一种普洱普鲁蓝菌及其培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种普洱普鲁蓝菌及其培养方法。所述细菌为普洱普鲁蓝菌，具体为普洱普鲁蓝菌YN3，其保藏号为CGMCC No.1.12777。本发明所提供的普洱普鲁蓝菌分离自陈熟普洱茶，具有蛋白酶活性。而来源于普洱茶发酵微生物的蛋白酶未见报道。本发明所提供的普洱普鲁蓝菌中温生长（30-37℃），易培养。本发明从陈熟普洱茶中分离到分解酪蛋白、产生蛋白酶的微生物，从食品安全和原位酶活激发的角度出发，为普洱茶的加工及蛋白酶的其他工业化应用提供菌种资源，具有较好的应用前景。
CGMCC No.1.12777
2014.05.20
【专利说明】一种普丨耳普鲁蓝菌及其培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种普洱普鲁蓝菌及其培养方法。
【背景技术】
[0002]蛋白酶是催化分解蛋白质肽键的一类酶，与人类的生活息息相关。在所有的工业用酶制剂中75%是蛋白水解酶，而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60%左右。由于微生物蛋白酶均为胞外酶且微生物菌体易于培养，因此与动、植物蛋白酶相比，具有下游处理技术相对简单，具有工业化大批量生产的优势。
[0003]蛋白酶在食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业有广泛应用，对国民经济的发展起着重要的作用。
[0004]目前，利用酶制剂来提高茶叶品质的方法已被认可。尤其是在普洱茶的加工中。普洱茶是以云南大叶种制成的晒青毛茶作为原料，经发水、渥堆、陈化及干燥工序精制而成的后发酵茶。在普洱茶的加工和贮存中，微生物自身包含的酶及代谢产生的胞外酶，如纤维素酶，果胶酶，多酚氧化酶和蛋白酶等使茶的内含物发生了变化，对普洱茶品质的形成有及其重要的作用。与传统工艺相比，在普洱茶加工中应用外源酶制剂不仅有利于开发出品种风味独特、功能各异的茶叶制品。并且能缓解微生物复杂的调控难题，可缩短加工时间，节约生产成本。
[0005]在茶叶加工过程中外源酶的研究中指出，蛋白酶能够促进茶叶蛋白质的水解，提高茶叶氨基酸和茶黄素的含量，缩短茶叶的发酵时间。蛋白酶在将蛋白质降解为胨、短肽的同时，还可能降解掉不溶性多酚类聚合物以及茶多糖中的蛋白质，导致茶多酚、可溶性糖和水浸出物的含量，提升茶叶的品质。
[0006]但目前应用于茶叶加工的蛋白酶主要是其他来源的蛋白酶，而来源于普洱茶发酵微生物的蛋白酶还未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的之一在于提供一种普洱普鲁蓝菌。
[0008]本发明的目的之二在于提供该普洱普鲁蓝菌的培养方法。
[0009]本发明所提供的细菌,被鉴定为普海普鲁蓝菌(/^/77w7a/?i6aci77w5./w/eri),来源于陈熟普洱茶。
[0010]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种普洱普鲁蓝菌YN3，该菌株的保藏号为CGMCC N0.1.12777。
[0011]一种培养上述的普洱普鲁蓝菌YN3的方法，其特征在于该方法是:将普洱普鲁蓝菌YN3接种于CYC培养基，在25-50°C，pH4.0?8.0的条件下进行培养；所述CYC培养基的组成及含量为:每100mlCYC液体培养基含有=NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H200.5 g, KCl 0.5 g , FeSO4.7H20 0.01 g，鹿糖 30 g, Yeast extract 2.0g 和 Casaminoacids 6.0g0
[0012]上述培养温度为30?37°C。
[0013]上述pH 为 5.0 ?6.0。
[0014]一种根据上述的普洱普鲁蓝菌在液体发酵生产蛋白酶中的应用。
[0015]所述普海普鲁蓝菌/w/eri)YN3,它于2014年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是中国北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏号为CGMCC N0.1.12777。
[0016]取普洱熟茶浸出液，将其稀释涂布于LB固体培养基中，30°C培养2-3天，挑取单菌落，然后划线纯化得到。
[0017]本发明所提供的普洱普鲁蓝菌YN3具有以下特征:
O菌落特征:菌落直径为3.0mm，菌落呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，凸起，黄色或白色。
[0018]2)细胞形态特征:细胞为短杆或弯曲状，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；细胞菌体大小为0.5-0.6 μ mX 1.0-2.6 μ m,单生或成簇。产端生芽孢，胞囊膨大。
