脐带提取物的制备方法和使用方法

脐带提取物的制备方法和使用方法
【专利摘要】本发明提供一种用于从脐带有效提取有用成分的方法。本发明提供包含有用成分的脐带提取物。依照本发明，所述脐带提取物可用作血清替代物来培养来自动物的普通细胞和干细胞。还有，依照本发明的脐带提取物可用于供组织修复的填充剂和敷料，和用于供改进皮肤的化妆用组合物。另外，本发明涉及用于分离和培养源自组织(如脐带和脂肪组织)的干细胞的培养基组合物，和使用其分离和培养源自所述组织的干细胞的方法。
【专利说明】脐带提取物的制备方法和使用方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求在韩国知识产权局2011年7月12日提交的韩国专利申请N0.10-2011-0068761和2011年7月11日提交的韩国专利申请N0.10-2011-0068261的权益，这两者的公开内容均通过引用而完整并入本文。
发明领域
[0003]本发明的一个或多个实施方案涉及制备脐带提取物的方法、脐带提取物的血清替代物、用于分离和培养干细胞的组合物、和填充剂(filler)用于伤口愈合的用途。
[0004]发明背景
[0005]自建立身体外动物细胞培养系统以来，血清一直被常规用于促进动物细胞的增殖。已广泛用于原代细胞和稳定细胞系的存活和增殖的血清，是一种仅其部分组成已知的混合物，如此尚未完全了解细胞培养中血清的生物学活性。还有，胎牛血清(FBS)从胎牛收集，如此FBS具有风险因子如支原体、病毒、朊病毒、细菌促细胞分裂原、激素、外来蛋白质、生长因子和蛋白酶。此外，根据供应商的设备、技术标准和生产批号，FBS组成的质量可能变化。已知迄今报告的基础培养基(basal media)能使特定细胞生长；代替血清使用的细胞生长因子、粘附因子等是昂贵的；且已知基础培养基中的生长和代谢物生产没有在包含血清的培养基中的那些那么稳定(Cruz J.H.等，Cytotechnology, 26:59-64(1998)和 Hee-Chan Lee, A Basal medium in an Animal Cell Culture, BiotechnologyNews, 2 (3):242-25 2(1994))。
[0006]还有，包括FBS在内的培养基常规用于连续培养处于未分化状态的成人干细胞，而源自动物的蛋白质源(包括FBS)在培养期间使用，其可能导致稳定性问题如在开发用于临床应用的干细胞治疗物时在物种之间的污染。因此，从常规培养方法获得的干细胞的临床应用具有许多局限性。
[0007]作为一种克服使用源自动物的蛋白质源(即FBS)的问题的方法，可使用一种利用基础培养基的方法和一种使用包含人血清的培养基的方法。使用基础培养基的方法包括在含大量细胞因子如生长激素的培养基中培养干细胞，如此该方法是麻烦且不经济的。还有，使用包含人血清的培养基的方法还包括使用通过重组方法制备的大量细胞因子和使用昂贵的人血清作为蛋白质源来进行培养，如此该方法是经济上低效的。
[0008]同时，干细胞可分类为成人干细胞(见于成人的各种组织和器官中)和胚胎干细胞(可从囊胚阶段(blastodermic stage)的细胞获得)。胚胎干细胞具有分化成各种细胞如神经细胞、血液细胞和胰腺细胞的全能性(pluripotency);然而,胚胎干细胞自人胚胎获得，如此受制于伦理问题。因此，不存在伦理问题的成人干细胞可容易地分离和培养，且能分化成各种细胞，如此，更多的关注将成人干细胞作为细胞治疗产品的材料。
[0009]可从多种组织分离成人干细胞，其为可分化成各种组织细胞如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、心细胞、肝细胞和神经细胞的未分化的干细胞。其中，源自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)是成人干细胞的一个代表性的例子。[0010]然而，当干细胞供体的年龄增长时，BM-MSC的数目和增殖效力降低，而且骨髓提取对供体引起很大疼痛。因此，试图从不同组织分离间充质细胞。由于最近有各种报告称间充质细胞可从成人或胚胎的外周血、脐带、胎盘和脐带血分离，因此从各种组织获得的间充质细胞作为新的细胞治疗产品的来源受到大量关注。
[0011]脐带包含血管和血管周围的结缔组织(称为Wharton’s jelly)。在妊娠期间，脐带的长度可以为约30cm至60cm，脐带的重量可以为约40g至约50g。而且，脐带包含用于供应给胎儿的充足量的营养物、干细胞和前体细胞。最近，已报告源自脐带的细胞具有BM-MSC特性。类似于骨髓和其他组织来源的间充质干细胞，脐带来源的干细胞表达细胞表面蛋白质如⑶73、⑶90、⑶105、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44和HLA-ABC，但不表达细胞表面蛋白质如⑶34和⑶45 (其为造血干细胞标志物)以及⑶14、⑶31、⑶33和HLA-DRa (其为组织相容性抗原)。此外，已报告从脐带分离的干细胞同时表达0ct4、Sox2、Nanog等胚胎干细胞标志物。
[0012]脐带来源的干细胞可分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，且比骨髓或脂肪来源的细胞在体外培养期间具有更好的有丝分裂活性。还报告脐带来源的干细胞可分化成心肌细胞和神经细胞。在这一方面，脐带是一种可供应干细胞用于临床应用的组织，且可用作细胞治疗产品。
[0013]然而，需要极大量的脐带来源的干细胞以有效使用脐带来源的干细胞。然而，可从脐带获得的干细胞数是有限的，而且许多干细胞在培养期间失去分化效力。然而，目前尚无已知的在基础培养基中有效分离和培养脐带来源的干细胞的方法。在研究解决该问题的各种办法时，发现当使 用脐带来源的提取物时可有效分离并培养脐带来源的干细胞，如此完成本发明。
[0014]发明概述
[0015]本发明的一个或多个实施方案包括一种制备脐带提取物的方法。
