一种用大型真菌菌液(质)制备高效益生菌制剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用大型真菌菌液(质)制备高效益生菌制剂的方法，该方法为：用农副产品制备液体或固体培养基培养真菌得到菌液或菌质；将菌液或菌质经物理和生物处理使多糖多肽物质从细胞中释放出来，加入氮源和碳源配制成益生菌培养基；再接种益生菌培养得到高效益生菌制剂。所述的真菌包括香菇、茶薪菇、羊肚菌、滑子菇、猴头菇、牛肝菌、白灵菇、黄金菇、灵芝、云芝、虫草菌、茯苓、竹荪、松乳菇等药(食)用真菌；益生菌是芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌、肠球菌、双歧杆菌等中的一种或多种。本发明制备的益生菌制剂富含多糖、多肽等活性物质，其保健与治疗效果比常规益生菌制剂更好，可作为人畜胃肠道疾病的治疗药物与保健食品或饲料添加剂。
【专利说明】一种用大型真菌菌液（质）制备高效益生菌制剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及益生菌制剂的制备，具体涉及一种用大型真菌菌液（质）制备高效益 生菌制剂的方法。
【背景技术】
[0002] 随着抗生素的长期使用所引起的内源性感染和二重感染、耐药菌株的产生、动物 体免疫力下降、药物残留及食品等一系列问题引起人们的广泛关注，使人们对身体健康、环 境保护及食品安全的意识不断加强；对养殖业从养殖到贮藏、加工、运输和销售各个环节全 程质量控制的要求也日益加剧。"无公害饲料"、"生态饲料"、"环保饲料"、"有机饲料"和"绿 色饲料"等倍受关注。尤其是微生物饲料已成为目前或将来的研究方向和热点之一。益生 菌制剂正是这样一种饲料添加剂。益生菌制剂是一种含有大量有益微生物，在肠道环境中 存活并进行代谢，具有维持肠道微生态平衡，提高机体健康水平的活菌制剂。益生菌制剂治 疗肠道菌群失调克服了抗生素单纯杀菌或抑菌的治疗取向，而是促进正常菌群充分发挥生 物拮抗作用，将致病菌祛除，正所谓"扶正祛邪"，由此也避免了因抗生素滥用造成耐药株的 增加和耐药因子的扩散等现实难题。益生菌制剂是融汇了动物营养学、饲料学和微生物学 等学科知识；结合了配合饲料工业技术、发酵工程技术和酶工程技术而诞生的。在医药保 健、种植业、环境净化和养殖业等方面发挥了越来越重要的作用。
[0003] 微生态制剂可分为益生菌（probiotics)、益生元（prebioics)、合生元 (snybiotics)三种类型。益生菌又称益生素，是指能促进肠道内菌群平衡，对宿主起到有益 作用的活菌制剂及其代谢产物；益生元是指能选择性促进宿主肠道内一种或几种有益菌的 繁殖，达到调整肠道菌群作用的物质；合生元是将益生菌与益生元同时合并应用的一类制 齐U，合生元既可发挥益生菌的生理活性，又可选择性地增加这种益生菌的数量，使益生作用 更显著。
[0004] 目前益生菌制剂市场看，也存在菌种活性及其稳定性不高，治疗效果低的问题；为 了更好地挖掘益生菌的潜能作用，近年来国内外在探索益生菌的作用机理研究的同时，力口 强高效产品的开发研究，包括：（1)微生物品种的筛选与组合，寻求自己的菌源（包括基因 工程菌株筛选），开发复合菌制剂（因复合菌制剂较代单一菌制剂的协同作用效果更好，更 符合实际生态环境）；（2)益生菌产品稳定性的研究，在优良菌株的筛选、高活力菌剂的发 酵工艺、菌体保护（微囊包被等）和增效剂选用等关键技术方面获得突破，使在保藏及加工 处理过程中保持其菌体活性；（3)益生元的开发，探索新的益生元，以天然原料提取、酶解 或酸解等方法制备可以减少有害菌种，促进有益菌种繁殖活动，有益于机体健康的物质，提 高微生态制剂（合生元）的活性功能。低聚糖类物质是益生元研究的重点。（4)益生菌与 其他物质联用：人们在制备多菌种制剂的同时，也在不断尝试研究开发益生菌与其他制剂 间的联合使用，如：酶制剂、中草药、酸化剂和特异性疫苗等的协同作用。世界上已有许多国 家大量使用益生菌制剂，其剂型有胶囊、粉剂和原液，也添加其他成分，如：酸果提取物、低 聚果糖、免疫球蛋白、发酵副产物及其他生物活性物质。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于对益生菌制剂的发酵基质与工艺进行创新，提供一种用大型真 菌（药/食用真菌）菌液（质）制备高效益生菌制剂的方法。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] -种用大型真菌（药/食用真菌）菌液（质）制备高效益生菌制剂的方法，包括 如下步骤：
[0008] (1)用农副产品制备液体或固体培养基培养大型真菌得到菌液或菌质。
[0009] (2)将步骤（1)得到的菌液或菌质经物理和生物处理后，加入氮源和碳源配制成 益生菌培养基。
