一种与绵羊肉用性能相关的标记物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与绵羊肉用性能相关的miRNA，其序列如SEQIDNO:1所示。本发明利用miRNA-sep筛选出在多赛特羊和小尾寒羊肌内脂肪组织中表达差异的miRNA，并通过了QPCR验证。在实际生产中，可以通过抑制该表达差异的miRNA来实现改变绵羊肉用性能的目的。
【专利说明】一种与绵羊肉用性能相关的标记物 发明领域
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，本发明涉及一种与绵羊肉用性能相关的标记物，具体 涉及一种与绵羊肉用性能相关的miRNA。
【背景技术】
[0002] miRNA是近年来研究发现的一种长20-24nt的内源性非蛋白编码RNA。miRNA基 因最初转录产生具有颈环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被 Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定靶基因的mRNA结合，引起mRNA 降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用。
[0003] 道赛特羊（Dorset)和小尾寒羊是具有不同生理特性的绵羊品种。道赛特羊体积 大、肌肉多、肌内脂肪少，肉感差；小尾寒羊繁殖速度快、肌内脂肪多，肉感好。在实际生产 中，人们常常需要大量培养肉感好的绵羊，因此寻找与肉感相关的基因或者调控基因表达 的miRNA成为了上述目标实现的途径。
[0004] 高通量转录组测序（RNA-S印）是在转录组水平上进行深度测序的一项技术，测 序技术在转录组分析中的应用主要集中在基因表达谱的构建，新基因的发现、小分子非编 码RNA表达谱的构建和新小分子RNA基因的发现、蛋白质编码基因注释、以及如fusion transcript等转录组研究上。数据在最初的处理上是大体是相似的,接下来针对不同的研 究目的可以选用不同的生物信息学软件进行计算。
[0005] 利用大规模测序技术直接对由mRNA或小分子非编码RNA反转录成的cDNA序列进 行测序，产生数以千万计的reads数量，从而使得一段特殊的基因组区域的转录水平可以 直接通过比对到该基因组区域的reads数来衡量。该技术常用来构建某一特定组织或细胞 的基因表达谱，通过对正常组织和异常组织进行基因表达谱的分析，得到在两种组织中差 异表达的基因。
【发明内容】
[0006] 本发明的首要目的是提供一种与绵羊肉用性能相关的miRNA，所述miRNA是经过 RNA-seq筛选并使用QPCR验证获得的。
[0007] 本发明的第二目的是提供一种检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的试剂。
[0008] 本发明的第三目的是提供一种检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的试剂盒。
[0009] 本发明的第四目的是提供上述miRNA在制备检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的 试剂盒中应用。
[0010] 本发明的第五目的是提供上述试剂在制备检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的 试剂盒中应用。
[0011] 为了实现上述目的，本发明采用的实施方案如下：
[0012] 一种与绵羊肉用性能相关的miRNA，该miRNA的序列如SEQ ID NO :1所示。
[0013] 一种检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的试剂，所述试剂包括QPCR实验中使用的 反转录引物和/或扩增引物，所述反转录引物是Oligo (dT)特异性的RT引物，优选购自北 京信诺金达生物科技有限公司；所述扩增引物的正向引物序列如SEQ ID NO :2所示，反向 引物为通用反向引物，优选购自北京信诺金达生物科技有限公司。
[0014] 一种检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的检测试剂盒，该检测试剂盒包括QPCR实 验中使用的反转录引物和/或扩增引物，所述反转录引物是Oligo(dT)特异性的RT引物， 优选购自北京信诺金达生物科技有限公司；所述扩增引物的正向引物序列如SEQ ID NO :2 所示，反向引物为通用反向引物，优选购自北京信诺金达生物科技有限公司。
[0015] 本发明还提供了绵羊肉用性能相关的miRNA在制备检测miRNA的试剂盒中的应 用，该miRNA的序列如SEQ ID NO :1所示。
[0016] 本发明还提供了检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的试剂在制备检测miRNA的试 剂盒中的应用，所述试剂包括QPCR实验中使用的反转录引物和/或扩增引物，所述反转录 引物是Oligo(dT)特异性的RT引物，优选购自北京信诺金达生物科技有限公司；所述扩增 引物的正向引物序列如SEQ ID NO :2所示，反向引物为通用反向引物，优选购自北京信诺金 达生物科技有限公司。
[0017] 本发明还提供了检测组织样本中miRNA表达量的方法，具体的操作步骤如下：
[0018] (1)提取样本总RNA ;
[0019] (2)将步骤（1)获得的RNA逆转录成cDNA ;
[0020] (3)在荧光实时定量PCR仪上将miRNA和对照基因进行扩增检测；
[0021] (4)通过融解曲线和扩增曲线分析，Λ ACT法进行相对定量。
[0022] 步骤（1)的具体实施方法为：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷 的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
[0023] ①加入Trizol,室温保存5min ;
[0024] ②加氯仿0· 2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min ;
[0025] ③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相（吸70%)到另一新离心管中，注意 不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的_20°C预冷异丙醇，充分颠倒 混匀，置于冰上IOmin ;
[0026] ④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按lml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗涤沉淀（4°C保存），洗涤沉淀物，振荡混合，4°C下12000rpm高速离心5min ;
[0027] ⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉 淀；
[0028] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于_70°C。
[0029] 步骤（2)的具体实施方法为：
[0030] a.体系配制
【权利要求】
1. 一种绵羊肉用性能相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA序列如SEQ ID NO :1所 /Jn 〇
2. -种检测权利要求1所述的miRNA的试剂，其特征在于，所述试剂包括QPCR实验中 使用的反转录引物和/或扩增引物；所述反转录引物为Oligo(dT)特异性的RT引物；所述 扩增引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物序列如SEQ ID NO :2所示，所述反向引 物为通用反向引物。
3. -种权利要求1所述的miRNA的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利 要求2所述的试剂。
4. 根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含PCR反应常 用的试剂和酶。
5. 权利要求1所述的miRNA在制备权利要求3或4所述的检测试剂盒中的应用。
6. 权利要求2所述的试剂在制备权利要求3或4所述的检测试剂盒中的应用。
7. -种检测权利要求1所述的miRNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 提取样本总RNA ; (2) 将步骤（1)获得的RNA逆转录成cDNA ; (3) 在荧光实时定量PCR仪上将步骤⑵获得的cDNA和对照基因进行扩增检测； (4) 通过融解曲线和扩增曲线分析，Λ ACT法进行相对定量。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RNA逆转录成cDNA使用的引物序列 为Olig0 (dT)特异性的RT引物。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤⑶中扩增检测需使用扩增引物，所 述扩增引物的正向引物序列如SEQ ID NO :2所示，所述扩增引物的反向引物为通用反向引 物。
10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述对照基因为snRNA U6,所述对照基 因的正向引物序列如SEQ ID NO :3所示，所述对照基因的反向引物序列如SEQ ID NO :4所 /Jn 〇
【文档编号】C12Q1/68GK104212798SQ201410480214
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】苗向阳 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所