一种巢式pcr数字定量方法
【专利摘要】本发明提供了一种巢式数字PCR定量方法，其特征是改进的巢式PCR及样本10倍稀释梯度分散至有限单元的数字PCR方法，包括下列步骤：在每个反应单元中预先加入矿物油,在矿物油下方加入1-5μL小体积的第一轮PCR混合液，所述混合液包括等体积的2×反应液和连续10倍稀释梯度的样本液，在第一退火温度下使用外侧引物进行第一轮扩增；随后在第一轮扩增产物中加入10-20倍于第一轮PCR体积的第二轮PCR反应液，在第二退火温度下使用内侧引物进行第二轮扩增；最后检测扩增产物，进行计数定量。本发明还提供了用于本发明的巢式数字PCR定量方法的基因检测试剂盒。
【专利说明】-种巢式PCR数字定量方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学及分子检验领域的核酸扩增【技术领域】，具体涉及通过改良 巢式PCR操作来消除其引物的非特异性扩增而进行样本10倍稀释梯度的数字扩增定量方 法领域。
【背景技术】
[0002] 所谓数字定量检测或数字化诊断是指确保阳性单个分子或单个以上分子均有检 测信号而定为1、阴性绝对无反应信号而定为〇的条件下，样本稀释、分散至大量的微型分 隔单元使每检测单元含0-1个靶分子，通过检测单元反应信号1计数而对靶分子进行定量 的方法，以便于计算机〇或1模式的自动化操作，但前提必须是检测方法本身对1个分子或 〇分子可靠区分。然而传统的化学反应、酶免疫反应等均是检测信号强度与待测分子含量成 线性比例且信号简单相加的低灵敏度检测方法，远远区分不了 1个靶分子和0个靶分子的 差别，所以都无法适用于数字化定量检测方法。
[0003] 上世纪80年代末诞生的核酸指数扩增的PCR技术，以其2T为扩增循环数）放 大倍数能检测低至数十乃至数个拷贝的靶分子，然而30个循环扩增的灵敏度仍不足以测 出1个靶分子和0个靶分子的区别，超过30个循环扩增又带来严重的非特异性及假阳 性；且这种第一代的终末/终点PCR不易定量，需要PCR后凝胶电泳来区分非特异性扩增 条带。随后两步扩增的巢式PCR应用（J Med Virol, 30-2:85)以超过40个循环扩增的 极高灵敏度为单个祀分子检测提供了可能，1992年，Sykes等人（Biotechniquesl3:444) 初步尝试了基于样本稀释和泊松分布计数的定量巢式PCR，并首次提出了数字化定量理 念，由于这类PCR系统内引物二聚体扩增和体系外气雾胶交叉污染的严重非特异性的局 限而限制了其进一步发展、应用。同年，Higuchi另辟溪径，同时扩增和"闭管"荧光检测 的实时荧光PCR方法，减少了 PCR后处理的交叉污染，而通过扩增曲线指数期测定来对应 初始模板数的相对定量，即进入指数期的扩增循环数与初始模板数呈反对数关系，但一般 采用荧光染料的实时荧光PCR仍然于30个扩增循环处产生引物二聚体的非特异性扩增， 从而干扰低浓度的靶分子定量。1997年，不与非特异性扩增杂交的系列探针法实时荧光 PCR(BioTechniques22:130-138)显著减少了非特异性反应，尤其以水解探针Taqman方法 逐步成熟而广泛应用于临床检验，已公认为第二代q-PCR定量PCR技术。但定量需要参考 品标准曲线或内标校正，对有限的标本材料如单细胞低丰度基因和野生高背景下的稀少突 变基因的准确定量仍存在一定的应用限制。
[0004] 1999年，Vogelstein & Kinzler报导微升级96孔板的致癌突变基因 ras定量PCR 及首创数字（digital) PCR概念（PNAS，USA 96:9236)，d-PCR是一种基于单分子PCR方法来 进行计数的第三代绝对定量PCR方法，采用分析化学领域的微流控或微滴化方法，将大量 稀释后的核酸溶液分散至微反应器单元或微滴中，每个反应单元的核酸模板数少于或等于 一个。经过PCR热循环反应之后，扩增产物与加入的荧光探针杂交，有一个核酸分子模板的 反应单元有扩增而给出荧光信号，没有模板的反应单元没有扩增而无荧光信号。根据稀释 比例和反应单元体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度，通过计数及泊松分布统计，就可 以实现起始DNA模板的绝对定量。