与奶牛乳脂率性状相关的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种动物分子标记，具体涉及奶牛TRAPPC9基因片段的克隆及作为分子标记的应用。所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.1所示，在第204位有1个T204-G204碱基突变，导致奶牛乳脂率性状出现多态性。
【专利说明】与奶牛乳脂率性状相关的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物分子标记领域，具体地说，涉及一种与奶牛乳脂率性状相关的TRAPPC9基因作为分子标记的应用。
【背景技术】
[0002]乳脂是存在于乳汁中的一种天然的高质量脂肪，相比于其他脂肪，乳汁更易被人体消化吸收，其消化率可达98%。在牛奶生产中，乳脂在牛奶中的含量越高牛奶的营养价值也越高。目前，乳脂率是衡量牛奶品质的一个重要指标，其含量的高低直接关系到奶牛生产的经济效益。
[0003]随着分子遗传学、分子生物学技术和数量遗传学的发展，分子遗传标记和标记辅助选择被广泛地应用到畜禽育种中，并取得了巨大的成就。Snap shot测序技术是一种基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目，其主要原理是将测序酶、四种荧光标记的ddNTP、紧邻多态位点的延伸引物和PCR产物模板按一定体系混合，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪检测，根据峰的颜色可以得知参与反应的碱基种内，从而判断样本在该位点的基因型。该方法具有分型准确、通量高、不受SNP位点多态性特性限制和样本个数限制等优点。
[0004]转运蛋白颗粒复合体9 (TRAPPC9, trafficking protein particle complex9)基因是人常染色体隐性精神发育迟滞智力障碍相关的基因，其编码的蛋白转运蛋白颗粒复合体9参与内质网到高尔基体的囊泡转移和神经细胞的分化，其编码的蛋白也叫做NIBP( NIKand IKK β-binding protein)，参与膜泡运输过程，同时具有增强TNF-α活化NF-κΒ信号通路的功能。NF-K B是重要的核转录因子，参与调控大量基因表达，在细胞生存、增殖、分化和凋亡过程中发挥着重要的生物学功能。目前关于TRAPPC9基因多态性对乳脂率的影响还没有报道。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与奶牛乳脂率性状相关的分子标记及其应用。
[0006]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种与奶牛乳脂率性状相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示，在第204位有I个T204-G204碱基突变，导致奶牛乳脂率性状出现多态性。
[0007]进一步地，所述碱基突变的位点位于TRAPPC9基因的第七内含子的57bp处。
[0008]本发明还提供了用于扩增所述分子标记的引物对，其核苷酸序列如下:
[0009]正向引物F:5 ’ -TCTTCTCTTTTGACCCTACAG-3 ’ ；
[0010]反向引物R:5’-GGTTTCAAGTTCTGACTCCAG-3’。本发明还提供了前述分子标记在中国荷斯坦奶牛乳脂率标记辅助选择中的应用。
[0011] 进一步地，所述应用包括如下步骤:[0012]I)取待检测奶牛的基因组DNA ；
[0013]2)以基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，获得中国荷斯坦奶牛TRAPPC9基因上274bp的目的片段；
[0014]3)利用SnaPshot技术检测PCR产物，如果扩增产物序列中204bp处为T，则待测奶牛属于乳脂率高的中国荷斯坦奶牛优势品种。
[0015]其中，所述步骤2)中PCR反应体系为25 μ L，其中IOOng/μ L基因组DNA模板I μ L，lOpmol/μ L 引物 F和 R各 I μ L，12.5μ L Premix TaqTM, 9.5 μ L ddH20。
[0016]其中，所述步骤2)中PCR反应条件为:95°C预变性IOmin ;94°C变性30s，60°C复性30s，72。。延伸30s，35个循环；72°C延伸IOmin ;降温至4°C保持。
[0017]其中，所述步骤3)中利用SnaPshot技术检测PCR产物，具体步骤为:取步骤2)获得的PCR产物3ul用ExoI和FastAP纯化，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的DNTP，纯化后利用SNP分型延伸引物进行延伸，延伸之后上机进行测序。如果测序结果如图1左图所示，为TT型，则待测奶牛属于高乳脂率的中国荷斯坦奶牛优势个体，出现如图1中图和右图所示，即TG或GG型，则为普通个体。
[0018]本发明通过对中国荷斯坦奶牛TRAPPC9基因的SNP位点进行基因分型，利用SAS9.1软件的GLM过程把基因分型结果与奶牛的乳脂率进行关联分析发现TT型个体的乳脂率极显著高于GG型个体(P〈0.05)。该位点的发现为进行分子育种提供了新的标记。
[0019]进一步地，所述SNP分型延伸引物的核苷酸序列为:
[0020]5’ -TTTTTTTTTTTTTTTTAGCAAAACCAGATGGACTTGTG-3’。
[0021]本发明还提供检测中国荷斯坦奶牛高乳脂率优势品种的试剂盒，所述试剂盒包括正向引物F、反向引物R、SNP分型延伸引物以及Premix TaqTM、Exo1、FastAP、ExoI buffer>Snapshot Mix中的一种或多种；
[0022]其中Premix TaqTM 由 dNTPs、DNA 聚合酶、Mg2+、PCR 缓冲液组成。
[0023]本发明的有益效果在于:
[0024]本发明所提供的SNP分子标记位点，首次在中国荷斯坦奶牛牛群中发现，且对乳脂率有极显著影响，为进行中国荷斯坦奶牛乳脂率标记辅助选择提供了新的素材和科学依据。
[0025]本发明提供的SNP分子标记不受年龄、性别等限制，可用于早期选育，加快育种进程；检测方法准确可靠，方便易行。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明中中国荷斯坦奶牛三种基因型SnaPshot测序分型图；其中，左图为TT型，中图为TG型，右图为GG型(通常峰图的基因型由颜色区分，其中绿色为TT型，黑色为GG 型)。
[0027]图2为三种基因型测序图；分别为TT型、TG型和GG型。
【具体实施方式】
[0028]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若无特殊说明，下述实施例中的技术手段均为本领域内常规手段，所用材料均从常规试剂公司购得。[0029]实施例1与中国荷斯坦奶牛乳脂率性状相关的SNP标记的获得及鉴定
[0030]1.1待测中国荷斯坦奶牛血液基因组DNA的提取
[0031]尾静脉采集待测中国荷斯坦奶牛血液，常温放置3-4小时待血液凝固，此时血液分为血清和凝血块两部分,血清呈清亮黄色,凝血块为暗红色,牛血液中只有白细胞内含有DNA，存在于凝血块中。
[0032]利用天根血液/细胞/组织基因组DNA样品提取试剂盒从凝血块中提取基因组DNA,具体步骤如下:
[0033]用眼科剪剪取0.2-0.3mL的凝血块放入已灭菌的2mL圆底离心管中，加入500 μ L的细胞裂解液CL ；
[0034]利用手持匀浆仪将血块充分匀浆，振荡15s，12000rpm离心lmin，弃去上层暗红色
上清液；
[0035]再次加入700 μ L细胞裂解液CL，充分振荡使下层沉淀散开悬浮，12000rpm离心lmin,弃去上清液；
[0036]加入200 μ L缓冲液GS，充分涡旋至沉淀充分悬浮；
[0037]加入20 μ L蛋白酶K和250 μ L缓冲液GB，充分混匀；
[0038]将离心管用封口膜封好放入到56°C杂交炉中消化3-4小时，为确保充分消化，消化过程中需要颠倒混匀数次，最终溶液变成清亮透明，简短离心；
[0039]加入200 μ L冰镇无水乙醇，上下颠倒混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀；
[0040]将上一步所得溶液转入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
[0041]向吸附柱CB3中加入500 μ L去蛋白缓冲液⑶，静置2min，12000rpm离心30s，弃
去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
[0042]向吸附柱CB3中加入700 μ L漂洗液PW, 12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
[0043]向吸附柱CB3中加入500 μ L漂洗液PW, 12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液；
[0044]将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，弃去废液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底挥发吸附柱上残余的乙醇；
[0045]将吸附柱转入至一个新的离心管中，加入100μ L56°C预热的TE缓冲液，室温放置5min, 12000rpm离心2min,基因组DNA则存在于离心管中。
[0046]1.2目的片段的扩增
[0047] 根据NCBI上提供的牛TRAPPC9基因序列，利用oligo6设计引物，包括正向引物F:5’ -TCTTCTCTTTTGACCCTACAG-3’ 和反向引物 R:5’ -GGTTTCAAGTTCTGACTCCAG-3’，以 1.1 中基因组DNA为模板进行PCR扩增，目的片段如SEQ ID N0.1所示序列，SNP位点位于204bp处，此处碱基为T或G。
[0048]PCR反应体系为25 μ L，其中IOOng/ μ L基因组DNA模板I μ L，IOpmoI/ μ L引物F和 R 各 I μ L,12.5 μ L Premix Taq?,9.5 μ L ddH20。
[0049]PCR 反应条件为:95 °C IOmin ；94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec，35 个循环；72°C IOmin ;4°C保持。
[0050]1.3基因分型[0051]利用SnaPshot技术进行基因分型，具体步骤如下:
[0052]PCR产物纯化:取1.2中得到的PCR产物用ExoI和FastAP纯化，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的DNTP。
[0053]反应体系为PCR 产物 3ul, ExoI0.2ul, FastAP0.8ul, ExoI buffer0.7ul，补水至7ul。
[0054]反应条件为37°C 15min，80°C 15min。
[0055]延伸反应:体系为已纯化PCR产物2ul，Snapshot Mix试剂lul，延伸引物混合2ul,补水至6ul。
[0056]条件为96°C lmin ；96°C IOsec, 52°C 5sec,60°C 30sec, 30 个循环；
[0057]取lul延伸产物，加IOul上样loading，95°C变性3min，立即冰水浴，上测序仪。
[0058]根据Snapshot测序结果判读基因型，如图1所示，由于延伸引物为反向引物，故测序结果左图为TT型个体，中图为GG型个体，右图为TG型个体。
[0059]为验证分型的准确性，分型完毕后取部分样品进行PCR扩增，将扩增产物送至测序公司进行测序，测序结果如图2所示:分别为TT型、TG型和GG型，测序结果与分型结果一致，说明分型结果准确可靠。
[0060]实施例2SNP位点与中国荷斯坦奶牛乳脂率的关联分析
[0061]本实施例中对中国北方地区不同奶牛养殖场的332头中国荷斯坦奶牛进行SNP分型，TRAPPC9基因如SEQ ID N0.1所示序列的204bp处分型结果如表1所示。
[0062]运用SAS9.1软件的GLM过程进行基因型与乳脂率之间的关联分析，模型如下:
[0063]Yiji=U +gi+hj+Pi+eij!,
[0064]其中，yijl为产奶性状的表型值；μ为总体均值；gi为基因型效应屯为场年季效应！P1为胎次效应；eul为随机残差。
[0065]表1SNP基因型在所研究群体中的基因频率及等位基因频率
基因型样品数量基因型频率等位基因频率
[0066]
【权利要求】
1.一种与奶牛乳脂率性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQID N0.1所示，在第204位有I个T204-G204碱基突变，导致奶牛乳脂率性状出现多态性。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述碱基突变的位点位于TRAPPC9基因的第七内含子的57bp处。
3.用于扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，其核苷酸序列如下:
正向引物 F:5’ -TCTTCTCTTTTGACCCTACAG-3’ ；
反向引物 R:5’ -GGITTCAAGTTCTGACTCCAG-3’。
4.权利要求1所述的分子标记在中国荷斯坦奶牛乳脂率标记辅助选择中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤: 1)取待检测奶牛的基因组DNA； 2)以基因组DNA为模板，利用权利要求3所述引物对进行PCR扩增，获得中国荷斯坦奶牛TRAPPC9基因上274bp的目的片段； 3)利用SnaPshot技术检测PCR产物，如果扩增产物序列中204bp处为T，则待测奶牛属于乳脂率高的中国荷斯坦奶牛优势品种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤2)中PCR反应体系为25μ L，其中 IOOng/μ L 基因组 DNA 模板 I μ L, lOpmol/μ L 引物 F 和 R 各 I μ L，12.5 μ L PremixTaqTM,9.5 μ L ddH20。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤2)中PCR反应条件为:95°C预变性IOmin ;94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸30s, 35个循环；72°C延伸IOmin ;降温至4°C保持。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤3)中利用SnaPshot技术检测PCR产物，具体步骤为:取步骤2)获得的PCR产物3ul用ExoI和FastAP纯化，纯化后利用SNP分型延伸引物进行延伸，延伸之后上机进行测序。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述SNP分型延伸引物的核苷酸序列为:5’ -TTTTTTTTTTTTTTTTAGCAAAACCAGATGGACTTGTG-3’。
10.一种检测中国荷斯坦奶牛高乳脂率的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:正向引物F、反向引物R、SNP分型延伸引物以及Premix TaqTM、Exo1、FastAP、ExoI buffer>Snapshot Mix中的一种或多种； 其中Premix TaqTM由dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、PCR缓冲液组成。
【文档编号】C12N15/11GK103911374SQ201410116914
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】俞英, 董易春, 王晓, 刘超 申请人:中国农业大学