[0016]本发明的一个或多个实施方案包括一种血清替代物，其包含所述脐带提取物。
[0017]本发明的一个或多个实施方案包括一种细胞培养基，其包含所述血清替代物。
[0018]本发明的一个或多个实施方案包括一种从脐带分离脐带来源的干细胞(包含脐带提取物)的方法，和一种培养脐带来源的干细胞的方法。
[0019]其他方面将部分在以下说明中列出，部分根据说明书将是明显的，或者可通过实践所呈现的实施方案学到。
[0020]附图简述
[0021]这些和/或其他方面根据以下对实施方案的描述，连同所附附图将变得明显和更容易领会的:
[0022]图1是显示在不同搅动时间洗脱的蛋白质总量的图；
[0023]图2是显示当改变培养基时和不改变培养基时在不同时间洗脱的蛋白质总量之间的比较的图；
[0024]图3和4显示不同脐带大小时洗脱的蛋白质总量；
[0025]图5和6是显示在不同的缓冲液pH下洗脱的蛋白质总量和用于鉴定洗脱蛋白质之间差异的SDS-PAGE结果的图；
[0026]图7和8是显示根据洗脱方法洗脱的蛋白质总量的图；[0027]图9和10是显示从新鲜脐带组织和从冷冻脐带组织洗脱的蛋白质之间差异的图；
[0028]图11是显示缓冲液的量不同时洗脱的蛋白质总量的图；
[0029]图12、13和14是显示脐带提取物(UCE)细胞因子的定量分析结果的图；
[0030]图15、16、17和18是显示根据基础培养基中培养添加物不同时的细胞增殖的图和照片；
[0031]图19和20是显示在包含脐带提取物的基础培养基中培养骨髓和脐带来源的干细胞，处理间充质干细胞标志物，和实施荧光激活的细胞分选器(FACS)分析的结果的图；
[0032]在这一方面，X轴指示强度而y轴指示细胞数(计数)。在图上写出的⑶标志物可基于X轴和I轴的变化区分。该图显示将在包含FBS的培养基中生长的细胞与在包含脐带提取物的培养基中生长的细胞进行比较；
[0033]图21和22是，将包含UCE的透明质酸衍生物(HAD)填充剂皮下注射给小鼠，再用苏木精和曙红染色后，显示的照片，当其中包含脐带提取物(UCE)时，更多的来自周围组织的细胞流入到填充剂中；
[0034]图23显示依照一个实施方案，根据基础培养基中脐带提取物的浓度，脐带来源的干细胞的增殖；
[0035]图24显示依照一个实施方案，在用脐带来源的胶原包被的培养皿中脐带来源干细胞的粘附和增殖(培养)增加；
[0036]图25显示用不同浓度的胶原包被的培养皿中培养的脐带来源干细胞数目的比较，以及2天后所增殖的脐带来源干细胞数目的比较；
[0037]图26显示常规的分离脐带来源干细胞的方法与依照本发明一个实施方案的分离脐带来源干细胞的方法进行比较的结果；
[0038]图27显示依照图26中所示6种方法分离和培养的细胞的图像；
[0039]图28显示在分离脐带来源的干细胞后15天回收的总细胞数；
[0040]图29显示依照图26中所示6种分离和培养方法而分离和培养的免疫指示物的比较性分析结果；
[0041]在这一方面，X轴指示强度而y轴指示细胞数(计数)。在图上写出的⑶标志物可基于X轴和I轴的变化区分；
[0042]图30显示了从3位不同供体的脐带分离的提取物中507种人细胞因子、趋化因子、生长因子等的细胞因子阵列结果，还列出了每份脐带中含量最大的10种细胞因子；
[0043]图31显示3份不同脐带的提取物中共有的材料的比较图。共有且含量最大的细胞因子是IGFBP-7、脂笼蛋白-1 ；
[0044]图32显示3份不同类型的脐带中鉴定出的62种人细胞因子，按含量最大到最小的顺序显示。
[0045]图33描述了 10种细胞因子的功能，所述细胞因子在人体中具有公知的功能。
[0046]图34和35是比较脐带提取物中和包含10% FBS的培养基中连续传代培养的干细胞之间的干性维持(sternness maintenance),其中比较了在初始传代培养期间和在10轮传代培养后干细胞的倍增时间(Td)；
[0047] 图36显示，用表达胚胎干细胞(ESC)特异性标志物的脐带提取物，从脐带组织分离的脐带来源干细胞(UC-MSC)；
[0048]图37显示，从3位不同供体的脐带提取物分离的所有干细胞对于⑶29、⑶73、CD90、CD105和CD166(都是间充质干细胞特异性细胞表面标志)为阳性，而对于CD34和CD45为阴性；
[0049]图38显示，在用脐带提取物培养干细胞期间，可见于干细胞分离的初始阶段的胚胎干细胞特异性标志物在将FBS添加到培养基时不再表达，但在将脐带提取物添加到培养基时维持。
[0050]发明详述
[0051]现将对实施方案进行详细提述，其中的实施例已例示在所附附图中，其中贯穿本文类似的参考数字指类似的要素。在此方面，本发明的实施方案可具有不同的形式且不应理解为对本文列出的说明限制性的。因此，通过提及附图仅在下文描述实施方案以解释本发明的方面。如本文中使用的，术语“和/或”包括一种或多种所列关联项目的任意和所有组合。表述如“至少一种”处于一组要素之前时，修饰整个要素组而非该组的单个元件。
[0052]本发明提供一种制备脐带提取物(UCE)的方法。
[0053]本发明提供一种制备哺乳动物UCE的方法，依照一个实施方案，所述方法包括切割脐带；将脐带放置到缓冲液中；搅动使该脐带浸满缓冲液；并离心从所述搅动获得的产物以获得上清液如UCE。 [0054]本发明提供分离以下物质的常规方法的改进方法:生长因子、细胞因子、趋化因子和结合于胞外基质的糖蛋白如糖胺聚糖(GAG)，所述方法通过相对简单的操作尽可能多地获得活细胞和天然态细胞的有用成分。
[0055]本发明的方法可依照以下过程详细描述:
[0056]首先，所述方法包括切割脐带。
[0057]依照一个实施方案，首先切割脐带。依照一个实施方案，切割脐带增加缓冲液和脐带组织之间的接触表面以促进可用材料从脐带组织的洗脱。
[0058]可用在实施方案中的脐带包括各种哺乳动物的脐带。所述哺乳动物优选地是人、猪、马、牛、小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、山羊和绵羊，更优选地是人、猪、马和牛，最优选地是人。