实现数字（digital)PCR的关键：一是荧光探针特异杂 交来保证无（0)模板的反应单元无荧光信号；二是dPCR装置的反应单元足够多以保证检 测单元不多于一个模板，所以进一步缩微至微流控万级反应单元即纳升体积反应装置，以 及近年来微滴化百万级反应单元即皮升级体积装置（Anal. Chem. 2011，83:8604)的成熟而 开始走向应用。由于样本靶分子含量跨度非常大，浓度低的少于l〇°=lcopy/ml，浓度高的大 于lOtopies/ml，浓标本往往需要百万级反应单元即皮升体积微流控或微滴装置才能够分 配每个反应单元的核酸模板数少于或等于一个，这种追求反应单元的极致会导致应用普及 受限。甚至对某些过浓标本必须进行1至几个数量级预先稀释后才能使用百万级反应单元 d-PCR。因此，本领域中仍然需要一种操作简便，成本低廉而又灵敏度极高的PCR检测方法。
【发明内容】
[0005] 为了解决d-PCR非特异性局限和微流控或微滴化装置反应单元的极限。本发明提 供了一种一种巢式数字PCR定量方法，在传统巢式PCR方法的基础上进行了以下改进： 1. 使用预先矿物油封闭下两步加样和两步扩增的d-PCR方法，彻底杜绝引物二聚体 ro非特异性扩增； 2. 使用单孔或单管两步引物既进行稀释，并且使用不同的退火温度进行扩增，以保证 第一步扩增引物于第二步扩增时绝对失效； 3. 对样本先进行9个及以上数量级的10倍稀释，以及在此基础之上任选地增加一两 级的100倍稀释，再将每个数量级的稀释标本分配到有限个反应孔/反应单元，这样总共96 孔板、384孔板或聚二甲基硅氧烷微孔芯片就能取得百万级反应单元微滴化及微流控芯片 装置的功效。
[0006] 因此，根据本发明的第一方面，提供了一种巢式数字PCR定量方法，其特征是改进 的巢式PCR及样本10倍稀释梯度分散至有限单元的数字PCR方法，包括下列步骤：在每个 反应单元中预先加入矿物油，在矿物油下方加入1-5 μ L小体积的第一轮PCR混合液，所述 混合液包括等体积的2 X反应液和连续10倍稀释梯度的样本液，在第一退火温度下使用外 侧引物进行第一轮扩增；随后在第一轮扩增产物中加入10-20倍于第一轮PCR体积的第二 轮PCR反应液，在第二退火温度下使用内侧引物进行第二轮扩增；最后检测扩增产物，进行 计数定量。
[0007] 在本发明的一个具体实施方案中，所述第一退火温度为44°C_48°C，所述第二退火 温度为 56〇C -60〇C。
[0008] 在本发明的另一个具体实施方案中，所述外侧引物短于内侧引物。
[0009] 在本发明的另一个具体实施方案中，所述第一轮扩增为在矿物油下方加入 1-2. 5μ L样本和等体积的2X外侧引物PCR反应液，使用14-18个碱基的外侧引物在 44°C-48°C的退火温度下进行的15-25个热循环的PCR扩增。
[0010] 在本发明的另一个具体实施方案中，所述第二轮扩增为在第一轮同一孔中加 18-45 μ L的1 X内侧引物PCR反应液，用同样吸头插入矿物油层下面加入，使用18-24个碱 基的内侧引物在56°C-60°C的退火温度下进行的20-30个热循环的PCR扩增。
[0011] 在本发明的另一个具体实施方案中，所述第二轮扩增产物的检测通过如下步骤进 行：在反应液中加入SYBR Green I荧光染料进行实时检测；或在第二轮PCR反应后每孔加 入2-5 μ L的EB (0. 5 μ g/mL)于矿物油层下面，置96孔板于紫外灯下显色计数或于荧光光 度仪检测。
[0012] 在本发明的另一个具体实施方案中，将待测样本进行连续梯次的10倍稀释后每 个梯次的稀释梯度又等量分配到10个反应孔/单元，进行梯次X 10单元两轮巢式PCR，当 一组10个PCR有7个或多于7个扩增荧光反应定为1个靶分子/孔样本，一组10个PCR 有3个及少于3个扩增荧光反应定为0个靶分子/孔样本，一组10个PCR有4个-6个扩 增荧光反应定为〇. 5个靶分子/孔样本，以1个靶分子组或0. 5个靶分子组乘以样本稀释 倍数推算出初始靶模板分子绝对数量。
[0013] 在本发明的另一个具体实施方案中，按照根据权利要求7的方法推算出的初始靶 模板分子绝对数量，将样本一次稀释至大约〇. 5个靶分子/孔，加等量2 X第一轮PCR反应 液后分散至整个96孔板，同样两轮改良巢式d-PCR，数据进行泊松分布计数，得到高一个数 量级精确度的初始祀模板分子绝对数量。
