专利名称：一种人膀胱癌细胞化学发光检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析以及临床诊断医学领域，具体地，本发明提供一种人膀胱癌细胞的化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤。血尿是膀胱癌患者临床早期症状之一，有肉眼血尿和镜检血尿。然而血尿在尿路炎症以及结石症状下也有发生，并不是膀胱癌的特异性症状。正是由于膀胱癌早期症状不明显，以至于发现有血尿，患者膀胱肿瘤一般发展为较大的肿瘤结节。寻找特异的膀胱癌诊断方法对早期膀胱癌诊断有重要的临床应用价值。膀胱癌的早期诊断方法有以下几种I)尿液分析血尿出现后的首先便是进行尿液分析，以便排除是否是由于尿路炎症引起，并不能确定患者是否患膀胱癌；2)尿脱落细胞分析对尿沉渣中的尿脱落细胞进行显微镜下观察，可以鉴别并区分恶化的肿瘤细胞和正常细胞。但灵敏度不高，早期膀胱癌容易被漏检；3)超声、CT或者MRI成像观察对肿瘤的大小和恶化程度可以直接进行图像观察，准确度较前面方法大大提高。尽管近年来成像技术的不断进步，灵敏度不断提高，但对较小的肿瘤观察仍然不够，易漏检；4)膀胱镜观察膀胱镜通过尿路进入膀胱，进行膀胱内可视观察，从而发现早期的肿瘤。能够检出2)、3)中漏检的大部分患者。目前早期诊断膀胱癌细胞特异性最高的是通过膀胱镜的观察，荧光膀胱镜的应用提高了检测灵敏度。但患者一般需要临床跟踪观察，从而能及早发现肿瘤发生或复发状况。然而，膀胱镜观察会对患者造成身体不适。另外，目前荧光膀胱镜检测所需荧光染料特异性不高，且对人体有一定的负面影响。因此，在膀胱癌的早期诊断方面，人们一直在探索更特异、灵敏的检测方法，尽可能的利用特异的肿瘤标志物实现方便、快速的检测。实现尿样中的膀胱癌标志物或者细胞的检测，进行实时检测在临床诊断方面具有重要的应用价值。目前商业化的可用的膀胱癌的标志物有人补体因子H相关蛋白(膀胱肿瘤抗原，BTA试剂盒)、高分子量的癌胚抗原和两个膀胱癌细胞相关的粘附分子(美国Scimedx Corp公司的Immunocyt试剂盒)、核基质蛋白22 (NMP22)、3、7和17号染色体的异倍体以及P16肿瘤抑制因子9p21位点的缺失(UroVysion试剂盒)。BTA是指人补充因子H相关蛋白，BTA检测需要专业操作人员在标准实验室进行，灵敏度达到57-83 %，特异性60-92%，血尿患者的特异性只能达到46%。另外良性前列腺增生、肾结石以及尿路感染等情况均影响BTA检测的特异性；Immunocyt试剂盒通过免疫荧光检测尿脱落细胞，尽管灵敏度以及特异性很高，但为了达到较高的准确性需要进行大量的尿脱落细胞检测，因此在膀胱癌病人的治疗以及预后观测方面具有很高的应用价值，但应用在早期诊断方面差强人意；其中NMP22是目前应用最广的膀胱癌标志物，ELISA试剂盒的市场化实现了膀胱癌早期诊断的方便、快捷检测，检测灵敏度和特异性也很高，但是在有病毒感染、肾/膀胱结石等情况下，仍会出现假阳性；UroVysion试剂盒采用的是多祀标的突光原位杂交(FISH)技术，尽管灵敏度与特异性得到极大提高，美国FDA批准，但与Immunocyt试剂盒类似，需要检测大量的尿脱落细胞。结合目前的膀胱癌标志物的应用以及膀胱癌的诊断现状得出一方面，新的特异的膀胱癌标志物仍是研究的重点，制备早期诊断试剂盒，实现快速检测，在膀胱癌的诊断方面具有重要的临床价值；另一方面，进行尿样中的细胞检测，避免炎症、血尿等非特异症状的影响，准确性最高。
发明内容