[0059]可通过本领域中已知的各种方法实施脐带切割。
[0060]依照一个实施方案,将脐带切成长度为约0.5cm至约3.0cm,更优选地约0.7cm至约2.5cm,而更优选地约Icm至约2cm。
[0061]具体地,所述UCE可优选从脐带组织华通氏胶(Wharton’s jelly)中提取。在此方面，所述方法可另外包括从脐带除去血和/或血管。
[0062]之后，所述方法可包括将切割的脐带放置到缓冲液中。
[0063]将切割的脐带放置到缓冲液中。本领域中使用的缓冲液/物可以是任何具有缓冲能力的缓冲液/物，并且可以是例如乙酸钠、磷酸钠、甘氨酸-HC1、Tris-HCl和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。更具体地，PBS可以以约2至约11，更优选地约4至约10，更优选地约5至约8，且更优选地约6.8至约7.6的pH使用。
[0064]没有具体限制用于浸没切割的脐带的缓冲液量，且优选地可以是具有脐带重量约2至约5倍，更优选地约2至约4倍，更优选地约2.5倍至约3.2倍重量的缓冲液。还有，切割的脐带在放置到缓冲液中之前可用合适溶液(例如缓冲液)清洗。[0065]之后，所述方法包括搅动浸透在缓冲液中的脐带。
[0066]依照一个实施方案，所述搅动可在约4°C至约10°C，且优选地约4°C至约6°C的温度进行。还有，所述搅动可实施约7小时至约24小时，优选地约12小时至约24小时，且更优选地约18小时至约24小时。
[0067]可以使用本领域已知的各种方法来进行搅动，而且可使用磁条来搅动。
[0068]之后，将从搅动获得的产物离心以获得作为UCE的上清液。
[0069]将从搅动获得的产物离心以最终获得作为UCE的上清液。该上清液包含各种有用的蛋白质如生长因子和细胞因子(结合于胞外基质)。
[0070]依照一个实施方案，所述离心可在约3，OOOrpm至约6，OOOrpm,更优选地约
4,OOOrpm至约4，500rpm进行。所述离心可在约4°C至约10°C,更优选地约4°C至约6°C的温度进行。依照一个实施方案，所述离心可进行约2分钟至约30分钟，优选地约5分钟至约20分钟，更优选地约10分钟至约15分钟。
[0071]本发明提供依照一个实施方案的方法制备的UCE。
[0072]依照一个实施方案，所述UCE包含胰岛素样生长因子结合蛋白-7 (IGFBP-7)、脂笼蛋白(Iipocallin)-1、CXCL14、瘦素(L印tin)R、IL_23、MIP_la、血管生成素、血小板反应蛋白(Thrombospondin)-2、IL-29、IL-4R 等(图 31)作为主要成分。
[0073]UCE的主要细 胞因子以与抗血管发生、抗凋亡、生长和炎症有关的效果著称。
[0074]本发明提供包含UCE的血清替代物。
[0075]如本文中使用的，术语“血清”指在除去纤维素后血浆的剩余部分。血清常规用于在建立体外动物细胞培养系统以后促进动物细胞的增殖。
[0076]如本文中使用的，术语“血清替代物”指可用于获得与血清相同或相似效果的材料，且可以是可获得相同或很好的效果而没有使用血清如胎牛血清(FBS)的材料。
[0077]UCE可以是依照常规方法获得的UCE ;然而，优选地UCE可为依照上述实施方案获得的UCE。更具体地，优选从脐带除去血以排除血清成分。
[0078]所述血清替代物可应用于所有可使用血清的领域。更具体地，血清替代物可用于培养细胞，更优选地用于培养动物细胞。所述干细胞可以是任何类型的干细胞，如成人干细胞、间充质干细胞、去分化的干细胞或组织来源的干细胞。
[0079]本发明提供包含血清替代物的细胞培养基。
[0080]依照一个实施方案，所述细胞培养基可包含各种动物细胞，优选哺乳动物细胞，更优选人、猪、马、牛、小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、山羊和绵羊细胞，更优选地是人、猪、马和牛细胞，最优选地是人细胞。
[0081 ] 依照一个实施方案，所述细胞培养基可应用于干细胞培养。如本文中使用的，所述干细胞不受限制而且是具有干细胞特性的细胞，即能分化、不受限的增殖、并分化成特定细胞的细胞。所述干细胞可包括全能干细胞和多能(multipotent)干细胞，包括胚胎干(ES)细胞和胚胎生殖(EG)细胞。优选地，所述干细胞可以是脐带来源的干细胞(UC-MSC)。
[0082]依照一个实施方案，所述细胞培养基是血清替代物，且除了包含UCE以外，还可包含用于培养动物细胞的培养基的基础成分。例如，本发明的细胞培养基可基于以下培养基制备:Eagles’ s 最小基本培养基(EMEM) (EMEM, Eagle, H.Sciencel30:432 (1959))、a -MEM(Stanner, C.P.等，Nat.New Biol.230:52 (1971))、Iscove's MEM(Iscove, N.等，J.Exp.Med.147:923 (1978))、培养基 199 (Morgan 等，Proc.Soc.Exp.Bi0.Med.,73:1 (1950))、CMRL1066、RPMI1640 (Moore 等，J.Amer.Med.Assoc.199:519(1967))、F12(Ham, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA53:288 (1965))、FlO (Ham, R.G.Exp.Cell Res.29:515 (1963))、Eagle’s培养基的 Dulbecco’s 修改(DMEM)(DMEM, Dulbecco, R.等，Virology8:396(1959))、DMEM 和 F12 的混合物(Barnes, D.等，Anal.Biochem.102:255 (1980) )、Way-mouth’sMB752/1 (ffaymouth, C.J.Natl.Cancer Inst.22:1003(1959))、McCoy，s5A (McCoy, T.A.,等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.100:115(1959))和 MCDB 系列(Ham, R.G.等，体外14:11(1978))。