[0014] 在本发明的另一个具体实施方案中，将待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释后 每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至含有100-10000个反应单元的聚二甲基 硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行两轮巢式数字PCR定量。
[0015] 在本发明的另一方面，还提供了一种用于本发明的巢式数字PCR定量方法的基因 检测试剂盒，其成份包括：核酸提取试剂，dNTPs及dTTP，UDG酶，Taq酶及其缓冲液，外侧引 物F1/R1，内侧引物F2/R2,染料EB及SYBR Green I，纯化水dH20,矿物油。 本发明的的巢式数字PCR定量方法操作简便，成本低廉而又灵敏度极高，可作为重要 的临检样本、核酸参考品和科研样本的手动/手工d-PCR方法，同时也为更快捷、高效超级 单元微滴化的微流控芯片装置的研制提供了前期研究工具和创新指导思路。
【专利附图】
【附图说明】： 图1.改良巢式PCR示意图，第一轮PCR采用短引物小体积扩增，第二轮PCR加入长引 物于封闭的第一轮PCR反应管大10倍体积扩增，示意图中，长细线条代表靶模板，透明粗线 条代表外侧引物和第一轮扩增产物；黑体粗线条代表内侧引物和第二轮扩增产物。
[0016] 图2.无模板的CaMV引物验证PCR，其外侧引物经15,……，24个循环普通PCR 扩增后稀释进行内引物高Tm退火实时荧光PCR，相应本底Ct值均为35-36,所以第一轮少 于24个循环和第二轮少于35个循环巢式PCR不会产生非特异扩增；如第一轮30个循 环后第二轮荧光PCR则其本底Ct值18。
[0017] 图3.实施例转基因大豆油的d-PCR 96孔板定量结果。
【具体实施方式】
[0018] 本发明的巢式数字PCR定量方法其特征不同于传统的巢式PCR，传统的巢式PCR方 法是从第一轮PCR产物取出一小部分来加入第二轮PCR以及加 PCR反应液后再加矿物油或 热盖代替油密闭，所以容易交叉污染。而本发明的数字定量巢式PCR为反传统巢式PCR顺 序操作的两步数字PCR，其技术特征是预先加矿物油，第一轮PCR小体积加入矿物油下进行 低退火温度扩增，且样本10倍梯度稀释后分梯度组PCR，第二轮PCR大体积加入第一轮反应 进行高退火温度扩增以使第一轮外侧引物在第二轮失去作用，避免外侧引物两轮PCR持续 产生引物二聚体ro扩增，配合预加矿物油隔绝PCR系统外气雾胶污染，保证所述的巢式数 字PCR "0"模板没有非特异性反应，而巢式PCR两轮大于40个循环反应能实现" 1"个模板 扩增检出。本发明的一个具体实施方案的示意图显示于图1中。
[0019] 在本发明方法的一个具体实施方案中，在反应孔预先加入30-50 μ L矿物油确保 密闭情况下，加1-2. 5yL样本和等体积的2Χ外侧引物PCR反应液于矿物油层下面，进行 12-20个碱基的外侧引物44°C-48°C退火的15-25个热循环第一轮PCR扩增；于第一轮同 一孔中加18_45μ L的IX内侧引物PCR反应液，用同样吸头插入矿物油层下面加入，进行 16-26个碱基的内侧引物56°C-60°C退火的20-30个热循环第二轮PCR扩增。
[0020] 在本发明方法的另一个具体实施方案中，将待测样本进行9个或以上梯次的10倍 连续稀释后每个梯次的稀释梯度又等量分配到有限个反应孔/反应单元，进行共96孔板、 384孔板两轮巢式PCR，采用样本预先10倍稀释的9组梯度重复PCR，总有一组10个PCR其 靶分子理论数位于0-1之间，能取得相当于万级甚至百万级反应单元微流控或微滴化装置 的功效，以及在此基础之上加一两级的100倍稀释或取舍；如在第二轮1XPCR反应液中加 入1 X SYBR Green I荧光染料可在第二轮进行实时荧光PCR检测，否则于第二轮PCR反应 后每孔加入2-5 μ L的EB (0. 5 μ g/mL)于矿物油层下面，置96孔板于紫外灯下显色计数或 于荧光光度仪检测。
[0021] 在本发明方法的另一个具体实施方案中，将待测样本进行9个梯次的10倍连续稀 释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至100-10000个反应单元聚二甲基硅 氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行两轮巢式数字PCR定量。
