBiology, 2003，Vol.13，pp.221-228
[0009]非专利文献2:L.0，Regan, et al.，Cell Division, 2007，Vol.2，pp.25-36
[0010]非专利文献3:L.S.Moniz，et al., Molecular and CellularBiology, 2011，Vol.31，pp.30-42[0011 ]非专利文献 4:S.Ahmed, et al., Nature Genetics, 2009, Vol.41, pp.585-590
[0012]非专利文献5:Α.C.Antoniou, et al., Cancer Research, 2010, Vol.70, pp.9742-9754
【发明内容】
[0013]本发明所解决的问题
[0014]本发明的一个目的是提供一种用于抑制细胞生长的方法、一种可用于作为抗癌剂的核酸分子和一种筛选新的抗癌剂的方法。
[0015]用于解决所述问题的手段 [0016]本发明的发明人认为，既然在小鼠中存在与人类NEKlO变异体具有同源性的分子并且NEKlO变异体是跨物种保守的，那么NEKlO变异体在细胞生长以及在细胞周期的控制中可能是重要的，由于NEKlO变异体的生物学功能是未知的，所以对其进行了广泛的研究。结果，本发明的发明人发现，当细胞中NEKlO变异体的表达被抑制时，细胞生长被抑制，并且对NEKlO变异mRNA (NEKlOsiRNA)具有RNA干扰效应的核酸对细胞(特别是对癌细胞)具有细胞生长抑制作用，从而导致完成了本发明。
[0017]也就是说，本发明采用以下所示的构成。
[0018](I) 一种用于抑制细胞生长的方法，其包含:
[0019]表达降低步骤,其用于降低NEKlO变异基因(variant gene)在细胞中的表达,或
[0020]活性降低步骤,其用于降低NEKlO变异蛋白(variant protein)在细胞中的活性。
[0021](2)上述⑴中描述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述表达降低步骤是用于使用选自由以下所构成的组中的至少一种类型转染细胞的步骤:通过RNA干扰抑制NEK10变异基因的表达的核酸分子、所述核酸分子的前体、以及能够表达所述核酸分子或所述前体的表达载体。
[0022](3)上述(2)中描述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述核酸分子是具有靶向NEK10变异基因的mRNA中的碱基序列的RNA干扰效应的siRNA，所述碱基序列由SEQ IDNO: 2或SEQ ID NO:4表示，以及
[0023]所述前体是具有靶向NEK10变异基因的mRNA中的碱基序列的RNA干扰效应的shRNA，所述碱基序列由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4表示。
[0024](4)上述(2)或(3)中描述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述核酸分子选自由下列所构成的组:
[0025](a)由正义 RNA (sense RNA)和反义 RNA (antisense RNA)的组合构成的 siRNA,该正义RNA由SEQ ID NO:2表示的碱基序列构成，并且该反义RNA由SEQ ID NO:3表示的碱基序列构成，
[0026](b)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA由SEQ ID NO: 4表示的碱基序列构成，且该反义RNA由SEQ ID NO: 5表示的碱基序列构成，
[0027](c)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列(contiguous base sequence),并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEK10变异基因具有RNA干扰效应，[0028](d)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO:4表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，
[0029](e)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失的碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，
[0030](f)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失的碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，和
[0031](g)其中(a)~(f)任一项中所描述的siRNA中的一个或多个碱基被修饰的siRNA,并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应。
[0032](5)上述(2)~(4)任一项中描述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述前体在细胞中产生以下任一种:
[0033](a)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA由SEQ ID NO: 2表示的碱基序列构成， 并且该反义RNA由SEQ ID NO:3表示的碱基序列构成，
[0034](b)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA由SEQ ID NO: 4表示的碱基序列构成，且该反义RNA由SEQ ID NO:5表示的碱基序列构成，
[0035](c)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，
[0036](d)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO:4表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，
[0037](e)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失的碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，
[0038](f)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失的碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，或
[0039](g)其中(a)~(f)任一项中所描述的siRNA中的一个或多个碱基被修饰的siRNA,并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应。