(一)解决的技术问题本发明着眼于膀胱癌的早期诊断与膀胱癌病人的跟踪观察，拟解决现行的膀胱癌诊断方面的难题，即采用特异的识别膀胱癌细胞两株单克隆抗体，实现膀胱癌细胞的双抗体识别与捕获，结合高灵敏的化学发光免疫分析方法，定量检测尿脱落膀胱癌细胞，不需要昂贵的检测仪器，便于临床推广，具有良好的市场应用价值，将会弥补市场现有试剂盒的不足。本发明的目的是提供一种特异的膀胱癌细胞捕获、识别方法，以及高灵敏检测试剂盒。本发明的另一目的是提供一种用于膀胱癌早期诊断、术后监测的试剂盒。本发明的另一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。(二)技术方案 本发明具体提供以下试剂盒[I] 一种用于检测人膀胱癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括两种特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体。[2]根据[I]所述的试剂盒，所述试剂盒包括I)膀胱癌EJ细胞标准品；2)由特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体包被的磁颗粒；3)酶标记的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体；4)3)中的酶所作用的化学发光底物；5)反应管或微孔板，所述反应管或微孔板优选经过无蛋白封闭液的封闭处理，所述无蛋白封闭液为含有1. O %的鱼水解明胶，PH7. 2的O. 02M磷酸盐缓冲液；6)与5)中的反应管或微孔板配套的磁分离器。[3]根据[2]所述的试剂盒，其中所述膀胱癌EJ细胞标准品为膀胱癌EJ细胞的逐级稀释液。[4]根据[2]所述的试剂盒，其中，2)中所述的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 6906的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体BCMab2，其与磁颗粒通过共价键结合。[5]根据[2]所述的试剂盒，其中，2)中所述的磁颗粒是粒径为IOOnm至Ιμπι的
氧化硅羟基磁颗粒。[6]根据[2]所述的试剂盒，其中，3)中所述的酶标记的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体是酶标记的BCMabl单克隆抗体,所述BCMabl单克隆抗体由保藏号为CGMCC No. 3845的杂交瘤细胞株制备(关于BCMabl单克隆抗体的制备具体可以参见中国专利申请号201010251384. 6)。[7]根据[2]所述的试剂盒，其中，3)中所述的酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶。[8]根据[2]所述的试剂盒，其中，5)中所述的反应管是具有光学透明度的聚苯乙烯管、聚乙烯管、聚丙烯管或者玻璃管；所述微孔板是适用于化学发光反应的检测的白色微孔板。本发明还提供制备所述试剂盒的方法方法，所述方法包括以下步骤I)配制膀胱癌EJ细胞标准品对膀胱癌EJ细胞溶液进行逐级稀释以制成膀胱癌EJ细胞的逐级稀释液；2)制备链酶亲合素修饰的磁颗粒；3)分别使用保藏号为CGMCC No. 3845和CGMCC No. 6906的两株单克隆杂交瘤细胞株制备可特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体BCMabl和BCMab2 ；4)制备生物素化的单克隆抗体BCMab2 :在微碱性条件下将生物素_N_羟基琥珀酰亚胺与所述抗体的游离赖氨酸发生偶联反应；5)使用2)中制备的链酶亲合素修饰的磁颗粒和4)中制备的生物素化的单克隆抗体BCMab2，通过链酶亲合素与生物素的特异性结合反应，制备由生物素化的单克隆抗体BCMab2包被的磁颗粒；
6)制备酶标记的单克隆抗体BCMabl :采用碳化二亚胺(EDC)偶联法，实现所述抗体上的氨基与所述酶分子上的羧基的结合；7)配制6)中的酶所作用的化学发光底物液；8)组装为成品。优选地，所述方法还包括以下步骤a)在所述由生物素化的单克隆抗体BCMab2包被的磁颗粒的制备后，用封闭液封闭所制备的由生物素化的单克隆抗体BCMab2包被的磁颗粒以降低非特异性吸附，所述封闭液包含O. 2% 1.0%牛血清白蛋白、O. 5% 1.0%酪蛋白、O. 5% 1.0%的鱼水解明胶，ρΗ7· 2的O. 02Μ磷酸盐缓冲液；和b)用无蛋白封闭液封闭反应管和微孔板,所述无蛋白封闭液为含有1.0%的鱼水解明胶，PH7. 2的O. 02M磷酸盐缓冲液。