[0019]3)生理生化特征:好氧生长；接触酶阳性；核酸酶阴性；水解七叶灵；液化明胶；水解酪蛋白；不水解普鲁蓝多糖；不水解淀粉；不还原硝酸盐；能利用葡萄糖、木糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、糖原、甘油、麦芽糖、乳糖、L-阿拉伯糖、核糖、肌醇、果糖、山梨醇、鼠李糖、海藻糖、苦杏苷作为碳源；不利用D-阿拉伯糖、木糖醇、甲酸、甲醇、乙酸钠、酮戊二酸、延胡索酸、L-鸟氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、DL-天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸与组氨酸。
[0020]普洱普鲁蓝菌YN3的16S rRNA基因序列长度为1553bp。其16S rRNA基因的核苷酸序列间SEQ ID N0.1所示的碱基序列。
[0021]本发明的普洱普鲁蓝菌YN3是从陈熟普洱茶中分离得到的，是一种能够分解蛋白质的微生物，该微生物的蛋白酶活为U/mg，文献中未见关于从普洱茶中分离产蛋白酶微生物的报道。通过本发明普洱普鲁蓝菌YN3参与茶叶中蛋白质的分解，提升普洱茶的品质，并为工业广泛应用蛋白酶制剂提供菌种资源。
[0022]本发明则从陈熟普洱茶中分离到分解酪蛋白、产生蛋白酶的微生物，从食品安全和原位酶活激发的角度出发，为普洱茶的加工及蛋白酶的其他工业化应用提供菌种资源，具有较好的应用前景。
【具体实施方式】
[0023]下述实验例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
[0024]实施例1、菌株YN3的分离制备:取普洱熟茶浸出液，将其稀释涂布于LB固体培养基中，30°C培养2-3天，挑取单菌落，然后划线纯化得到。
[0025]将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为 CGMCC N0.1.12777。
[0026]实施例2、菌株鉴定一、形态及生理生化特征
将菌株YN3 (CGMCC N0.1.12777)接种于蔗糖为底物的CYC固体培养基(含质量百分含量为1.5%的琼脂)，在pH为6.0，温度为30°C的条件下固体培养2天。
[0027]观察菌落及细胞的形态特征，并进行如下生理生化实验:1革兰氏染色试验，2接触酶试验，3水解七叶灵试验，4液化明胶试验，5还原硝酸盐试验，6底物利用试验，7DNAase试验8酪蛋白水解试验9普鲁蓝多糖水解试验10淀粉水解试验
观察结果及实验结果如下:
O菌落特征:菌落直径为3.0mm，菌落呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，凸起，黄色或白色。
[0028]2)细胞形态特征:细胞为短杆或弯曲状，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；细胞菌体大小为0.5-0.6 μ mX 1.0-2.6 μ m,单生或成簇。产端生芽孢，胞囊膨大。
[0029]3)生理生化特征:好氧生长；接触酶阳性；核酸酶阴性；水解七叶灵；液化明胶；水解酪蛋白；不水解普鲁蓝多糖；不水解淀粉；不还原硝酸盐；能利用葡萄糖、木糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、糖原、麦芽糖、乳糖、L-阿拉伯糖、核糖、肌醇、果糖、山梨醇、鼠李糖、海藻糖、苦杏苷作为碳源；不利用D-阿拉伯糖、木糖醇、甲酸、甲醇、乙酸钠、酮戊二酸、延胡索酸、L-鸟氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、DL-天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸与组氨酸。
[0030]二、菌株YN3 (CGMCC N0.1.12777)的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定 I)提取DNA
将普洱普鲁蓝菌YN3 (CGMCC N0.1.12777)接种于CYC液体培养基，将生长至对数晚期的发酵液，12000转/分钟离心I分钟，去除上清液；用TES (50 mM Tris, 50 mM EDTA-Na2,50mM NaCl,pH 8.0-8.2)溶液洗3遍；用0.4mL TES溶液将菌体混匀，加入适量溶菌酶，37°C保温I小时；加入0.04 mL20%SDS，60°C保温30分钟；加入0.18 mL 5M NaClO4,混勻;加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，轻轻摇匀I分钟左右，离心(12000转/分钟，10分钟)，吸取上清液；上清液加入20 μ I 0.2 % RNA酶37°C保温30分钟，氯仿-异戊醇(24:1, v/v)处理一遍；上清液加入20 μ I蛋白酶K (50-70 yg/mL)，37°C保温I小时，氯仿-异戊醇(24:1，v/v)处理一遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉淀，70%冰乙醇溶液浸泡5分钟，12000/分钟离心5分钟。晾干后溶于无菌水中作为模板DNA。