[0010] (3)将益生菌接种到步骤（2)配制的益生菌培养基培养得到高效益生菌制剂。
[0011] 步骤（1)中所述的液体或固体培养基优选为以玉米浆、玉米皮、玉米粉、大米粉、 面粉、麦麸、土豆、葡萄糖、CMC等为碳源，以豆柏、棉柏、菜柏、动物蛋白、植物蛋白、硫铵等为 氮源，以酵母浸膏、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、磷酸氢二钾、VB1、VB6、烟酸等为生长促进因子。
[0012] 步骤（1)中所述的大型真菌包括（但不限于）：茶薪菇、羊肚菌、滑子菇、猴头菇、 牛肝菌、白灵菇、香菇、平菇、黄金菇、灵芝、云芝、虫草菌、茯苓、竹荪、松乳菇、竹黄、樟芝等 产多糖多肽率高或具有保健/治疗胃肠道疾病功能的药用真菌或食用真菌。
[0013] 步骤（1)中培养大型真菌的条件优选为25-32°C培养2-5天。
[0014] 步骤（1)优选为：以玉米浆、玉米皮、玉米粉、大米粉、面粉、麦麸、土豆、葡萄糖、 CMC等为碳源，以柏、动物蛋白（香蛹粉等）、植物蛋白（玉米蛋白等）、硫按等为氣源，以 酵母浸膏、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、磷酸氢二钾、VB1、VB6、烟酸等为生长促进因子，配制成 液体培养基或固体培养基，灭菌后，接种大型真菌菌丝，25-32°C培养2-5天，取其培养物， 即真菌菌液或菌质。
[0015] 步骤（2)中所述的物理处理优选为打浆或粉碎破碎、高温提取等；所述的生物处 理为生物酶解。经物理和生物处理的目的是使多糖多肽等活性物质释放出来，有利于益生 菌利用，促进益生菌生长繁殖及活性提高。其中，大型真菌菌丝培养的液体菌质经打浆、高 压均浆、复合酶（纤维素酶〇. 5?1. 5%，果胶酶1.0%?3. 0%，蛋白酶1. 5-3. 0% )酶解、 高温^0-9(TC )超声波浸提，提取多糖多肽等活性物质；大型真菌菌丝培养的固体菌质经 干燥、粉碎、超微粉碎，破坏菌丝使多糖多肽等活性物质得以释放。
[0016] 步骤⑵中所述的碳源和氮源优选为豆柏、面粉、麦麸、玉米浆、玉米粉、动物蛋 白、植物蛋白、葡萄糖等农副产品的一种或多种；固体发酵碳源和氮源的添加量与真菌菌质 的干质量比优选为1:1-5 ;液体发酵按真菌菌液容积百分比添加2-5%的碳源和氮源。
[0017] 步骤（3)中所述的益生菌是国家批准允许在保健食品、饲料添加剂中可 使用的有益微生物菌种，包括（但不限于）双岐杆菌属（Bifidobacterium)、乳杆菌 属（Lactobacillus)、链球菌属（Streptococcus)、肠球菌属（Enterococcus)、片球菌 属（Pediococcus)、明串珠菌属（Leuconostoc)、芽抱杆菌属（Bacillus)、乳球菌属 (Lactococcus)、丙酸杆菌属（Propionibacterium)、拟（类）杆菌属（Bacteroides)、酵 母菌属（Saccharomyces)、假丝酵母（Candida)、假单胞菌（Rhodopseudmonas)、梭菌属 (Clostridium)等属的有关菌种。其中，在保健食品中可使用的益生菌种包括：两岐双岐 杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、婴儿双岐杆菌（B.infantis)、长双岐杆菌（B.longum)、短 双岐杆菌（B. breve)、青春双岐杆菌（B.adolescentis)、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus. Bulgaricus)、嗜酸乳杆菌（L. acidophilus)、干酪乳杆菌干酪亚种（L. Caseisubsp. Casei)、 嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus)、布拉酵母菌（SaccharomvcesBoulardii) 等；在饲料添加剂中可使用的益生菌种包括：地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis)、 枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)、纳豆芽抱杆菌（Bacillusnatto)、錯样 芽抱杆菌（Bacilluscereus)、两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、奠肠 球菌（Straptoccusfaecium)、屎肠球菌（Enterococcuslactis)、乳酸肠球菌 (Lactobacillusacidophilus)、嗜酸性乳杆菌（Lactobacillusacidophilus)、干 酿乳杆菌（Lactobacilluscasei)、乳酸乳杆菌（Lactobacilluslactis)、植物乳杆 菌（Lactobacillusplantarum)、乳酸片球菌（Pediococcus acidilacticii)、戊糖 片球菌（Pediococcuspentosaceus)、产 I元假丝酵母（Candidautilis)、酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris)、保加利亚 乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus)、丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum)等。
[0018] 步骤（3)中的益生菌可单一使用或多种联合使用；联合使用时，先接种需氧菌需 氧条件下培养（30_38°C )12-24h，后接种厌氧菌厌氧条件下培养（30-38°C )12-24h。
[0019] 本发明的生产工艺为二次处理三步发酵工艺。第一次配制培养基并进行大型真菌 菌丝接种发酵，为第一次处理第一次发酵；其菌质/菌液加工配制益生菌培养基，对复合益 生菌菌种中的耗氧益生菌和厌氧益生菌分先后二步接种发酵，即第二次处理和第二、三步 发酵。通过该生产工艺培养的益生菌制剂比常规益生菌制剂活性更强，应用效果更好，多菌 复合发酵的比单一菌种效果好。本发明发现了大型真菌发酵的菌液（质）中的多糖多肽等 功能物质可为益生菌的促进因子（益生元），促进益生菌的生长繁殖，增强在肠道内的定植 能力和抗病（病菌）能力。
[0020] 一种高效益生菌制剂通过上述方法制备得到。本发明制备的益生菌制剂，生物活 性（益生菌、生物酶、活性多糖、多肽、核苷、三萜等）高，药理效应（提高免疫、疾病预防与 治疗等）强，生产的保健食品益生菌制剂可作为人肠道保健品；生产饲料级微生物添加剂 菌种制剂可用于动物肠道疾病的预防与治疗及动物保健促生长剂。
[0021] 本发明的优点和积极效果：
[0022] (1)本发明将大型真菌发酵制剂与益生菌制剂有机地结合，及药（食）真菌的药用 菌质/菌液，作为益生菌的培养物与促进剂，大大提高制剂的生物活性与保健治疗效果。
[0023] (2)药/食用真菌菌质/菌液中含有大量多糖多肽物质，试验证明对益生菌的生长 繁殖与定植有促进作用，成为新的益生元；为开发新的益生元提供广阔的来源。
[0024] (3)本发明采用培养基二次处理三步发酵（用豆柏、玉米浆或粉、麦麸、面粉等农 副产品制备大型真菌培养基，并接种大型真菌发酵，生产菌质或菌液；用大型真菌菌质或菌 液配制益生菌培养基，先后二次接种好氧性益生菌和厌氧性益生菌分二步发酵），制备高活 性复合微生态制剂，工艺简便，效果好。
[0025] (4)本发明开发的高效益生菌制剂（合生元）可用于医疗保健、食品与饲料添加 齐U、及兽药制剂，保健与治疗效果好，且生产原料来源广泛，生产工艺简便，具有广泛的开发 应用前景。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。应理解，下面的实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本 领域技术人员所熟知的常规手段。
[0027] 本发明中，采用培养基二次处理三步发酵，制备高活性复合微生态制剂，可用于医 疗保健、食品与饲料添加剂及兽药制剂，保健与治疗效果好。
[0028] 实施例1不同种大型真菌菌丝发酵菌质/菌液活性成分比较
[0029] 1、材料
[0030] 大型真菌菌种：茶薪菇、羊肚菌、滑子菇、猴头菇、牛肝菌、白灵菇、香菇、平菇、黄金 菇、灵芝、云芝、虫草菌、茯苓、竹荪、松乳菇等斜面菌种由湖南民康生物技术研究所保存。
[0031] 液体培养基：玉米楽I. 5g，硝酸铵0. 15g，羧甲基纤维素钠0. 4g，葡萄糖I. 5g， K2HPO4O. 02g、MgSO4 ? 7H200. 05g、蒸馏水定容至 lOOmL，pH6. 5。
[0032] 固体培养基：固体基质（麸皮40 %、玉米皮30 %、豆柏10 %、膨化玉米10%、 油糠 10%)，营养液（玉米浆 0? 5%，葡萄糖 1 %，（NH4)2NO3O. 3 %、K2HPO4O. 05 %、 MgSO4* 7H200. 1%，余量为水，pH6.0-6.5)为固体基质质量的55%，121°C灭菌20min。
[0033] 2、方法
[0034] 将上述各大型真菌按容积（液体）或质量（固体）的10-15%分别接种到液体培 养基和固体培养基中，于26-32°C发酵培养，液体发酵培养2-3天，固体发酵培养3-5天，取 菌液和菌质，测定多糖与多肽含量。