本发明的试剂盒能够灵敏、快速测定尿中脱落的膀胱癌细胞，可以及早检测早期脱落的恶化肿瘤细胞，灵敏度高于检测尿成分测定以及目前市场上的尿细胞学检测。本发明专利检测灵敏度达到每个分析实现I个恶性膀胱癌细胞的检测。本发明的试剂盒也适用于膀胱癌组织消化细胞的肿瘤细胞检测，也适用于血液中循环的膀胱癌细胞的检测。本发明的试剂盒采用免疫磁颗粒特异捕获、酶标记单克隆抗体特异识别的双抗体夹心方法，实现了膀胱癌细胞的特异性检测。本试剂盒可以排除正常、炎症上皮细胞，以及其它血细胞的干扰，只特异识别膀胱癌细胞。本发明专利采用免疫磁颗粒方法捕获尿液中脱落的膀胱癌细胞，操作简便、检测时间短，利于临床大规模的应用。本发明中使用到两种特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体DBCMabl :由保藏号为CGMCC No. 3845的杂交瘤细胞株制备，该杂交瘤细胞株于2010年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，该抗体及其制备具体描述于中国专利申请号=201010251384. 6 ;以及2)BCMab2 由保藏号为CGMCC No. 6906的杂交瘤细胞株制备，该杂交瘤细胞株于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)。
图1.所制备的试剂盒以EJ细胞为模型所得线性标准曲线。图2. EJ、LOVO、HCV29细胞系和PBS通过本方法检测所得的发光值对比。EJ :膀胱癌细胞系；L0V0 :直肠癌细胞系；HCV29 :正常上皮细胞系。图3.试剂盒检测灵敏度。膀胱癌细胞系EJ、T24、5637、BIU_87 ;BCU_Ta :Ta期膀胱癌患者尿液样本T1期膀胱癌患者尿液样本。图4.本发明试剂盒应用于膀胱癌与正常样本检测。图5.本发明试剂盒临床测定结果的ROC曲线。
具体实施例方式实施例1制备本发明的一种新的膀胱癌细胞化学发光检测试剂盒一、标准化的膀胱癌细胞的制备膀胱癌EJ细胞系(CRL-2888 )购自美国模式培养物保存所(ATCC)，以含10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco，12100-046)培养。将培养的贴壁状态良好的细胞加入l-2mL胰酶(Invitrogen，R-001-100)，37°C消化2分钟，加入适量培养基，将消化下来的细胞离心弃上清后，重悬于胎牛血清加10%二甲基亚砜(DMSO)配制而成的冻存液中，以IO6个/mL细胞浓度_80°C冻存，每支冻存500 μ L0试剂盒运输过程，此成分需要单独采用干冰冻存运输。
二、单克隆抗体BCMab2杂交瘤细胞的制备取冻存EJ细胞，培养于DMEM培养基，状态良好培养3周后，取处于生长对数期的EJ细胞I X 1O7个，免疫6周大小的BALB/c小鼠(商购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，每周免疫4次，免疫1个月后，取小鼠脾脏细胞。并准备小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0 (CRL-1772, ATCC)与小鼠脾脏细胞融合，按照参考文献(Kirk, A. D.，et al. Nat Med1999，5，686-693)所述进行杂交瘤筛选EJ细胞的单克隆株细胞。然后，将选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养(有限稀释法，以小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞)。经过2-3轮克隆化培养，获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆株。将杂交瘤细胞克隆株扩大培养，并冻存保种。筛选所得杂交瘤细胞株可分泌单克隆抗体BCMab2，特异识别EJ细胞以及其它膀胱癌细胞。三、单克隆抗体BCMabl和BCMab2的制备已具备两株单克隆杂交瘤细胞株保藏号为CGMCC No. 3845的杂交瘤细胞株可获得BCMabl抗体(具体参见，中国专利申请号201010251384. 