[0022] 在本发明的另一方面，还提供了一种用于本发明的巢式数字PCR定量方法的基因 检测试剂盒，所述试剂盒成份包括：核酸提取试剂，dNTPs及dTTP，UDG酶，Taq酶及其缓冲 液，外侧引物匕/%，内侧引物F 2/R2，染料EB及SYBR Green I，纯化水dH20,矿物油。
[0023] 为了克服现有d-PCR "0"反应有非特异性的障碍和微流控或微滴化装置反应单元 数目的限制。本发明的巢式数字PCR定量方法利用巢式PCR能够检出单个分子的高灵敏度， 改进传统巢式PCR操作方式以消除引物二聚体非特异性扩增所掩盖的"0"模板反应。
[0024] 常规的巢式PCR(nest PCR)是一种由外侧和内侧两套引物进行两轮扩增的高特异 性和灵敏度的PCR模式，首先由外侧引物进行第一轮15-30个热循环扩增，然后从第一轮反 应产物中取出少部分作为模板进行第二轮内侧引物15-30个热循环扩增，内侧引物与第一 轮产物序列互补，第二轮扩增在第一轮较长片段扩增基础上继续放大、扩增较短一些的目 的片段产物。两套引物特异杂交增强了靶序列选择的特异性，多于30个循环以上的扩增提 高了灵敏度，近40个循环的扩增可以检出单个分子。为了避免第一轮PCR后开盖操作所带 来的气雾胶交叉污染，衍生了不开盖的单管巢式PCR，即采用较长外侧引物和较短的内侧引 物同时加入单管PCR，外侧引物的退火温度比内侧引物的退火温度高10摄氏度以上，这样 单管反应第一轮PCR时采用较高的引物退火温度使外侧引物先行扩增而内侧引物不会扩 增，第二轮PCR通过降低退火温度使内侧引物扩增。但是由于在第二轮扩增中外侧引物仍 能部分杂交、延伸，因此在超过30个循环后就一定会产生引物二聚体ro非特异性扩增，仍 需要PCR后凝胶电泳来区分非特异性扩增条带。但是这种扩增方法由于"〇"模板的ro非 特异性扩增而使其完全无法适用于数字（digital)PCR。
[0025] 本发明的发明人改进了常规的巢式PCR操作方式，反过来设计外侧和内侧两套引 物，使用较短的14-18个碱基的外侧引物和较长的18-24个碱基的内侧引物，内侧引物的退 火温度比外侧引物的退火温度高l〇°C以上。本发明的方法采用96孔板两轮PCR反应，在每 孔预先加入30-50 μ L矿物油确保密闭情况下，第一轮PCR加1-2. 5 μ L样本和等体积的2 X 外侧引物PCR反应液，用加样枪吸头轻轻插入矿物油层下面缓缓加入，进行44°C-48°C退火 的15-25个热循环扩增；第二轮PCR于上一轮同一孔中加18-45 μ L的1 X内侧引物PCR反 应液，用同样吸头插入矿物油层下面加入，进行56°C-60°C退火的20-30个热循环扩增。第 一轮PCR较短外侧引物的低温退火扩增会增多一些单引物与非靶模板线性扩增，但不会聚 焦产生足够被荧光检测检出的指数非特异性扩增；随后第二轮PCR较长内侧引物的高温退 火扩增会进一步排除这些非靶扩增的少量DNA，特异性仍强于普通PCR。
[0026] 本发明的改进巢式PCR操作方式最根本优点是消除了引物二聚体非特异性扩增， 引物对往往必须大于4 μ Μ浓度和超过30个热循环扩增才会产生可检测的引物二聚体扩 增。外侧引物在第一轮15-25个热循环中不够产生可检测的引物二聚体，进入第二轮PCR 后外侧引物被稀释10-20倍仅0. 5 μ Μ浓度和外侧引物Tm值明显低于第二轮PCR退火温度 l〇°C以上，其引物浓度和Tm值双重作用限制下外侧引物对于两轮PCR始终不会产生可检测 的引物二聚体扩增；而4 μ Μ浓度内侧引物对仅参与第二轮PCR的20-30个热循环也不够产 生可测的引物二聚体。本发明的方法中还配合预加矿物油隔绝PCR系统外的气雾胶交叉污 染（后加矿物油会无意溅起少量PCR液于油表面及管壁上继续扩增而导致气雾胶泄露）。