[0040](6)上述⑵中所述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述前体是:
[0041](P) shRNA，其含有:
[0042]由SEQ ID NO: 2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在所述碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列，和[0043]由SEQ ID NO: 3表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在所述碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列，
[0044]或
[0045](q) shRNA，其含有
[0046]由SEQ ID NO:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在该碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列，和
[0047]由SEQ ID NO: 5表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在该碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列；并且，
[0048]对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的siRNA是在细胞中由(p)的shRNA或(q)的shRNA产生的。
[0049](7)上述⑴~(6)任一项中所描述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述细胞是癌细胞。
[0050](8) 一种核酸分子，其为:
[0051](a)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA由SEQ ID NO: 2表示的碱基序列构成，并且该反义RNA由SEQ ID NO:3表示的碱基序列构成，
[0052](b)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA由SEQ ID NO: 4表示的碱基序列构成，且该反义RNA由SEQ ID NO:5表示的碱基序列构成，
[0053](c)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siR NA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，
[0054](d)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO:4表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，
[0055](e)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失的碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，
[0056](f)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有由SEQ ID NO:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失的碱基序列，并且该反义RNA含有与该正义RNA互补的碱基序列；并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，或
[0057](g)其中(a)~(f)任一项中所描述的siRNA中的一个或多个碱基被修饰的siRNA,并且该siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应。
[0058](9) 一种核酸分子，其为:
[0059](P) shRNA，其含有:
[0060]由SEQ ID N0:2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在该碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列，和
[0061]由SEQ ID N0:3表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在该碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列，[0062]或
[0063](q) shRNA，其含有
[0064]由SEQ ID N0:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在该碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列，和
[0065]由SEQ ID NO: 5表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在该碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列；
[0066]并且，
[0067]其为用于在细胞中产生对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的siRNA的前体。
[0068](10) 一种含有上述⑶或(9)所描述的核酸的表达载体,其能够表达所述核酸。
[0069](11) 一种用于抑制NEKlO变异基因的表达的组合物，其包含选自由下列所构成的组中的一种或多种类型:
[0070]上述(8)中所描述的核酸分子，
[0071]上述(9)中所描述的核酸分子，和
[0072]上述(10)中所描述的表达载体。
[0073](12) 一种抗癌 剂，其含有选自由下列所构成的组中的一种或多种类型作为其活性成分:
[0074]上述(8)中所描述的核酸分子，
[0075]上述(9)中所描述的核酸分子，和
[0076]上述(10)中所描述的表达载体。
[0077](13) 一种用于筛选抗癌剂的方法，其使用对NEKlO变异基因的表达的抑制效应或对NEKlO变异蛋白的活性的抑制效应作为指标(indicator)。
[0078](14)上述(13)中所描述的用于筛选抗癌剂的方法，包括:
[0079]分别在存在和不存在候选物质的情况下培养NEKlO变异体表达细胞以获得对NEKlO变异基因表达的抑制效应或对NEKlO变异蛋白活性的抑制效应的步骤，和
[0080]测量NEKlO变异mRNA (variant mRNA)在细胞中的表达水平或NEKlO变异蛋白的活性量、并且将在存在和不存在候选物质下的所述表达水平或活性量进行比较的步骤。