6);保藏号为CGMCC No. 6906的杂交瘤细胞株可获得BCMab2抗体。取5X IO6个正处于对数生长期的杂交瘤细胞，以IXlO7的细胞浓度注射于BALB/c小鼠腹腔，10天后收集腹水。通过以下步骤纯化腹水中的单克隆抗体1.收集所得的腹水以2500r/min离心，取上清，以O. OlM pH7. 4 PBS对倍稀释腹水上清。2.向上述腹水中加入等体积的饱和硫酸铵，室温搅拌I小时；3.以11000r/min，4°C离心20分钟，弃上清。重悬于适量O. OlM pH7.4PBS中，并加入一半腹水体积的饱和硫酸铵,4 V搅拌过夜。4.上述腹水以11000r/min，4°C离心20分钟，弃上清。将沉淀溶于O. OlM pH7. 4PBS中，再用O. OlM ρΗ7· 4 PBS透析，即得抗体粗球。5. Protein-G凝胶柱安装到AKTA蛋白纯化仪；6.将抗体粗球11000r/min,4°C离心20分钟,取上清。上清以O. 5mL/min流速通过预先以O. 02M pH7. O含O. 15M的NaCl的PBS平衡过的Protein-G凝胶柱，上样完毕后孵育I小时；7. O. 02M ρΗ7· O 含 O. 15Μ 的 NaCl 的 PBS 洗脱杂蛋白；8. O. 2Μ ρΗ2. 8甘氨酸缓冲液洗脱抗体峰；9.洗脱的抗体溶液经超滤浓缩，测抗体浓度，即完成抗体的纯化。
四、免疫磁颗粒的制备1.单克隆抗体BCMab2的生物素化取IOmg已纯化好的单克隆抗体BCMab2 (2mg/mL),用O. 1Μ, pH9. 5的碳酸盐缓冲液进行透析，即得处于碳酸盐缓冲体系的抗体溶液。生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS-Biotin,货号 H1759)购自 Sigma-Aldrich,以 lmg/mL 浓度溶解于二甲基亚讽(DMSO)。然后在抗体溶液中加入200uL生物素溶液，4°C搅拌反应6小时，加入20uL IM的NH4Cl溶液终止反应。反应物在O. 05M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液进行透析，即得处于磷酸盐缓冲体系的生物素化抗体BCMab2.2.磁颗粒的链酶亲合素修饰取20mg氧化硅羟基磁颗粒(上海奥润微纳有限公司，SM1-015A，SM1-035，SM1-050，SM1-100)，在外磁场作用下除去储存缓冲液，加入2mL1. 25%戊二醛活化，室温搅拌2小时后，在外加磁场下，静置5min，弃上清，用O. OlM pH7. 4磷酸盐缓冲液清洗三次，并重悬于O. 05M, pH9. 5碳酸缓冲溶液。之后，加入Img链酶亲合素(购自Sigma-AIdrich,S4762)，室温搅拌2小时，用pH7. 4的O. OlM磷酸盐缓冲液清洗三次，并重悬于磷酸缓冲溶液，定浓度为4mg/mL，即得链酶亲合素修饰的磁颗粒。3.免疫磁颗粒的制备20mg链酶亲合素修饰的磁颗粒(4mg/mL)置于磁场中，待磁颗粒完全沉降后，去除上清液，加入IOmg生物素化的抗体BCMab2 (2mg/mL)，4°C搅拌4小时。之后用O. OlM pH7. 4磷酸盐缓冲液清洗四次，最后重悬于抗体缓冲溶液中(O. OlM pH7. 4磷酸盐缓冲液，2%牛血清白蛋白，O. 05% Tween-20,0. 05% proclin-300)，即得免疫磁颗粒。优选地，用封闭液封闭所制备的由生物素化的单克隆抗体BCMab2包被的磁颗粒以降低非特异性吸附，所述封闭液包含O. 2% 1.0%牛血清白蛋白、O. 5% 1.0%酪蛋白、O. 5% 1.0%的鱼水解明胶，pH7. 2的O. 02M磷酸盐缓冲液。所制备的免疫磁颗粒以4mg/mL浓度于4°C保存。五、磁颗粒粒径的选择磁颗粒粒径越小，在溶液中分散越均匀，但小于IOOnm时，在外磁场作用下沉降速度减慢，会增加试剂盒应用过程中的洗涤时间，因此本试剂盒选定大于IOOnm以上的磁颗粒。磁颗粒在免疫反应过程中分散于反应体系，可以在一定程度上加快反应速度。