[0083]依照另一个实施方案，提供用于组织修复的填充剂，所述填充剂包含UCE。
[0084]术语“用于组织修复的填充剂”指用于有效遮盖皮肤上的皱纹和细纹的医学组合物或化妆用组合物。
[0085]依照一个实施方案，用于组织修复的填充剂除了包含UCE以外包含填充剂的基础成分，优选为胶原、透明质酸、聚丙烯酰胺凝胶、artecoll、autologen(自体胶原)或聚甲基丙烯酸酯、和胶原混合物。 [0086]依照一个实施方案，所述填充剂可包含蜡、弹性体(elastomer)、高级醇、表面活性剂、油、粉末、湿润剂、水性聚合物、皮肤防护剂、防腐剂和/或香料(scent)。
[0087]还有，所述UCE可通过常规方法获得，且优选地可通过上述实施方案获得。具体地，优选从脐带除去血以排除血清成分。
[0088]依照另一个实施方案,提供包含UCE的敷料(dressing)。
[0089]如本文中使用的，术语“敷料”指应用于人或动物身体的一部分供临床或美学皮肤处理的药物组合物。优选地，所述敷料用于处理受损的皮肤、皮肤损伤和皮肤表面上的随机遮断物(interruption)(例如皮肤溃疡、烧伤、切口、刺破、裂开的伤口、钝性伤、痤疮损伤和市)。所述敷料可包括贴剂(patch)、硬膏剂(plaster)、绷带或纱布用于彻底运输药物。优选地，敷料可应用于身体的内部组织和外部组织，更优选地应用于身体表面。
[0090]还有，所述UCE可通过常规方法获得，且优选地可通过上述实施方案获得。具体地，优选从脐带除去血以排除血清成分。
[0091]依照另一个实施方案，提供一种包含UCE的抗皱或抗老化化妆用组合物。
[0092]依照一个实施方案，所述化妆用组合物可用于改进各种皮肤状况。优选地，本发明的化妆用组合物可对抗皱或抗老化有效。
[0093]依照一个实施方案，所述化妆用组合物中包含的生长因子以外的成分是常规包含在化妆用组合物中的活性成分，且所述成分可以是常规的补充物如稳定剂、溶解剂(dissolution agent)、维生素、染料、香料和载体。
[0094]依照一个实施方案，所述化妆用组合物可制备成本领域中的任何常规制剂，其可以是但不限于，溶液、混悬剂、乳剂、糊剂、凝胶、乳膏、洗剂(lotion)、粉剂(powder)、阜(soap)、含表面活性剂的清洁剂、油、粉底(powder foundation)、乳液打底(emulsionfoundation)、腊打底(wax foundation)和喷剂，且更具体地，爽肤水(skin toner)、滋养性爽肤水、滋养霜(nourishing cream)、按摩乳膏(massage cream)、精华、眼霜、清洁霜(cleansing cream)、清洁水(cleansing water)、面膜(facial mask)、喷雾(spray)或粉。
[0095]依照一个实施方案，当所述制剂是糊剂、乳膏或凝胶时，可使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮(silicone)、膨润土、二氧化硅、滑石、或锌氧化物作为载体的组分。
[0096]依照一个实施方案，当所述制剂是粉剂或喷剂时，可使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、或聚酰胺粉作为载体的组分。更具体地，当所述制剂是喷剂时，可包含推进物如氯氟烃、丙烷/ 丁烷、或二甲醚作为载体的组分。
[0097]依照一个实施方案，当所述制剂是溶液或乳剂时，可使用溶解剂或破乳剂作为载体的组分，其例子包括水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、
I,3- 丁二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或山梨聚糖的脂肪酸酯。
[0098]依照一个实施方案，当所述制剂是混悬剂时，可使用液体稀释剂如水、乙醇和丙二醇；悬浮剂如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯(polyoxyethylenesorbitol ester)和聚氧乙烯山梨聚糖酯；微晶纤维素；氢氧化招氧化物(aluminummeta-hydroxide);膨润土 ；琼脂；或黄苗胶。
[0099]依照一个实施方案，当所述制剂是含表面活性剂的清洁剂时，可使用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、硫化琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐(isethionate)、咪唑啉(imidazolinium)衍生物、甲基taurate、肌氨酸盐(sarcosinate)、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烃基酰氨基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、乙氧基化的甘油脂肪酸酯、羊毛脂衍生物、或乙氧基化的甘油脂肪酸酯作为载体的组分。
[0100]依照另一个 实施方案，提供一种从脐带分离干细胞的方法。
[0101]依照另一个实施方案，提供一种从哺乳动物脐带分离干细胞的方法，所述方法包括将将分块(morcellated)的脐带组织连同包含哺乳动物UCE的细胞培养基组合物放置到细胞培养容器中；将所述脐带组织用干细胞分离酶处理；并从脐带组织分离干细胞。
[0102]所述哺乳动物可以是人、猪、马、牛、小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、山羊和绵羊。
[0103]所述组织可选自下组:脂肪、脐带、肝和骨膜。