[0081]本发明的效果
[0082]根据本发明的用于抑制细胞生长的方法，通过作用于降低NEKlO变异基因活性的新途径，从而能够抑制细胞生长。此外，本发明的核酸分子是对NEKlO变异mRNA具有RNA干扰效应的物质，并且其优选地在本发明的用于抑制细胞生长的方法中使用。也就是说，本发明的用于抑制细胞生长的方法以及核酸分子在癌症治疗中是非常有用的，并且甚至预期可以在使用常规的生长抑制方法不能获得抗肿瘤效果的癌症患者中表现出抗肿瘤效果。
[0083]另外，根据本发明的用于筛选抗癌剂的方法，可以获得抗癌剂的新候选化合物。
【专利附图】
【附图说明】
[0084]图1是示出了实施例1中各siRNA治疗组的相对NEKlO变异mRNA表达水平的图表，其以对照siRNA治疗期间的NEKlO变异mRNA表达水平的值为100而作为基准。
[0085]图2是示出了实施例1中各siRNA治疗组的细胞生长速率的图表，其以对照siRNA治疗期间的细胞生长的值为100而作为基准。【具体实施方式】
[0086]〈用于抑制细胞生长的方法〉
[0087]本发明的用于抑制细胞生长的方法的特征在于，包含用于降低NEKlO变异基因在细胞中的表达的表达降低步骤和/或用于降低NEKlO变异蛋白(由NEKlO变异基因编码的蛋白质)在细胞中的活性的活性降低步骤。可以通过抑制细胞中的NEKlO变异蛋白的功能来抑制细胞生长。这被认为是因为NEKlO变异蛋白在细胞中参与了细胞生长而发生的现象。对用于降低NEKlO变异蛋白的表达或降低NEKlO变异蛋白的活性的方法没有特别的限制，并且可以使用用于降低细胞中的特定基因的表达或蛋白质的活性的任何已知的技术。
[0088]用于降低NEKlO变异蛋白的活性的方法的实例包括使用结合NEKlO变异蛋白的物质(例如NEKlO变异蛋白的抗体)转染细胞，以及通过使该物质与细胞内的NEKlO变异蛋白结合来抑制NEKlO变异蛋白与其它生物分子的相互作用。对用于以结合NEKlO变异蛋白的物质转染细胞的方法没有特别的限制，并且可以直接通过注射等来使用所述物质以转染细胞，或者可以使所述物质接触细胞表面并通过胞吞作用(endocytosis)等来转染细胞。此外，基于NEKlO变异蛋白的结构，预测NEKlO变异蛋白以与NEKlO蛋白质相同的方式具有激酶活性。因此，NEKlO变异蛋白的活性可以通过在细胞中表达为显性阴性形式而抑制，在所述显性阴性形式中，NEKlO变异蛋白的激酶活性位点已被缺失或替换。
[0089]另一方面，用于降低NEKlO变异基因的表达的方法的实例包括通过RNA干扰敲除(knock down)NEK10变异基因。更具体地说，使用诱导靶向NEKlO变异基因的mRNA (NEK10变异mRNA)的RNA干扰并导致细胞内的NEKlO变异mRNA降解的核酸分子转染细胞，所述核酸分子如反义核酸、核酶核酸或双链RNA (dsRNA)。
[0090]一般来说，RNA干扰是指通过向细胞中施用由dsRNA构成的小干扰RNA (siRNA)而抑制靶基因的表达的现象，该dsRNA由正义siRNA和反义siRNA形成，该正义siRNA由所述靶基因的mRNA序列的部分同源序列构成且所述反义siRNA由与其互补的序列构成，从而促使所述细胞中的siRNA分离成正义siRNA和反义siRNA，并且使得靶基因mRNA和反义siRNA形成双链，然后通过Dicer酶降解所形成的dsRNA。除了使用siRNA转染细胞之外，还可以以与siRNA相同的方式使用RNA干扰来抑制靶基因的表达，其通过使用作为siRNA前体的相对长链的dsRNA或发夹shRNA (小发夹RNA)转染细胞、或通过表达siRNA或其前体的载体转染细胞。另外，用于在体内通过siRNA来抑制靶基因的表达的方法也是已知的(P.Anton, et al., Nature, 2002, Vol.418, pp.38-39; L.David, et al., Nat.Genet., 2002, Vol.32, pp.107-108)。
[0091][对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的核酸分子]
[0092]在本发明中，优选地通过使用对NEK10变异基因具有RNA干扰效应的核酸分子(也称为“RNAi核酸分子”)转染细胞来降低NEK10变异基因的表达。只要RNAi干扰核酸分子对NEK10变异mRNA具有RN A干扰效应，对其就没有特别限制，并且优选siRNA。
[0093]在本发明中适合用于RNAi核酸分子的siRNA可以是用于NEK10变异mRNA任何区域的siRNA，只要其对所述区域具有RNA干扰效应。对NEK10变异mRNA的颗粒(particle)碱基序列具有RNA干扰效应的siRNA可以由本领域普通技术人员通过基于NEK10变异mRNA的碱基序列信息进行适当的设计来制备。例如，人类NEK10变异mRNA的cDNA的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。虽然在本发明中使用的siRNA优选具有完全与NEKlO变异mRNA中的靶碱基序列互补的碱基序列，但是其可以含有一个或多个错配，只要其具有RNA干扰效应即可。
[0094]只要本发明中使用的siRNA对NEKlO变异mRNA表现出RNA干扰效应，对其碱基对的长度就没有特别限制。其一个实例siRNA中的正义RNA和反义RNA由15~30个碱基对组成，且优选21~23个碱基对。
[0095]另外，本发明中使用的siRNA可以具有一个或多个经修饰的碱基，只要其具有RNA干扰效应即可。这些修饰的实例包括甲基化、肌苷化(inosinylation)、dU形成、突光基团修饰和磷酸化。所述经修饰的碱基可以存在于siRNA的正义RNA中、反义RNA中或两者中。
[0096]本发明中使用的siRNA的末端结构可以是钝端(blunt end)或突出端(overhanging end),只要其允许通过RNA干扰效应来调节NEKlO变异基因的表达即可。突出端的结构不仅可以包括其中3’-末端突出的结构，还可以包括其中5’-末端表现出前述RNA干扰效应的突出的结构。此外，虽然在先前报道的对其它基因表现出RNA干扰效应的众多siRNA中突出碱基的数目为2~3个，但是本发明中使用的siRNA中的碱基数目仅需要能够诱导RNA干扰效应即可，并且例如，突出碱基的数目可以为I~8个并且优选2~4个。不需要这些突出碱基构成与NEKlO变异mRNA互补的(反义)或相同的(正义)序列。
[0097]对NEKlO变异mRNA具有RNA干扰效应的siRNA的实例包括靶向NEKlO变异mRNA中由SEQ ID N0:2表示的碱基序列的整个或部分长度的连续碱基序列的具有RNA干扰效应的siRNA，例如15~24个碱基的连续碱基序列，并且优选18~20个碱基的连续碱基序列。另一个实例是靶向NEKlO变异mRNA中由SEQ ID N0:4表示的碱基序列的整个或部分长度的连续碱基序列的具有RNA干扰效应的siRNA，例如15~24个碱基的连续碱基序列，并且优选18~20个碱基的连续碱基序列。