鲁米诺-H2O2发光体系中，具有一定的催化作用，当粒径在IOOnm至I μ m时,鲁米诺-H2O2体系的发光动力学曲线发光平台可持续时间在30min到2h之间。增大到I μ m以上，这种催化能力下降，鲁米诺-H2O2体系的发光动力学曲线发光平台持续时间减少(低于15min)。六、酶标记单克隆抗体BCMabl的制备以辣根过氧化物酶(HR，购自Sigma，P6782)标记抗体为例，采用碳化二亚胺(EDC)偶联法，具体流程如下10mg HRP溶解于pH6. O的O.1M柠檬酸盐缓冲溶液中(1L去离子水中加入78. 84mg柠檬酸，476. 44mg柠檬酸钠)，加入碳化二亚胺(EDC，溶解于玛琳基乙磺酸)与酶分子上的羧基反应；IOmin后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，将取代EDC分子，酶分子与NHS分子间形成活化的羧基基团；lmg单克隆抗体BCMabl与活化的酶分子反应，实现抗体上的氨基与酶分子活化羧基反应，室温2小时，即得HRP标记单克隆抗体BCMabl ；完成标记的抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3 ;4°C静置lh，8000rpm离心lOmin，将上清液移至新管，沉淀用等体积PBS重新悬浮；重复上述操作3次，收集上清即得提纯的辣根过氧化物酶标记抗体BCMabl，加入等体积甘油，-20°C保存备用。碱性磷酸酶或荧光素酶与BCMabl的偶联，与上述步骤类似，试剂的具体用量可以适当进行调节优化。 七、样本稀释液的配制配制样品稀释液，具体配制为在IL去离子水中，加入3. 628gNa2HP04 · 12H20，
O.272g KH2PO4,0. 2g KCl，8g NaCl，18g 尿素，0. 05g 尿酸，ImL 胎牛血，ImL proclin-300 振荡混合均匀，调节pH至7. 4，溶液于4°C保存，用于尿沉渣样本和冻存细胞的稀释缓冲溶液。八、化学发光底物液本发明所使用的辣根过氧化物酶(HR)的化学发光底物液的配制方法基于IOOOmL所述化学发光底物A液，包括1. 7716g鲁米诺、O. 05g 4_羟基联苯、
O.012g 4-碘苯硼酸、11. 4g硼酸、4. 9g硼砂，其pH值为8. O 10. O ;基于IOOOmL所述化学发光底物B液，包括O. 329g过氧化脲、lmlTween-20、51. 58gNa2HP04 · 12Η20、8· 74g NaH2PO4 · 2Η20，其 pH 值为 7.0 7· 6。使用方法:Α、B液双组分试剂，在使用前根据使用量等体积混合。九、反应管和微孔板的封闭处理优选地，用无蛋白封闭液封闭反应管和微孔板，所述无蛋白封闭液为含有1. 0%的鱼水解明胶，ΡΗ7. 2的O. 02Μ磷酸盐缓冲液。实施例2本发明的膀胱癌尿脱落细胞化学法光免疫分析测定试剂盒使用方法一、样品前处理取人晨尿或晨二次尿样，如即时检测，样本无需处理，直接检测。如无法当天检测，样本需冻存取尿液10mL，3000rpm离心5min，将尿沉渣悬于500uL细胞冻存液(含10 %DMSO的胎牛血清)中，先置于4°C 2小时，再置于_80°C保存，备用。二、检测方法使用本试剂盒进行实验前，先将恒温箱或者水浴锅调至37°C ;之后需先取出本实施例I中所制备的磁颗粒溶液、HRP标记抗体以及各缓冲溶液，在室温放置以平衡到室温；再将冻存样本和膀胱癌EJ细胞标准品取出置于37°C水浴箱迅速复融，离心去上清，复悬于ImL细胞稀释液。EJ细胞初浓度5 X IO5个/mL，然后继续以细胞稀释液进行系列稀释，得一系列细胞标准品，即 5 X IO5 个 /mL、I X IO5 个 /mL、5 X IO4 个 /mL、I X IO4 个 /mL、5 X IO3 个 /mL、5X IO2 个 /mL、20 个 /mL。再后，准备 200-1000 μ L,20-200 μ L、1-10 μ L 量程微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作。