[0035] (1)多糖测定方法：多糖含量=总糖含量-还原糖含量；
[0036] 总糖含量测定：采用硫酸-苯酚法；
[0037] 还原糖含量测定：采用3, 5-二硝基水盐酸（DNS)比色法。
[0038] (2)多肽测定方法=Folin-酚试剂法。
[0039] 3、结果
[0040] 表1不同大型真菌发酵菌质/菌液中多糖多肽含量的测定 [0041]
【权利要求】
1. 一种用大型真菌菌液或菌质制备高效益生菌制剂的方法，其特征在于包括如下步 骤： (1) 用农副产品制备液体或固体培养基培养大型真菌得到菌液或菌质； (2) 将步骤（1)得到的菌液或菌质经物理和生物处理后，加入氮源和碳源配制成益生 菌培养基； (3) 将益生菌接种到步骤（2)配制的益生菌培养基培养得到高效益生菌制剂。
2. 根据权利要求1所述的用大型真菌菌液或菌质制备高效益生菌制剂的方法，其特征 在于：步骤（1)中所述的大型真菌包括：茶薪菇、羊肚菌、滑子菇、猴头菇、牛肝菌、白灵菇、 香菇、平菇、黄金菇、灵芝、云芝、虫草菌、茯苓、竹荪、松乳菇、竹黄、樟芝。
3. 根据权利要求1所述的用大型真菌菌液或菌质制备高效益生菌制剂的方法，其特征 在于：步骤（1)为：以玉米浆、玉米皮、玉米粉、大米粉、面粉、麦麸、土豆、葡萄糖和CMC中的 一种或多种为碳源，以豆柏、动物蛋白、植物蛋白和硫铵中的一种或多种为氮源，以酵母浸 膏、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、磷酸氢二钾、VB1、VB6和烟酸中的一种或多种为生长促进因子， 配制成液体培养基或固体培养基，灭菌后，接种大型真菌菌丝，25-32°C培养2-5天。
4. 根据权利要求1所述的用大型真菌菌液或菌质制备高效益生菌制剂的方法，其特征 在于：步骤（2)中的物理和生物处理为：大型真菌菌丝培养的液体菌质经打浆，高压均浆， 纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组成的复合酶酶解，50-90°C超声波浸提；大型真菌菌丝培养的 固体菌质经干燥、粉碎、超微粉碎。
5. 根据权利要求1所述的用大型真菌菌液或菌质制备高效益生菌制剂的方法，其特 征在于：步骤（2)中所述的碳源和氮源为豆柏、面粉、麦麸、玉米浆、玉米粉、动物蛋白、植 物蛋白和葡萄糖中的一种或多种；固体发酵碳源和氮源的添加量与真菌菌质的干质量比为 1:1-5，液体发酵按真菌菌液容积百分比添加2-5 %的碳源和氮源。
6. 根据权利要求1所述的用大型真菌菌液或菌质制备高效益生菌制剂的方法，其特征 在于：步骤（3)中所述的益生菌是国家批准允许在保健食品、饲料添加剂中可使用的有益 微生物菌种，包括双岐杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属、芽孢 杆菌属、乳球菌属、丙酸杆菌属、拟（类）杆菌属、梭菌属、酵母菌属、假丝酵母、假单胞菌的 有关菌种。
7. 根据权利要求6所述的用大型真菌菌液或菌质制备高效益生菌制剂的方法，其特征 在于：在保健食品中可使用的益生菌种包括：两岐双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、长双岐杆菌、 短双岐杆菌、青春双岐杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球 菌、布拉酵母菌；在饲料添加剂中可使用的益生菌种包括：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、 纳豆芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸性乳 杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒 酵母、沼泽红假单胞菌、保加利亚乳杆菌、丁酸梭菌。
8. 根据权利要求1所述的用大型真菌菌液或菌质制备高效益生菌制剂的方法，其特征 在于：步骤（3)中的益生菌可单一使用或多种联合使用；联合使用时，先接种需氧菌需氧条 件下培养12_24h，后接种厌氧菌厌氧条件下培养12-24h。
9. 一种高效益生菌制剂，其特征在于：通过权利要求1-9任一项所述的方法制备得到。
10. 权利要求9所述的高效益生菌制剂在制备人或畜胃肠道疾病的治疗药物/保健食 品或者饲料添加剂中的应用。
【文档编号】C12R1/225GK104293716SQ201410526171
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月8日 优先权日:2014年10月8日
【发明者】肖兵南, 高中文, 刘莹莹 申请人:湖南民康生物技术研究所