[0098]靶向NEKlO变异mRNA中由SEQ ID NO:2表示的碱基序列的整个长度或其部分长度的siRNA的具体实例包括:由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA由SEQ ID NO:2 (5’ -GAAAUCCUGUC`AGAUGAUAACUUCA-3’)表示的碱基序列构成，且该反义 RNA 由SEQ ID NO:3 (5’-UGAAGUUAUCA UCUGACAGGAUUUC-3’)表示的碱基序列构成；和由正义 RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有SEQ ID N0:2表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，并且该反义RNA含有与前述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应。另外，所述siRNA也可以是由正义RNA和反义RNA的组合构成的并且对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的siRNA，该正义RNA含有SEQ ID N0:2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失的碱基序列，并且该反义RNA含有与前述正义RNA互补的碱基序列。另外，所述siRNA还可以是其中这些siRNA中的一个或多个碱基经修饰并同时还对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的siRNA。
[0099]靶向NEKlO变异mRNA中由SEQ ID N0:4表示的碱基序列的整个长度或其部分长度的siRNA的具体实例包括:由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA由SEQ ID N0:4 (5’ -UCUGCCUUGUUUGUUCACCACUAUU-3’)表示的碱基序列构成，且该反义 RNA 由SEQ ID NO:5 (5’-AAUAGUGGUG AACAAACAAGGCAGA-3’)表示的碱基序列构成；和由正义 RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，该正义RNA含有SEQ ID N0:4表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，并且该反义RNA含有与前述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应。另外，所述siRNA也可以是由正义RNA和反义RNA的组合构成的并且对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的siRNA，该正义RNA含有SEQ ID NO:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失的碱基序列，并且该反义RNA含有与前述正义RNA互补的碱基序列。另外，所述siRNA还可以是其中这些siRNA中的一个或多个碱基经修饰并同时还对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的siRNA。
[0100][RNAi核酸分子的前体]
[0101]在本发明的用于抑制细胞生长的方法中，可以直接使用RNAi核酸分子(如siRNA)转染细胞，或者可以使用所述RNAi核酸分子的前体来转染细胞，并且在细胞中可以通过反应(如降解)由所述前体来产生所述RNAi核酸分子。只要是最终在细胞中产生RNAi核酸分子(如siRNA)的前体，对所述RNAi核酸分子的前体就没有特别的限制。siRNA前体的实例包括相对长链的dsRNA以及单链RNA，其中构成siRNA的正义RNA和反义RNA通过间隔子(间隔物，spacer)偶联(couple)。虽然对间隔子的长度没有特别的限制，但是例如其可以为3~23个碱基的长度。此外，偶联所述正义RNA和反义RNA的间隔子优选形成环，并且该环之前和之后的RNA序列优选退火形成双链(shRNA)。虽然对shRNA中的环和茎的长度没有特别的限制，但是所述茎的长度例如可以是5~29个碱基。另外，可以在5’ -端和/或3’ -端上存在或不存在由若干碱基构成的突出端。RNAi核酸分子(如siRNA)是由这些前体通过细胞中Dicer酶等的消化来产生的。
[0102]在本发明的抑制细胞生长的方法中使用的前体的实例是靶向NEKlO变异基因的mRNA中的由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4表示的碱基序列的具有RNA干扰效应的shRNA。在本发明中使用的所述前体优选如下shRNA，该shRNA能够在细胞中产生靶向NEKlO变异mRNA中的由SEQ ID NO:2表示的碱基序列的整个长度或部分长度的siRNA或者靶向NEKlO变异mRNA中的由SEQ ID N0:4表示的碱基序列的整个长度或部分长度的siRNA。
[0103]作为用于产生靶向由SEQ ID` N0:2表示的碱基序列的整个序列或部分序列的siRNA的前体的核酸分子的实例包括:shRNA，其含有SEQ ID N0:2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列、或该碱基序列中的一个或多个碱基经修饰、替换、添加或缺失的碱基序列；和SEQ ID N0:3表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列、或该碱基序列中的一个或多个碱基经修饰、替换、添加或缺失的碱基序列；并且在细胞中从该shRNA能够产生对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的siRNA。作为用于产生靶向由SEQID N0:4表示的碱基序列的整个序列或部分序列的siRNA的前体的核酸分子的实例包括:shRNA，其含有SEQ ID N0:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列、或该碱基序列中的一个或多个碱基经修饰、替换、添加或缺失的碱基序列；和SEQ ID N0:5表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列、或该碱基序列中的一个或多个碱基经修饰、替换、添加或缺失的碱基序列，并且在细胞中从该shRNA能够产生对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的siRNA。