使用本发明的试剂盒进行检测的具体操作步骤如下(一)微孔板式化学发光检测试剂盒取白色96微孔板，每孔加入50 μ L尿液样本或系列校准细胞溶液(5Χ105个/mL、I X IO5 个 /mL、5X IO4 个 /mL、l X IO4 个 /mL、5X IO3 个 /mL、5X IO2 个 /mL、20 个 /mL)。再先后加入辣根过氧化物酶标记抗体溶液和免疫磁微粒溶液各5 μ L，37°C振荡反应60min。每孔加入洗漆液150 μ L,在微孔板振荡器上(MH-1, Kylin-Bell Instruments)震荡IOs混勻，然后置于96微孔板配套的磁分离器(购自NEB公司，S1511S)上，去除上清。重复上面洗涤步骤，洗涤4次。每孔加入化学发光底物液100 μ L，充分混匀，而后在板式化学发光仪(北京滨松光子有限公司，ΒΗΡ9504)上依序测量发光强度(RLU)。理论上每孔内标准品细胞数目分别为25000个/分析、5000个/分析、2500个/分析、500个/分析、250个/分析、25个/分析、I个/分析。以细胞数量与发光值的线性关系见附图1，其中，纵坐标RLU为相对发光强度，横坐标为细胞检测数目(单位为细胞/分析)。在I 25000细胞/分析范围内，相关系数R2 = O. 9984，Y = 12511+33. 651Χ ;在I 500细胞/分析范围内，相关系数R2 = O. 9968，Y = 1037+92. 21Χ。根据RLU大小，选择合适的标准曲线范围，将各待测样本的RLU代入标准曲线方程，即得待测尿样中肿瘤细胞的数目。(二)管式化学发光检测试剂盒将反应管编号后，向其中加入200 μ L尿液样本或系列校准细胞溶液,与磁颗粒溶液和HRP标记BCMabl抗体溶液各20 μ L混合，37°C振荡反应60min。之后置于多功能磁分离器(上海奥润微纳新材料科技有限公司，MS-12)上，3min后弃去上清，每管加入洗涤液300 μ L，充分混匀，置于磁分离器上静置3min，弃去上清液，重复4次，最后弃去洗涤液，各管加入化学发光底物液200 μ L，充分混匀，而后在管式化学发光测量仪(德国BertholdTechnologies GmbH & Co. KG)上依序测量各管的发光强度(RLU)。以与上述(一)中相似的方式确定待测尿样中肿瘤细胞的数目。实施例3本发明的试剂盒的方法学指标按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果如下1、试剂盒精密度测定(I)EJ细胞标准品精密度实验
将实施例1中制备的试剂盒抽取10个试剂盒，按照实施例2所述操作测定I X IO3个/mL的EJ细胞标准品5次。计算测定结果变异系数，测定结果如表I所示，结果显示变异系数在3. 5% 10%之间。表IEJ细胞标准品可重复性实验
权利要求
1.一种用于检测人膀胱癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括两种特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒包括1)膀胱癌EJ细胞标准品；2)由特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体包被的磁颗粒；3)酶标记的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体；4)3)中的酶所作用的化学发光底物；5)反应管或微孔板，所述反应管或微孔板优选经过无蛋白封闭液的封闭处理，所述无蛋白封闭液为含有1. O %的鱼水解明胶，pH7. 2的O. 02M磷酸盐缓冲液；6)与5)中的反应管或微孔板配套的磁分离器。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述膀胱癌EJ细胞标准品为膀胱癌EJ细胞的逐级稀释液。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，2)中所述的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 6906的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体BCMab2，其与磁颗粒通过共价键结合。