[0031]2) 16S rRNA基因的PCR扩增及测序
用于PCR扩增的正向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (nt 8-27)，反向引物为5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’ (nt 1541-1557)，分别对应于大肠杆菌的 16S rRNA基因的8-27和 1541-1557 碱基。PCR 反应体系(20 μ I)为:10Xbuffer 2μ1、25 mmol/L MgCl22 μ I,
10mmol/L dNTPs 1.5μ 1,30 pmol/L 引物各 I μ l、ddH20 13.4 μ l.Taq DNA 酶 I μ 1、模板
Iμ I。PCR 反应条件为:95°C 10 min，95°C I min，55°C I min，72°C I min30s，30 个循环；72°C 10 min，4°C保存。
[0032]PCR 产物的测序采用 ABI BigDye3.1测序试剂盒(Applied B1systems)和 DNA自动测序仪(model ABI3730; Applied B1systems)。
[0033]测序结果表明，菌株YN3 (CGMCC N0.1.12777)16S rRNA基因序列长度为1553bp。其16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表I所示。
[0034]将16S rRNA基因序列在GenBank中进行同源比对分析，结果表明，其序列与PullulanibadIlus naganoensis饱 16S rRNA 基因序列的相似性为 95.8%。
[0035]参照《Bergey’sMannualof Systematic Bacter1logy》(第二版)，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，菌株YN3(CGMCCN0.1.12777)被鉴定为新种普海普鲁蓝菌pueri)?
[0036]实施例3:普洱鲁蓝菌YN3 CGMCC N0.1.12777的培养
1)将普洱鲁蓝菌YN3以5%的比例接种于CYC液体培养基，在25°C，pH4.0, 200rpm的条件下培养。
[0037]液体CYC培养基的组成(/L)如下:
NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H20 0.5 g, KCl 0.5 g , FeSO4.7H200.01 g,鹿糖 30 g, Yeast extract 2.0g, Casamino acids 6.0g,蒸懼水定容至1000ml。
[0038]实验设三次重复，平均菌体浓度达0.3±0.1 g/L
2)将普洱鲁蓝菌YN3以5%的比例接种于CYC液体培养基，在30°C，pH5.0, 200rpm的条件下培养。
[0039]液体CYC培养基的组成(/L)如下:
NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H20 0.5 g, KCl 0.5 g , FeSO4.7H200.01 g，鹿糖 30 g, Yeast extract 2.0g, Casamino acids 6.0g,蒸懼水定容至1000ml。
[0040]实验设三次重复，平均菌体浓度达4.6 ± 1.0 g/L
3)将普洱鲁蓝菌YN3以5%的比例接种于CYC液体培养基，在37°C，pH6.0, 200rpm的条件下培养。
[0041]液体CYC培养基的组成(/L)如下:
NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H20 0.5 g, KCl 0.5 g , FeSO4.7H200.01 g，鹿糖 30 g, Yeast extract 2.0g, Casamino acids 6.0g,蒸懼水定容至1000ml。
[0042]实验设三次重复，平均菌体浓度达3.4±0.1 g/L
4)将普洱鲁蓝菌YN3以5%的比例接种于CYC液体培养基，在40°C，pH7.0, 200rpm的条件下培养。
[0043]液体CYC培养基的组成(/L)如下:
NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H20 0.5 g, KCl 0.5 g , FeSO4.7H200.01 g，鹿糖 30 g, Yeast extract 2.0g, Casamino acids 6.0g,蒸懼水定容至1000ml。
[0044]实验设三次重复，平均菌体浓度达3.0±0.2 g/L