[0104]RNAi核酸分子(如siRNA)或为其前体的核酸分子可以适合地通过例如以下而制备:体外化学合成系统、使用噬菌体RNA聚合酶的体内转录方法、或其中通过RNase III或Dicer酶来裂解已经使用克隆cDNA作为模板通过转录而缀合(结合,conjugate)的长dsRNA的方法。另外，在使用含有经修饰的碱基的RANi核酸分子的情况下，可以对合成的核酸分子进行修饰，或者可以使用经修饰的碱基来合成RNAi核酸分子。
[0105][表达载体]
[0106]在本发明的用于抑制细胞生长的方法中，RNAi核酸分子等可以通过使用能够在细胞中表达RNAi核酸分子或其前体的表达载体来转染细胞并且由该表达载体来生产。能够表达siRNA的载体的实例包括:表达载体，其中分别偶联独立的启动子以便独立地表达siRNA的正义RNA和反义RNA ;和经设计以便通过选择性剪接等独立地由单个启动子转录正义RNA和反义RNA的表达载体。能够表达shRNA的载体的实例包括以下表达载体，其中构成shRNA的单链RNA偶联在启动子的下游。
[0107]这些表达载体可以由本领域普通技术人员使用普通的基因工程技术来容易地制造(T.R.Brummelkamp, et al., Science, 2002, Vol.296, pp.550-553 ;Ν.S.Lee, et al., Nat.Biotech., 2001, Vol.19, pp.500-505 ；M.Miyagishi 和K.Taira,Nat.Biotech.，2002，Vol.19，pp.497-500 ；P.J.Paddisonjet al.，Proc.Nat 1.Acad.Sc 1.USA，2002，V ol.99，pp.1443-1448 ； C.P.Paul, et al.，Nat.Biotech.，2002，Vol.19，p.505-508 ；G.Sui，et al.，Proc.Nat 1.Acad.Sc 1.USA, 2002，Vol.99，pp.55 15-5520 ；G.M.Barton 和 R.MedzhitovjProc.Nat 1.Acad.Sc1.USA, 2002，Vol.99，pp.14943-14945 ；P.J.Paddi son, et al.，GenesDev.，2002，Vol.16，pp.948-958)。更具体地说，编码靶RNA序列的DNA可以通过适当地插入各种已知的表达载体来构建。可以将RNA聚合酶III启动子等用作启动子。更具体地说，可以使用启动子如U6启动子或Hl启动子。可以使用的已知载体的实例包括病毒载体(如反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或负链RNA病毒载体(minus-strand RNAviral vectors))和非病毒载体(如质粒)。
[0108][细胞转染]
[0109]对用于使用RNAi核酸分子(如siRNA)、其前体或其表达载体转染细胞的方法没有特别的限制，并且可以使用当用核酸分子转染细胞时的任何已知的技术。例如，可以通过注射来使用RNAi核酸分子等来转染细胞，或者如果必要可以使用已知的基因转染试剂通过胞吞作用等而并入到细胞中。另外，可以使用一种类型的RNAi核酸分子等转染细胞或者两种以上类型的组合来转染细胞。
[0110]在本发明的用于抑制细胞生长的方法中，被靶向而抑制生长的那些细胞是其中表达了 NEK10变异基因的细胞，或者换句话说，能够表达NEK10变异基因的mRNA形式的转录产物或其蛋白质形式的翻译产物的细胞(称为NEK10变异体表达细胞)。对所述NEK10变异体表达细胞没有特别的限制，并且它们可以是正常细胞或癌细胞。另外，对它们来源的器官没有特别的限制。例如，在为癌细胞的情况下，对癌症的类型没有特别的限制。此外，所述细胞可以是人类来源的或可以是来自人类以外的动物。被靶向以抑制生长的细胞可以是培养的细胞、从活的个体中采集的细胞或存在于活的个体中的细胞。
[0111]<用于抑制NEK10变异基因的表达的组合物和抗癌剂>
[0112]当细胞被对NEK10变异mRNA具有RNA干扰效应的核酸分子如siRNA、该siRNA的前体(且特别是shRNA)、前述siRNA的表达载体或前述前体的表达载体转染时，由于在所述细胞中产生RNA干扰，NEK10变异基因的表达降低，所述细胞的生长被抑制。换句话说，这些核酸分子是以细胞生长抑制剂的活性成分的形式获得的，因此它们可用于作为针对由细胞的过度增殖(如肿瘤细胞)所致的疾病的药物的物质。因此，这些核酸分子可以直接地使用，或者在与药理学上可接受的配合剂(助剂，compounding agent)适当地混合之后用作组合物(本发明的组合物)或抗癌剂(本发明的抗癌剂)以抑制NEKlO变异基因的表达。另外，本发明的所述组合物和抗癌剂可以仅含有一种类型的核酸分子(如siRNA)或者可以含有多种类型的组合。
[0113]认为本发明的抗癌剂在治疗表达NEKlO变异基因的癌症中是有用的，所述抗癌剂包含对NEKlO变异mRNA具有RNA干扰效应的核酸分子作为其活性成分。不仅在乳腺癌中表达NEKlO变异基因，而且至少在肝癌、肾癌、前列腺癌和子宫癌中也表达NEKlO变异基因。因此，预计本发明的抗癌剂通过影响癌细胞的细胞生长而会在多种类型的癌细胞中表现出高水平的抗肿瘤效果。
[0114]本发明的组合物和抗癌剂表现的抗癌效果，如癌细胞生长的抑制效果、癌细胞的细胞死亡诱导效果、或相对于抗癌剂等的敏感性增强效果。另外，本发明的组合物和抗癌剂的这些效果可以瞬时地或永久地表现出来。此外，所述效果可以在用本发明的组合物或抗癌剂转染后经过固定的时间量之后而最终被显现出来。
[0115]可以加入到本发明的组合物和抗癌剂中的配合剂的实例包括药理学上可接受的添加剂，例如载体、赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、流化剂(fluidizers)、包衣齐Li (coatingagents)、助悬剂(suspending agents)、乳化剂、稳定剂、防腐剂、矫味剂、调味剂、稀释剂或溶解助剂。另外，本发明的所述组合物和抗癌剂可以安全地以粉末、颗粒剂、片剂、囊片、胶囊剂、注射剂、栓剂或软膏剂的剂型口服给药或肠胃外给药(包括全身用药和局部用药)。虽然本发明的组合物和抗癌剂中的活性成分(RNAi核酸分子或其前体形式的核酸分子)的含量根据制剂而变化，但通常优选为0.1重量％~100重量％ (以重量计0.1%~以重量计100%)。虽然剂量根据给药途径、患者年龄或进行预防或治疗的实际症状等因素而变化，但是作为成人在口服给药的情况下的活性成分的量，例如0.01mg~2000mg/天,且优选
0.1mg~1000mg/天，并且剂量可每天一次给药或者在若干次给药之间进行分配。
[0116]〈用于筛选抗癌剂的方法〉
[0117]如前面所描述的，由于通过降低NEKlO变异基因的表达而抑制了对癌细胞中NEKlO变异蛋白的功能，所以抑制了癌细胞的生长并且表现出抗肿瘤效果。因此，对NEKlO变异基因的表达具有抑制效应的物质或对NEKlO变异蛋白的活性具有抑制效应的物质有被作为癌症治疗药物的有效成分而使用的高可能性。因此，可以通过使用对NEKlO变异基因的表达的抑制效果或对NEKlO变异蛋白的活性的抑制效果作为指标来筛选新的抗癌剂。