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，2)中所述的磁颗粒是粒径为IOOnm至Ιμπι的氧化硅羟基磁颗粒。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，3)中所述的酶标记的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体是酶标记的BCMabl单克隆抗体,所述BCMabl单克隆抗体由保藏号为 CGMCC No. 3845的杂交瘤细胞株制备。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，3)中所述的酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶。
8.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，5)中所述的反应管是具有光学透明度的聚苯乙烯管、聚乙烯管、聚丙烯管或者玻璃管；所述微孔板是适用于化学发光反应的检测的白色微孔板。
9.制备根据权利要求1或2所述的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤1)配制膀胱癌EJ细胞标准品对膀胱癌EJ细胞溶液进行逐级稀释以制成膀胱癌EJ细胞的逐级稀释液；2)制备链酶亲合素修饰的磁颗粒；3)分别使用保藏号为CGMCCNo. 3845和CGMCC No. 6906的两株单克隆杂交瘤细胞株制备可特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体BCMabl和BCMab2 ；4)制备生物素化的单克隆抗体BCMab2:在微碱性条件下将生物素-N-羟基琥珀酰亚胺与所述抗体的游离赖氨酸发生偶联反应；5)使用2)中制备的链酶亲合素修饰的磁颗粒和4)中制备的生物素化的单克隆抗体BCMab2，通过链酶亲合素与生物素的特异性结合反应，制备由生物素化的单克隆抗体 BCMab2包被的磁颗粒；6)制备酶标记的单克隆抗体BCMabl:采用碳化二亚胺(EDC)偶联法，实现所述抗体上的氨基与所述酶分子上的羧基的结合；7)配制6)中的酶所作用的化学发光底物液；8)组装为成品。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括以下步骤a)在所述由生物素化的单克隆抗体BCMab2包被的磁颗粒的制备后，用封闭液封闭所制备的由生物素化的单克隆抗体BCMab2包被的磁颗粒以降低非特异性吸附，所述封闭液包含O. 2% 1.0%牛血清白蛋白、O. 5% 1.0%酪蛋白、O. 5% 1.0%的鱼水解明胶， ρΗ7· 2的O. 02Μ磷酸盐缓冲液；和b)用无蛋白封闭液封闭反应管和微孔板，所述无蛋白封闭液为含有1.0%的鱼水解明胶，ρΗ7· 2的O. 02Μ磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明涉及免疫分析医学领域，具体地提供了一种基于免疫磁颗粒的化学发光分析方法检测人膀胱癌细胞的试剂盒及其制备方法。根据本发明，本发明的试剂盒主要包括1)膀胱癌EJ细胞标准品；2)由特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体包被的磁颗粒；3)酶标记的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体；4)3)中的酶所作用的化学发光底物；5)反应管或微孔板；6)与5)中的反应管或微孔板配套的磁分离器。
文档编号G01N33/577GK103033625SQ201210555378
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者范祖森, 张倩云, 李翀, 杜颖, 王彦英, 杨昭 申请人:中国科学院生物物理研究所