[0104]所述细胞培养容器可以是用细胞粘附蛋白包被的细胞培养容器。在这一方面，细胞粘附蛋白可以是但不限于，哺乳动物脐带来源的胶原、明胶、纤连蛋白、核纤层蛋白或聚-D-溶素。
[0105]所述哺乳动物脐带来源的胶原可通过一种制备哺乳动物脐带来源的胶原的方法制备，所述方法包括(i)将用过氧化氢处理的哺乳动物脐带组织磨碎；(ii)将脐带组织用乙酸和胃蛋白酶处理，然后将其离心；(iii)设定从离心获得的上清液的PH并向其添加NaCl以浸没胶原；并(iv)分离浸没的胶原。
[0106]在依照一个实施方案的从哺乳动物脐带分离干细胞的方法中，优选在实施过程
(i)后实施过程(ii)约I至约3天。
[0107]过程(ii)的干细胞分离酶可以是胶原酶，更优选地是I型胶原酶。更优选地，在过程(ii)中，以高达约180U/ml至约220U/ml的量包含I型胶原酶且可以处理约2小时至约6小时。
[0108]还有，优选依照上文实施方案中所述方法来制备UCE。
[0109]依照另一个实施方案，提供一种通过使用UCE来培养干细胞的方法。
[0110]依照另一个实施方案，通过一种培养干细胞的方法，所述方法包括向干细胞培养基添加UCE，并通过使用该干细胞培养基在细胞培养容器中培养干细胞。[0111]细胞培养容器可用细胞粘附蛋白包被。所述干细胞可以是组织来源的干细胞。而且，所述干细胞可以是动物干细胞，更优选地是人来源的干细胞。还有，所述干细胞可以是任何类型的干细胞如成人干细胞、间充质干细胞、去分化的干细胞和组织来源的干细胞。
[0112]还有，所述细胞粘附蛋白可以是胶原、明胶、纤连蛋白、核纤层蛋白或聚-D-溶素，但细胞粘附蛋白不限于此。
[0113]所述组织可选自下组:脂肪、脐带、肝和骨膜，但组织不限于此。
[0114]所述干细胞培养基不能包含血清。
[0115]还有，所述干细胞可以是任何动物干细胞，可以是ES细胞、成人干细胞和去分化的干细胞，并且可以是其中至少一种来自下组的基因表达的细胞:0ct4、Sox2、KLF4和Nanog。更具体地,所述细胞可持续表达至少一种选自下组的基因:0ct4、Sox2、KLF4和Nanog，其为ES细胞特异性基因，即使在细胞传代培养时也如此。
[0116]还有，所述干细胞可对⑶29、⑶73、⑶90、⑶105和⑶166为选择性阳性的，而对⑶34和⑶45为选择性阴性的。
实施例
[0117]<实施例1>比较不同搅动时间的蛋白质洗脱总量
[0118]将脐带切成约0.5cm至约2.0cm的长度，用PBS (pH7.0)清洗2次或更多次，以脐带重量3倍的重量向其加入PBS，在4°C的温度搅动约30分钟至约24小时而不替换PBS，然后搅动约24小时至约200小时同时替换PBS以获得中间产物。将对中间产物在4，500rpm和4°C离心10分钟所收集的上清液用作脐带来源的提取物(脐带提取物，UCE)，然后进行Bradford分析来量化蛋白质。
[0119]随着搅动时间增加，洗脱的蛋白质的量也增加，在搅动7小时后洗脱平均为约
2.5ug/ml的蛋白质,在搅动24小时后洗脱平均为约2.7ug/ml的蛋白质(图1)。
[0120]还有，从搅动开始点到搅动后24小时，洗脱的蛋白质的量随着时间增加；然而，当搅动(UCE)同时替换PBS时，洗脱的蛋白质的量在从搅动开始点60小时后快速降低(图2)。
[0121]<实施例2>比较不同脐带大小的蛋白质洗脱总量
[0122]将脐带切成约0.5cm至约2.0cm的长度(图3)，用PBS(pH7.0)清洗2次或更多次，以脐带重量3倍的重量向其加入PBS，然后在4°C的温度搅动4天。将对中间产物在4，500rpm和4°C离心10分钟所收集的上清液用作脐带来源的提取物(UCE)，然后进行Bradford分析来量化蛋白质。脐带大小不同，洗脱的蛋白质总量未有太多变化，而当搅动同时替换PBS时，洗脱的蛋白质的总量快速降低(图4)。
[0123]<实施例3>比较不同缓冲液pH的蛋白质洗脱总量
[0124]将脐带切成约0.5cm至约2.0cm的长度，以脐带重量3倍的重量向其加入PBS(pH2、pH7、或pHll)，然后在4°C的温度搅动24小时以获得中间产物。将中间产物在4，500rpm和4°C离心10分钟，将从其获得的上清液用作脐带来源的提取物(UCE)。然后进行Bradford分析来量化蛋白质。
[0125] 当使用pH2的PBS时，总共洗脱47.2mg(2.36mg/ml)的蛋白质，而当使用pH7的PBS时，总共洗脱49mg (2.45mg/ml)的蛋白质，而当使用pHlI的PBS时，总共洗脱43.8mg(2.19mg/ml)的蛋白质。如此，可以得出结论，PBSpH不同,洗脱的蛋白质总量没有很大不同(图5)，但当使用pH2的PBS时，搅动后产物的粘度增加。
[0126]还有，当在每份已进行蛋白质定量的UCE上实施十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶考马斯染色时，UCE的蛋白质条带彼此相似(图6)。
[0127]<实施例4>比较不同洗脱方法的蛋白质洗脱总量
[0128]将脐带切成约0.5cm至约2.0cm的长度，然后用PBS (pH7.0)清洗2次或更多次，向约8g脐带加入15ml PBS并匀浆化，搅动(在4°C温度24小时)或温育(在37°C温度24小时)以获得中间产物。将中间产物在4，500rpm和4°C离心10分钟，并将从其获得的上清液用作UCE,通过Bradford分析来量化蛋白质。
[0129]经匀衆，总共洗脱27.3mg(l.95mg/ml)的蛋白质，经搅动，总共洗脱
30.72mg(3.61mg/ml)的蛋白质，经培养，总共洗脱19.34mg(2.28mg/ml)的蛋白质。因此,可以得出结论，当在4°C搅动时，洗脱最大量的蛋白质(图7)。
[0130]还有，当在上述条件下对经蛋白质定量的UCE进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶考马斯染色时，UCE的蛋白质条带彼此相似(图8)。