[0118]抗癌剂的候选物质的实例包括核酸、肽、蛋白质、有机化合物(包括低分子量化合物和高分子量化合物)和无机化合物。本发明的筛选方法可以在含有这些候选物质(称为测试物质)的样品上进行。含有测试物质的样品包括细胞提取物、基因文库的表达产物、微生物的培养物上清液，真菌成分等。
[0119]更具体地说，在通过使用对NEKlO变异基因的表达的抑制效果作为指标来在测试物质中进行搜寻的情况下，在存在或不存在测试物质的条件下培养NEKlO变异基因表达细胞，随后将在该两种条件下NEKlO变异mRNA或NEKlO变异蛋白的表达水平进行比较。
[0120]在筛选中使用的细胞只要求是NEKlO变异体表达细胞。虽然在筛选在人类中有效的抗癌剂的情况下优选使用源于人类的NEKlO变异体表达细胞，但是源于人类之外的动物的NEKlO变异体表达细胞也可以使用，只要所述细胞来源的物种中存在显示与人类NEKlO变异mRNA具有同源性的碱基序列。例如，由于在小鼠转录产物中存在显示与人类NEKlO变异mRNA具有同源性的碱基序列(NCBI登录号:NM_001195119.1)，因此也可以使用源于小鼠的NEKlO变异体表达细胞。另外，在筛选中使用的细胞的范围包括作为细胞集合的组织。另外，按照既定的方法在能够产生NEKlO变异蛋白的状态下通过使用具有人类NEKlO变异基因的cDNA的表达载体转染来制备的转化细胞也可以用作NEKlO变异体表达细胞。
[0121]在前述的筛选方法中，例如，可以通过在将测试物质添加到NEKlO变异体表达细胞的培养液中的状态下来培养NEKlO变异体表达细胞，从而使所述测试物质与NEKlO变异体表达细胞接触。此外，虽然对其没有特别的限制，但是优选选择能够促使细胞表达NEKlO变异mRNA或蛋白质但不破坏所述细胞的培养条件(例如温度、pH和培养基组成)来作为测试物质接触NEKlO变异体表达细胞的条件。
[0122]例如，可以在前述的条件下使测试物质与NEKlO变异体表达细胞接触，并且寻找导致NEKlO变异mRNA或蛋白质的表达水平降低的那些物质从而筛选候选物质。更具体地说，在测试物质的存在下培养NEKlO变异体表达细胞的情况下，当与在相同的条件下、在不存在所述测试物质下的NEKlO变异mRNA或蛋白质的表达水平相比，其NEKlO变异mRNA或蛋白质的表达水平更低时，则选出该测试物质。
[0123]可以通过使用了 Northern印迹法的测量方法或者使用了具有与NEKlO变异mRNA的碱基序列互补的序列的寡核苷酸探针的DNA阵列的测量方法、或者通过使用了 NEKlO变异mRNA中存在的部分碱基序列作为引物的RT-PCR或实时PCR来测试NEKlO变异mRNA或蛋白质的表达水平。
[0124]例如，可以通过使用了 NEKlO变异蛋白的抗体的已知方法来测量NEKlO变异蛋白的表达水平。使用抗体的测量方法的实例包括蛋白质印迹、免疫沉淀和ELISA。
[0125]基于其结构，预测NEKlO变异体具有激酶活性。因此，可以通过使用对NEKlO变异蛋白的激酶活性的抑制效果作为指标来筛选抗癌剂。更具体地说，使用纯化的NEKlO变异蛋白或表达NEKlO变异蛋白的细胞的提取物在存在和不存在测试物质的条件下来比较NEKlO变异蛋白的激酶活性。
[0126]在激酶活性的测量中，可以将通过基因重组技术生产的重组蛋白质用作NEKlO变异蛋白。重组蛋白质可以按照普通方法使用NEKlO变异基因的cDNA和已知的表达系统来生产。表达系统的实例包括使用了大肠标杆菌、酵母、作为宿主细胞的昆虫细胞或哺乳动物细胞的表达系统以及无细胞表达系统。例如，强制表达NEKlO变异蛋白后的宿主细胞的提取物可以在激酶活性的测量中直接使用，或者可以使用纯化自该细胞提取物的重组蛋白质。另外，还可以使用固有表达NEKlO变异蛋白的细胞的提取物或纯化自该提取物的NEKlO变异蛋白来测量激酶活性。
[0127]通常用作激酶底物的各种类型的蛋白质可以用于在激酶活性的测量中使用的底物。其具体实例包括髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)和组蛋白。用作底物的蛋白质可以是重组蛋白质，可以是通过肽合成等来人工合成的，或者可以是存在于细胞的固有蛋白质。在使用重组蛋白质或固有存在于细胞中的蛋白质的情况下，细胞提取物或从提取物中纯化的蛋白质可以被用来测量激酶活性。[0128]在前述的筛选方法中，在用于测量激酶活性的环境中使测试物质与NEKlO变异体表达细胞接触。测量激酶活性期间的条件(如温度、PH或盐浓度)由将蛋白质作为底物通过NEKlO变异蛋白进行磷酸化的那些条件构成，并且对它们没有特别的限制。
[0129]测试物质的选择可以通过将在所述测试物质的存在下在前述条件下由NEKlO变异蛋白磷酸化的底物蛋白质的量与不存在所述测试物质下由NEKlO变异蛋白磷酸化的底物的量进行比较来进行。更具体地说，当存在测试物质下的底物蛋白质的磷酸化的量少于在相同条件下在不存在所述测试物质下的底物蛋白质的磷酸化的量时，选择该测试物质。
[0130]根据本发明的用于筛选抗癌剂的方法选定的物质通过抑制细胞中NEKlO变异基因的表达，从而具有减少NEKlO变异蛋白的产生的效应或者具有降低NEKlO变异蛋白的激酶活性的效应，因此认为其在癌症的治疗中是有用的。另外，通过生产根据这种筛选方法选定的测试物质的各种衍生物并且对其进行进一步的筛选，也可以获得具有优异的疗效和安全性的衍生物。
[0131]实施例
[0132]虽然以下通过实施例对本发明进行了更加详细的说明，但是这些实施例仅用于举例说明，并且本发明并不限于此。另外，除非另有具体说明，所述实施例中提及的市售试剂都是按照制造商的说明书来使用的。
[0133][参考例I]
[0134]进行本参考例以确认NEKlO变异mRNA在各种癌细胞系中的表达。即，使用SYBR?Green通过实时PCR测量NE KlO变异mRNA在表1中列出的各种癌细胞系中的相对表达水平。
[0135]使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)从各个癌细胞系中纯化出总RNA。通过根据说明书使用逆转录酶Superscript III (Invitrogen)使用400ng经纯化的RNA来制备cDNA。即，将RNA在65°C下进行5分钟的变性处理，然后在4°C下快速冷却，随后使其在55°C下反应30分钟，然后在75°C下反应15分钟以合成cDNA。
[0136]使用IyL所得到的cDNA作为模板，使用用于扩增由NEKlO变异mRNA合成的cDNA的引物、用于扩增由GAPDH合成的cDNA的引物和根据说明书使用Brilliant SYBR?Green Master Mix (Stratagene)进行实时PCR。进行GAPDH的扩增作为反应体系的对照。即，在95°C下进行10分钟的热变性之后，进行40个PCR循环，其中一个循环由在95 °C下30秒、在55 °C下60秒和在72 °C下60秒构成。使用MX3000 (Stratagene)系统进行实时PCR。用于扩增由NEKlO变异mRNA合成的cDNA的引物包括由SEQ IDNO: 6 (5，-GCACACAAAGGTATTTTATGG-3’ )的碱基序列构成的正向引物和由SEQ ID NO: 7(5' -CTACTCAAACT TGCCTTCTCA-3’ )的碱基序列构成的反向引物。另外,用于扩增由GAPDHmRNA 合成的 cDNA 的引物包括由 SEQ ID NO:8 (5’ -TCTGCTCCTCCTGTTCGACAGT-3’)的碱基序列构成的正向引物和由SEQ ID NO:9 (5’-ACCAAATCCGTTGACTCCGAC-3’)的碱基序列构成的反向引物。使用MX Pro软件(Stratagene)来确定Ct值。Ct值是指通过PCR反应的革巴基因扩增按指数规律地发生时的循环阈值数(循环阈值)。