[0027] 在本发明的巢式数字PCR定量方法的一个实施方案中，按如下步骤进行PCR操作： (1)首先将未知浓度的待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释：取9个1. 5mL塑料ΕΡ管， 每管均先加入某μ L纯化水，取1/10体积待测样本原液加入第1管水中、并用吸头轻轻混 匀、此为原液X ΚΓ1倍，从第1管中取1/10体积的10倍稀液加入第2管水中、并轻混为原 液X 1〇_2倍，每管换一吸头，以此类推地稀释至原液X 1〇_9的浓度；⑵用2 X PCR反应液稀 释样本：每个ΕΡ管稀释样本均加入等量体积含外侧引物的2XPCR反应液，生成第一轮PCR 混合液；（3)将第一轮PCR混合液分别加入反应孔预加的矿物油层下面：取一个尖底的96 孔PCR反应板（8 X 12孔），每孔先加入30-50 μ L矿物油，组加2-5 μ L/孔原液X 10_9 倍浓度的第一轮PCR混合液于矿物油下管底，组加2-5 μ L/孔原液X ΚΓ8倍浓度的第 一轮PCR混合液，C……Η类推，剩余的Α-Εη_12孔加2-5 μ L/孔原液X ΚΓ1倍浓度的第一 轮PCR混合液，最后加两孔阳性对照、两孔阴性对照和两孔系统本底对照；（4)用所述96孔 PCR板进行15-25个热循环（94°C变性20秒、44°C-48°C退火45秒、72°C延伸30秒)的第一 轮PCR扩增；（5)在所述96孔板的各孔中再加入18-45 μ L/孔的含内侧引物1XPCR反应 液，用同样吸头插入矿物油层下面加入，进行20-30个热循环（94°C变性20秒、56°C-60°C退 火25秒、72°C延伸30秒）的第二轮PCR扩增。
[0028] 两轮加起来超过40个循环的扩增提供了能够检测出单个分子的灵敏度；而每轮 少于25个循环、30个循环的引物扩增又不会产生可检测到的引物二聚体ro非特异性干扰； 再采用样本预先10倍稀释的9组重复PCR，总有一组的10个PCR的靶分子理论数位于0-1 之间。改良巢式PCR如在第二轮1XPCR反应液中加入1XSYBR Green I荧光染料可在第 二轮进行实时荧光PCR检测；或者，可于第二轮PCR反应后每孔加入2-5yL的EB (0. 5yg/ mL)于矿物油层下面，置96孔板于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测；或者，可于第二 轮PCR反应后每孔加入针对野生与突变基因不同波长的红绿两种分子信标探针，可进行高 野生背景下突变定量。结果判读：一组10个PCR有7个或多于7个扩增荧光反应定为1个 靶分子/孔样本，一组10个PCR有3个及少于3个扩增荧光反应定为0个靶分子/孔样本， 一组10个PCR有4个-6个扩增荧光反应定为0. 5个靶分子/孔样本，以1个靶分子组或 0. 5个靶分子组乘以样本稀释倍数就推算出初始靶模板分子绝对数量，正负误差为5-10个 分子。
[0029] 如果需要进一步更精确定量检测，可在上述d-PCR基础上，将样本一次稀释至大 约0. 5个靶分子/孔，加等量2 X第一轮PCR反应液后分散至整个96孔板，同样按本发明方 法进行两轮巢式d-PCR，结果数据进行泊松分布计数，可以得到初始靶模板分子绝对数量， 正负误差为1-2个分子。
[0030] 在一个更具体的实施方案中，本发明的巢式数字PCR定量方法包括以下操作步 骤： (1)改良巢式d-PCR引物选择尤其外侧引物设计及验证： 进行PCR成功与否的关键是引物选择的优劣，尤其常规的巢式PCR外侧引物需要经过 两轮40个以上热循环，因此通常会产生引物二聚体ro非特异性扩增，从而掩盖无模板的本 底 PCR 反应。根据 Hands(Brownie.J.，1997, Nucleic Acids Res. ,25-16:3215)技术，70% 以上同序引物对不会产生引物二聚体；我们将天然同序6-8个碱基的序列放置离引物3'末 端2-5个碱基的中部，如此一对部分同序引物一般推后5-10个热循环才产生ro扩增，以减 少外侧引物第一轮PCR产生ro的几率，再加上外侧引物10倍稀释和Tm值低10度于第二 轮PCR，在上述条件下不会产生ro扩增。第二轮内侧引物的选择则在外侧引物限定的片段 范围内根据一般引物设计原则来设计。
[0031] 设计选择的外侧引物和内侧引物是否导致ro扩增或什么条件下导致ro扩增？其 最终选择必须通过试验来确定。采用不加样本的无模板空白系统pcr来验证ro扩增，配置 10个改良巢式PCR反应，第一轮PCR使用普通PCR仪1-10管分别扩增15-24个热循环或更 宽范围循环，第二轮全部采用SYBR Green I实时荧光PCR扩增45个热循环，挑选没有 或最晚有ro扩增的试验管作为第一轮PCR最佳循环条件，同时通过实时荧光PCR可以确切 知道第二轮PCR最多进行多少个循环不产生ro扩增。