[0131]因此得知，4°C搅动是一种获得大量蛋白质，同时防止在匀浆和37°C培养期间可能发生的蛋白质变性和蛋白质稳定性降低的方法。
[0132]<实施例5>比较储存脐带组织的不同方法的蛋白质洗脱总量
[0133]将脐带切成约0.5cm至约2.0cm的长度，然后用PBS (pH7.0)清洗2次或更多次，向约Ilg脐带加入约33ml PBS,搅动(在4°C温度24小时)或冷冻(在-80°C 6天)，然后搅动(在4°C温度24小时)以获得中间产物。将中间产物在4，500rpm和4°C离心10分钟，并将从其获得的上清液用作UCE，通过Bradford分析来量化蛋白质。
[0134]冷冻的脐带比新鲜脐带多洗脱了约7mg蛋白质(图9)。然而，在上述条件下经蛋白质定量后的UCE进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶考马斯染色后，UCE的蛋白质条带彼此相似(图10)。
[0135]<实施例6>比较不同缓冲液的量的蛋白质洗脱量
[0136]将脐带切成约0.5cm至约2.0cm的长度，然后用PBS (pH7.0)清洗2次或更多次，向约Ilg脐带加入约22ml (1:2)、约33ml (1:3)、或约55ml (1:5) PBS,并在4°C搅动24小时。将脐带在4，500rpm和4°C离心10分钟，将从其获得的上清液用作UCE，然后通过Bradford分析来量化蛋白质。
[0137]当切割的脐带在具有2倍脐带重量的PBS中搅动时，总共洗脱53.76mg(3.16mg/ml)的蛋白质，在具有3倍脐带重量的PBS中搅动时，总共洗脱64.23mg(2.47mg/ml)的蛋白质，在具有5倍脐带重量的PBS中搅动时，总共洗脱73.78mg(l.48mg/ml)的蛋白质，如此，可以得出结论，当PBS的量增加时，洗脱的蛋白质的总量也增加(图11)。当PBS的总量增加时，蛋白质的总量也增加，但最终UCE的蛋白质浓度降低。如此，需要另外的浓缩过程来产生最佳浓度的蛋白质，而在此过程中洗脱的蛋白质可能损失掉。
[0138]<实施例7>对UCE主要蛋白质的定性和定量分析
[0139]为了分析UCE中包含的蛋白质中主要成分如生长因子、趋化因子和细胞因子的类型和比较量，使用能分析507种不同类型蛋白质的RayBio人细胞因子阵列试剂盒。3位供体捐献了 Img的3种不同类型的UCE，将其经膜处理后进行反应。从中测出的点用MultiGauge程序分析点强度。
[0140]其结果显示于附图和表中。
[0141]图30显示了从3位不同供体的脐带分离的提取物中507种不同类型的人细胞因子、趋化因子和生长因子的细胞因子阵列结果，还显示了不同供体的提取物中10种含量最大的细胞因子。
[0142]图31是一种比较性定量图，其显示从3份不同脐带分离的提取物中共有的材料。共有且含量最大的材料是IGFBP-7、脂笼蛋白-1等。
[0143]图32连续显示3份不同类型脐带中鉴定出的62种人细胞因子，含量从最大到最小。
[0144]图33描述了 10种细胞因子的功能，所述细胞因子在人体中具有公知的功能。
[0145]对UCE中42种公知的细胞因子类型进行定量分析。lmg/ml的UCE样品与42种细胞因子类型进行抗体-抗原反应，其使用MILLIPLEX?Human细胞因子/趋化因子面板(42重:EGF, Eotaxin, FGF-2, Flt_3Ligand, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO, IFN α 2, IFNy , IL-lra, IL-1 α，IL-1 β，IL-2, sIL_2Ra，IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p40)，IL-12(p70)，IL-13, IL-15, IL-17, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC, MIP-1 a，MIP-1β，PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, sCD40L, TGF a，TNF a，TNF β 和 VEGF ;Mi I lipore 的产品)，然 后使用Luminex200系统进行定量分析。
[0146]作为细胞因子定量分析的结果，鉴定出平均1，400pg/ml的FGF_2、1，480pg/ml的G-CSF、860pg/ml 的 MCP_l、900pg/ml 的 GR0、700pg/ml 的 IL-1ra 和 620pg/ml 的 IP-10 是提取的细胞因子中的主要成分(图12)。
[0147]<实施例8>基础培养基中培养添加物不同时的细胞增殖
[0148]将其中除去血清的UCE以0、0.1,0.2,0.5、或lmg/ml的浓度处理。作为对照组，在包含10%血清(SH30919.03，Hyclone的产品)的培养基中，培养UC-MSC、骨髓来源的干细胞(BM-MSC)和皮肤成纤维细胞，然后每2天进行10% WST-1测定(EZ-3000，Daeillab的产品)达总共7天。加入WST-1测定试剂使得该试剂为培养基的10%，在与培养条件相同的条件下反应约I小时，并测量450nm处的吸光度。
[0149]WST-1测定的结果是，当在基础培养基中以不同浓度UCE处理时，发现浓度为
0.2mg/ml时UC-MSC、BM-MSC和皮肤成纤维细胞的细胞增殖速率与含10% FBS的培养基中的细胞相同，而当UCE以0.5mg/ml或更高浓度处理时，增殖的细胞比含10% FBS的培养基中的更多(图15-17)。
[0150]还有，发现在包含UCE的基础培养基中生长的细胞在细胞培养期间具有比含10%FBS的培养基中生长的细胞形态更小(图18)。
[0151]<实施例9>维持UCE中干细胞的分化效力
[0152]在包含10% FBS和0.2mg/ml UCE的培养基中，培养骨髓和UC-MSC，将从其获得的产物用间充质干细胞标志物处理，然后进行荧光激活的细胞分选器(FACS)分析。