[0137]使用以下所示的等式(I)，由所得到的Ct值确定各种癌细胞系的NEKlO变异mRNA的Λ Ct值(在经过与校准器(calibrator)相比的情况下的相对Ct值)。
[0138]等式(I):[0139]Δ Ct (NEK IO 基因变异体)值=NEKlO 变异 mRNA 的 Ct 值-GAPDH mRNA 的 Ct 值
[0140]通过使用从等式(I)中获得的各癌细胞系中NEKlO变异mRNA的Λ Ct值，以NEKlO变异mRNA在HeLaS3细胞中的表达水平的值作为100为基础，根据等式(2)确定各癌细胞系中NEKlO变异mRNA的相对表达水平。
[0141]等式(2):
[0142]各癌细胞系中NEKlO变异mRNA的相对表达水平=(各癌细胞系中NEKlO变异mRNA的Λ Ct值/HeLaS3细胞中NEKlO变异mRNA的Λ Ct值)X 100
[0143]使用前述的等式(2)，以NEKlO变异mRNA在HeLaS3细胞中的表达水平的值为100作为基础，得到的各癌细胞系中NEKlO变异mRNA的相对表达水平如表1所示。观察了乳腺癌、肝癌、肾癌、前列腺癌和子宫癌的细胞中NEKlO变异mRNA的表达。因此，预计NEKlO变异体不仅在乳腺癌细胞中发挥了重要作用，同时在其它癌细胞中也发挥了重要作用。
[0144][表 I]
[0145]
【权利要求】
1.一种用于抑制细胞生长的方法，包括: 在细胞中 用于降低NEKlO变异基因表达的表达降低步骤，和/或 用于降低NEKlO变异蛋白活性的活性降低步骤。
2.根据权利要求1所述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述表达降低步骤是用于使用选自由以下构成的组中的至少一种类型来转染细胞的步骤:通过RNA干扰抑制NEKlO变异基因表达的核酸分子、所述核酸分子的前体、以及能够表达所述核酸分子或所述前体的表达载体。
3.根据权利要求2所述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述核酸分子是靶向NEKlO变异基因的mRNA中的碱基序列的具有RNA干扰效应的siRNA，所述碱基序列由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4表示，以及 所述前体是靶向NEKlO变异基因的mRNA中的碱基序列的具有RNA干扰效应的shRNA，所述碱基序列由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4表示。
4.根据权利要求2所述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述核酸分子选自由以下所构成的组: (a)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA由SEQID NO: 2表示的碱基序列构成，而所述反义RNA由SEQ ID NO:3表示的碱基序列构成， (b)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA由SEQID NO: 4表示的碱基序列构成，而所述反`义RNA由SEQ ID NO:5表示的碱基序列构成， (c)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有SEQID NO: 2表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应， (d)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有SEQID NO: 4表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应， (e)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有这样的碱基序列，其中，SEQ ID NO:2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应， (f)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有这样的碱基序列，其中，SEQ ID N0:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，以及 (g)其中(a)~(f)任一项中所描述的siRNA中的一个或多个碱基被修饰的siRNA，并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应。
5.根据权利要求2所述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述前体在细胞中产生以下任一种: (a)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA由SEQ ID NO: 2表示的碱基序列构成，而所述反义RNA由SEQ ID NO:3表示的碱基序列构成，(b)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA由SEQID NO: 4表示的碱基序列构成，而所述反义RNA由SEQ ID NO:5表示的碱基序列构成， (c)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有SEQID NO: 2表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应， (d)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有SEQID NO: 4表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应， (e)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有这样的碱基序列，其中，SEQ ID NO:2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应， (f)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有这样的碱基序列，其中，SEQ ID N0:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，以及 (g)其中(a)~(f)任一项中所描述的siRNA中的一个或多个碱基被修饰的siRNA，并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应。