[0032] 第一轮无模板外侧引物普通PCR :按以下配方配制10次试验，每次5 μ L的外侧引
【权利要求】
1. 一种巢式数字PCR定量方法，其特征是改进的巢式PCR及样本10倍稀释梯度分散 至有限单元的数字PCR方法，包括下列步骤：在每个反应单元中预先加入矿物油，在矿物油 下方加入1-5 y L小体积的第一轮PCR混合液，所述混合液包括等体积的2 X反应液和连续 10倍稀释梯度的样本液，在第一退火温度下使用外侧引物进行第一轮扩增；随后在第一轮 扩增产物中加入10-20倍于第一轮PCR体积的第二轮PCR反应液，在第二退火温度下使用 内侧引物进行第二轮扩增；最后检测扩增产物，进行计数定量。
2. 根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法，其中所述第一退火温度为 44°C-48°C，所述第二退火温度为56°C-60°C。
3. 根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法，其中所述外侧引物短于内侧引物。
4. 根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法，其特征在于所述第一轮扩增为在矿 物油下方加入1-2. 5 μ L样本和等体积的2X外侧引物PCR反应液，使用14-18个碱基的外 侧引物在44°C-48°C的退火温度下进行的15-25个热循环的PCR扩增。
5. 根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法，其特征在于所述第二轮扩增为在 第一轮同一孔中加18-45yL的IX内侧引物PCR反应液，用同样吸头插入矿物油层下面 加入，使用18-24个碱基的内侧引物在56°C-60°C的退火温度下进行的20-30个热循环的 PCR扩增。
6. 根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法，其中所述第二轮扩增产物的检测通 过如下步骤进行：在反应液中加入SYBR Green I荧光染料进行实时检测；或在第二轮PCR 反应后每孔加入2-5 μ L的EB (0. 5 μ g/mL)于矿物油层下面，置96孔板于紫外灯下显色 计数或于荧光光度仪检测。
7. 根椐权利要求3所述的巢式数字PCR定量方法，其特征是将待测样本进行连续梯次 的10倍稀释后每个梯次的稀释梯度又等量分配到10个反应孔/单元，进行梯次X 10单元 两轮巢式PCR，当一组10个PCR有7个或多于7个扩增荧光反应定为1个靶分子/孔样本， 一组10个PCR有3个及少于3个扩增荧光反应定为0个靶分子/孔样本，一组10个PCR 有4个-6个扩增荧光反应定为0. 5个靶分子/孔样本，以1个靶分子组或0. 5个靶分子 组乘以样本稀释倍数推算出初始靶模板分子绝对数量。
8. 根椐权利要求4所述的一种巢式数字PCR定量方法，其特征是按照根据权利要求7 的方法推算出的初始靶模板分子绝对数量，将样本一次稀释至大约0. 5个靶分子/孔，加 等量2 X第一轮PCR反应液后分散至整个96孔板，同样两轮改良巢式d-PCR，数据进行泊 松分布计数，得到高一个数量级精确度的初始靶模板分子绝对数量。
9. 根椐权利要求1所述的一种巢式数字PCR定量方法，其特征是将待测样本进行9个 梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至含有100-10000 个反应单元的聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行两轮巢式数字PCR定量。
10. 用于权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法的基因检测试剂盒，其成份包括： 核酸提取试剂，dNTPs及dTTP，UDG酶，Taq酶及其缓冲液，外侧引物Fi/Ri，内侧引物F 2/R2， 染料EB及SYBR Green I，纯化水dH20,矿物油。
【文档编号】C12Q1/68GK104195236SQ201410396994
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】谢兵 申请人:北京恩济和生物科技有限公司