[0153]FACS分析的结果是，发现在包含UCE的基础培养基中培养的干细胞维持间充质干细胞特异性细胞表面标志物，如此，发现这些干细胞不显示诸如分化等干细胞特性的变化(图 19 和 20)。
[0154]还有，以3天的倍增时间的间隔使用UCE进行干细胞的连续传代培养，比较这些干细胞与含10% FBS的培养基中培养的干细胞的干性。
[0155]其结果显示于图34和35。图34和35显示在UCE中和在包含10% FBS的培养基中连续传代培养的干细胞之间的干性维持的实验结果比较，其中比较在初始传代培养期间和在10轮传代培养后干细胞的倍增时间(Td)值。
[0156]在包含0.3mg/ml UCE且没有10% FBS的培养基中生长的干细胞的增殖速率和Td与在包含10% FBS的培养基中生长的干细胞的增殖速率和Td没有很大不同，而且实际上以更高的速率增殖(小差异)。选择0.3mg/ml的UCE浓度从而干细胞可能显示与10% FBS中相似的增殖水平。这些干细胞的增殖比用更高浓度UCE处理的干细胞的增殖更快。
[0157]<实施例10>UCE和胶原的制备
[0158]将脐带切成约Icm至约2cm的长度，然后用Dulbecco的PBS (DPBS)清洗2次或更多次。接着，将脐带用70%乙醇溶液处理，在4°C温度反应I小时，然后用蒸馏水清洗2次或更多次以对脐带称重。随后，将脐带用具有脐带重量约3倍重量的DPBS处理，在4°C温度处理24小时，然后从其收集UCE。将收集的UCE通过使用直径0.22 μ m的最终滤器过滤，然后储存于4°C温度。 [0159]向剩余脐带加入3% H2O2溶液，然后在4°C温度处理约12小时至约24小时。接着，将剩余脐带用蒸馏水清洗2次或更多次直至泡沫消失。然后，将剩余脐带用重量为脐带重量约10倍的0.5M乙酸溶液处理，并通过使用搅动器和匀浆器将剩余脐带组织磨碎。将剩余脐带用基于重量10%的胃蛋白酶处理，然后在4°C温度反应24小时。将剩余脐带在10，OOOrpm和4°C温度离心30分钟。离心后，使用NaOH将从其获得的上清液的pH设为7以消除胃蛋白酶的活性。测量经PH调节的溶液的体积，然后用NaCl处理使得基于经pH调节的溶液的体积为2.4M。搅动经pH调节的溶液直至所有NaCl溶解然后在4°C温度竖立约12小时至约24小时直至胶原盐析和沉淀。将经pH调节的溶液在10，OOOrpm和4V温度离心30分钟后，分离盐析出的胶原团粒并称重。将胶原团粒在重量为胶原团粒重量10倍的蒸馏水中稀释，并通过超滤系统将稀释后的胶原团粒脱盐和浓缩。最后，将脱盐后的胶原团粒通过过滤除去微生物，冻干，然后储存。
[0160]从其收集的UCE通过Bradford分析来定量,如上述制备的胶原通过轻脯氨酸分析定量。
[0161]<实施例11>用UCE和胶原包被在基础培养基中培养细胞
[0162]将胶原以50μg/ml的浓度溶解于蒸馏水(D.W.)，然后在培养皿上于培养箱中处理I小时以便将其包被。在包被后，从其去除胶原溶液，用磷酸盐缓冲液清洗2次或更多次，在室温完全干燥，然后培养细胞。在基础培养基中以0、0.1和0.2mg/ml的UCE浓度处理来培养细胞，将包含10% FBS的培养基用作对照组，并每2天实施WST-1测定(EZ-3000，Daeillab产品)一共达7天来比较细胞生长。以10%向培养基添加WST-1测定试剂，然后在相同培养条件下反应约I小时，并测量450nm处的吸光度(图23和24)。
[0163]<实施例12>比较不同分离方法的细胞回收率和脐带干细胞的增殖
[0164]通过无Ca2+和Mg2+的DPBS除去脐带外部的血，除去外部羊膜，并从脐带除去2个动脉以比较下述6种细胞分离方法。
[0165]〈12-1〉第一种脐带干细胞分离方法
[0166]将组织用胶原酶处理，并将细胞培养在包含10% FBS的培养基中。具体地，将除去血的组织切成Imm3的大小，用包含200U/ml胶原酶I型的a-MEM处理5小时来分离细胞，且将2 X IO3个细胞布置于每Icm2的培养皿(包含α-ΜΕΜ，其中包含100U/ml的青霉素、
0.1 μ g/ml链霉素和10% FBS)以将细胞培养在培养箱中，其中在37°C的温度供应5%的CO2。
[0167]〈12-2〉第二种脐带干细胞分离方法
[0168]在用胶原酶处理组织后，将细胞培养在包含0.2mg/ml UCE的培养基中。具体地，将除去血的组织切成Imm3的大小，用包含200U/ml胶原酶I型的a-MEM处理5小时来分离细胞，且将2 X IO3个细胞布置于每Icm2的培养皿(包含α -ΜΕΜ，其中包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml链霉素和10% FBS)以将细胞培养在培养箱中，其中在37°C的温度供应5%的 CO2。
[0169]〈12-3〉第三种脐带干细胞分离方法
[0170]将组织培养在包含10% FBS的培养基中，将细胞培养在包含10% FBS的培养基中。具体地，将除去血的组织切成Imm3的大小，然后置于包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml链霉素和10% FBS的a -MEM中，将组织培养7天，当细胞表现为贴于底部时，将细胞用包含200U/ml胶原酶I型的α-ΜΕΜ处理4小时直至所有胞外基质溶解，然后将从其获得的产物离心并用PBS清洗以仅分离细胞。之后，将2Χ IO3个细胞布置于每Icm2的培养皿(包含α -ΜΕΜ，其中包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml链霉素和10% FBS)以将细胞培养在培养箱中，其中在37 °C的温度供应5 %的CO2。
[0171]〈12-4〉第四种脐带干细胞分离方法