6.根据权利要求2所述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述前体是: (P) shRNA，含有:SEQ ID NO:2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在所述碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列；以及SEQ ID NO:3表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在所述碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列， 或 (q) shRNA，含有:SEQ ID N0:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在所述碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列；以及SEQ ID NO:5表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在所述碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列； 并且， 对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的siRNA，是在细胞中由(p)的shRNA和(q)的shRNA产生的。
7.根据权利要求1所述的用于抑制细胞生长的方法，其中，所述细胞是癌细胞。
8.—种核酸分子，其为: (a)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA由SEQID NO: 2表示的碱基序列构成，而所述反义RNA由SEQ ID NO:3表示的碱基序列构成， (b)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA由SEQID NO:4表示的碱基序列构成，而所述反义RNA由SEQ ID NO:5表示的碱基序列构成， (c)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有SEQID NO: 2表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应， (d)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有SEQID NO: 4表示的碱基序列中的15~24个碱基的连续碱基序列，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应， (e)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有这样的碱基序列，其中，SEQ ID NO:2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应， (f)由正义RNA和反义RNA的组合构成的siRNA，所述正义RNA含有这样的碱基序列，其中，SEQ ID N0:4表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列中的一个或多个碱基被替换、添加或缺失，而所述反义RNA含有与所述正义RNA互补的碱基序列；并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应，以及 (g)其中(a)~(f)任一项中所描述的siRNA中的一个或多个碱基被修饰的siRNA，并且所述siRNA对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应。
9.一种核酸分子，其为: (P) shRNA，含有:SEQ ID NO:2表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在所述碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列；以及SEQ ID NO:3表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在所述碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列， 或 (q) shRNA，含有:SEQ ID N0:4`表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在所述碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列；以及SEQ ID NO:5表示的碱基序列中的15或更多个碱基的连续碱基序列，或其中在所述碱基序列中的一个或多个碱基被修饰、替换、添加或缺失的碱基序列； 并且， 其为前体，用于在细胞中产生对NEKlO变异基因具有RNA干扰效应的siRNA。
10.一种表达载体，含有根据权利要求8或9所述的核酸,所述表达载体能够表达所述核酸。
11.一种用于抑制NEKio变异基因的表达的组合物，包含选自由以下所构成的组中的一种或多种类型: 根据权利要求8所述的核酸分子， 根据权利要求9所述的核酸分子，以及 根据权利要求10所述的表达载体。
12.一种抗癌剂，包含选自由以下所构成的组中的一种或多种类型作为其活性成分: 根据权利要求8所述的核酸分子， 根据权利要求9所述的核酸分子，以及 根据权利要求10所述的表达载体。
13.一种用于筛选抗癌剂的方法，其利用对NEKlO变异基因的表达的抑制效应或对NEKlO变异蛋白的活性的抑制效应作为指标。
14.根据权利要求13所述的用于筛选抗癌剂的方法，包括: 针对于对NEKlO变异基因的表达的抑制效应或对NEKlO变异蛋白的活性的抑制效应，分别在存在和不存在候选物质的情况下培养NEKlO变异体表达细胞的步骤，和 测量NEKlO变异mRNA在细胞中的表达水平或NEKlO变异蛋白的活性量，以及比较在存在和不存在所述候选物质的 情况下的所述表达水平或所述活性量的步骤。
【文档编号】C12N15/113GK103781906SQ201280044023
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年8月29日 优先权日:2011年9月14日
【发明者】佐藤学道 申请人:日本化药株式会社