5)将普洱鲁蓝菌YN3以5%的比例接种于CYC液体培养基，在45°C，pH8.0, 200rpm的条件下培养。
[0045]液体CYC培养基的组成(/L)如下:
NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H20 0.5 g, KCl 0.5 g , FeSO4.7H200.01 g，鹿糖 30 g, Yeast extract 2.0g, Casamino acids 6.0g,蒸懼水定容至1000ml。
[0046]实验设三次重复，平均菌体浓度达2.0±0.5 g/L
6)将普洱鲁蓝菌YN3以5%的比例接种于CYC液体培养基，在50°C，pH8.0, 200rpm的条件下培养。
[0047]液体CYC培养基的组成(/L )如下:
NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H20 0.5 g, KCl 0.5 g , FeSO4.7H200.01 g，鹿糖 30 g, Yeast extract 2.0g, Casamino acids 6.0g,蒸懼水定容至1000ml。
[0048]实验设三次重复，平均菌体浓度达0.5±0.1 g/L
7)将普洱鲁蓝菌YN3以5%的比例接种于CYC液体培养基，在55°C，pH9.0, 200rpm的条件下培养。
[0049]液体CYC培养基的组成(/L)如下:
NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H20 0.5 g, KCl 0.5 g, FeSO4.7H200.0lg,鹿糖 30 g, Yeast extract 2.0g, Casamino acids 6.0g,蒸懼水定容至1000ml。
[0050]实验设三次重复，三次重复中菌体均不生长。
[0051]实验结果表明，菌株YN3好氧生长，生长温度从25 °C到50°C，最适生长温度300C -37°C, pH生长范围4.0-9.0，最适生长pH为5.0-6.0。在最适生长条件下，菌体浓度可达 4.6±1.0 g/L。
[0052]实施例4:普洱鲁蓝菌YN3 CGMCC N0.1.12777的蛋白酶活测定一、制备酶液
将普洱普鲁蓝菌YN3 CGMCC N0.12.12777接种于CYC液体培养基，pH为6.8，培养温度为30°C，培养I天后，收集培养物，经12000 rpm离心1min去除菌体细胞，保留培养液上清。离心后的上清用80%饱和度的进行沉淀。将溶液于4°C下12000 rpm离心20min，弃上清，将沉淀溶于PBS缓冲液中作为酶液。
[0053]CYC培养基组成为(/L):
NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H20 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4.7H20 0.01 g,鹿糖 30 g, Yeast extract 2.0g, Casamino acids 6.0g,蒸懼水定容至 1000ml。
[0054]二、酶活测定
反应体系包括:适量稀释的酶液0.2ml, 10g/L的酪素0.2ml,反应温度为40°C, pH为6.8,反应1min后,用0.4mol/L的三氯乙酸0.4ml终止酶反应。过滤或离心后,取上清液，用紫外分光光度法于275nm波长测定产生的酪氨酸量。
[0055]一个酶活力单位(U)定义为每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生I μ g酪氨酸的酶量。
[0056]三次重复平均测得酶活为125.6±8.5 U/mg。
【权利要求】
1.一种普洱普鲁蓝菌YN3，该菌株的保藏号为CGMCC N0.1.12777。
2.一种培养根据权利要求1所述的普洱普鲁蓝菌YN3的方法，其特征在于该方法是:将普洱普鲁蓝菌YN3接种于CYC培养基，在25-50V，pH4.0?8.0的条件下进行培养；所述CYC培养基的组成及含量为:每100mlCYC液体培养基含有=NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g，MgSO4.7H20 0.5 g, KCl 0.5 g , FeSO4.7H20 0.01 g，蔗糖 30 g, Yeast extract 2.0g和 Casamino acids 6.0g0
3.根据权利2所述的培养方法，其特征在于所述培养温度为30?37°C。
4.根据权利2所述的培养方法，其特征在于所述pH为5.0?6.0。
5.一种根据权利要求1所述的普洱普鲁蓝菌在液体发酵生产蛋白酶中的应用。
【文档编号】C12N9/52GK104450553SQ201410473871
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】牛莉莉, 陈丰, 唐天弈, 熊梦洁, 陆雯婷, 郁千一 申请人:上海大学