[0172]将组织培养在包含0.2mg/ml UCE的培养基中，用胶原酶处理，然后将细胞培养在包含0.2mg/ml UCE的培养基中。具体地，将除去血的组织切成Imm3的大小，然后置于用胶原包被的皿中以将该细胞置于包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml链霉素和10% FBS的α-ΜΕΜ中，将组织培养7天，当细胞表现为贴于底部时，将细胞用包含200U/ml胶原酶I型的a -MEM处理4小时。之后，将2Χ IO3个细胞布置于每Icm2的胶原包被的培养皿(包含α -ΜΕΜ，其中包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml链霉素和10% FBS)以将细胞培养在培养箱中，其中在37 °C的温度供应5 %的CO2。
[0173]〈12-5〉第五种脐带干细胞分离方法
[0174]将组织培养在包含10% FBS的培养基中。具体地，将除去血的组织切成Imm3的大小，然后置于包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml链霉素和10% FBS的a -MEM中，然后在37°C温度供应5% CO2的培养箱中培养。
[0175]〈12-6〉第六种脐带干细胞分离方法
[0176]将组织培养在包含0.2mg/ml UCE的培养基中。具体地，将除去血的组织切成Imm3的大小，然后置于包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml链霉素和10% FBS的a -MEM中，然后在37°C温度供应5% CO2的培养箱中培养。
[0177]<实施例13>通过RT-PCR鉴定ES细胞标志物
[0178]将细胞团粒用无Ca2+和Mg2+的DPBS清洗，向其加入1ml裂解缓冲液(iNtRONBiotechnology产品),并依照可自iNtRON Biotechnology获得的手册中描述的方法从其分离总RNA。将I μ g RNA通过使用cDNA合成试剂盒(iNtRON Biotechnology产品)在20 μ L的反应溶液中逆转录，反应溶液包含反应缓冲液、ImM dNTP混合物、0.5 μ g/ μ L oligo (dT) 15、20U RNase抑制剂和20U of AMV逆转录酶。反应在42 °C温度进行60分钟。将从其获得的RT产物(cDNA)进行PCR，其通过使用2X PCR Master混合溶液试剂盒(iNtRON Biotechnology产品)，包含10 μ L的反应溶液，反应溶液包含IX Taq缓冲液、0.25U Taq聚合酶、IOpM有义和反义基因特异性引物。扩增一共进行32个循环且每个循环包括94°C 30秒的变性，退火30秒，和在72°C温度的30秒延伸。在完成反应后，将从其获得的PCR产物加载到2%琼脂糖凝胶中用于电泳。电泳后将凝胶用溴化乙锭染色，并通过使用紫外线获得DNA图像。
[0179][表1]
[0180]弓丨物的DNA序列信息
[0181]
【权利要求】
1.一种制备哺乳动物脐带提取物的方法，所述方法包括: 切割脐带； 将该脐带放到缓冲液中； 搅动浸在缓冲液中的脐带； 并离心从所述搅动获得的产物以获得上清液。
2.依照权利要求1制备的脐带提取物。
3.权利要求2的脐带提取物，其中所述脐带提取物包含胰岛素样生长因子结合蛋白-7(IGFBP-7)、脂笼蛋白-1、CXCL14、瘦素R、IL-23、MIP_la、血管生成素、血小板反应蛋白-2、IL-29和IL-4R的蛋白。
4.一种包含脐带提取物的血清替代物。
5.权利要求4的血清替代物，其中所述脐带提取物是依照权利要求1的方法制备的。
6.一种细胞培养基,其包含权利要求4的血清替代物。
7.权利要求6的细胞培养基，其中所述细胞是动物细胞。
8.权利要求7的细胞培养基，其中所述动物细胞是干细胞。
9.权利要求8的细胞培养基，其中所述干细胞是脐带来源的干细胞。
10.一种用于组织修复的填充剂，其包含脐带提取物。
11.权利要求10的用于组织修复的填充剂，其中所述脐带提取物是依照权利要求1的方法制备的。
12.一种从哺乳动物脐带分离干细胞的方法，所述方法包括: 将分块的脐带组织与包含哺乳动物脐带提取物的细胞培养基组合物放置到细胞培养容器中； 将所述脐带组织用酶处理；并 从所述脐带组织分离干细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述细胞培养容器用细胞粘附蛋白包被。
14.权利要求12的方法，其中所述细胞粘附蛋白选自下组:哺乳动物胎盘来源的胶原、明胶、纤连蛋白、核纤层蛋白和聚-D-溶素。
15.—种培养干细胞的方法，所述方法包括: 向干细胞培养基添加脐带提取物；并 通过使用所述干细胞培养基在细胞培养容器中培养干细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述细胞培养容器用细胞粘附蛋白包被。
17.权利要求15的方法，其中所述干细胞是组织来源的干细胞。
18.权利要求16的方法，其中所述组织选自下组:脂肪、脐带、肝和骨膜。
19.权利要求15的方法，其中所述干细胞培养基不包含血清。
20.权利要求15的方法，其中所述细胞粘附蛋白选自下组:哺乳动物胎盘来源的胶原、明胶、纤连蛋白、核纤层蛋白和聚-D-溶素。
21.权利要求15的方法，其中所述干细胞是表达至少一种选自下组的基因的细胞:0ct4、Sox2、KLF4 和 Nanog。
22.权利要求15的方法，其中所述干细胞对于⑶29、⑶73、⑶90、⑶105和⑶166是选择性阳性的，而对于CD34和CD45是选择性阴性的。
23.权利要求15的方法，其中当通过使用脐带提取物来培养所述干细胞时，所述干细胞甚至在传代培养时均持续表达至少一种选自下组的基因:0ct4、Sox2、KLF4和Nanog，所述基因都是胚胎干细胞特异性基因。
【文档编号】C12N5/074GK103998048SQ201280044164
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2011年7月11日
【发明者】崔容秀, 金仙美, 李荣濬 申请人:车比奥及戴奥斯泰有限公司